咪達(dá)唑侖與丙泊酚對(duì)局灶缺血再灌注大鼠腦水腫影響的對(duì)照研究

徐進(jìn)步，施青山△，許鵬程，王 露,馬艷艷，汪允珍

(1.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 222000；2.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004)

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·論 著·

咪達(dá)唑侖與丙泊酚對(duì)局灶缺血再灌注大鼠腦水腫影響的對(duì)照研究

徐進(jìn)步1，施青山1△，許鵬程2，王 露2,馬艷艷1，汪允珍1

(1.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 222000；2.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004)

目的 對(duì)比咪達(dá)唑侖與丙泊酚對(duì)腦局灶缺血再灌注后腦水腫狀態(tài)的影響。方法 雄性SD大鼠72只隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、丙泊酚處理組、咪達(dá)唑侖處理組。采用大腦中動(dòng)脈線栓法建立局灶性腦缺血模型，缺血2 h再灌注72 h行神經(jīng)功能缺損評(píng)分、斷頭取腦行腦梗死體積和腦含水量測(cè)量以及腦組織水通道蛋白4(AQP4)表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果 與缺血再灌注組相比，咪達(dá)唑侖與丙泊酚均能明顯降低腦梗死體積，減輕腦水腫，降低AQP4的表達(dá)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 咪達(dá)唑侖具有與丙泊酚同等地減輕腦局灶缺血再灌注后水腫的作用，適合作為該類疾病狀態(tài)下的鎮(zhèn)靜藥。

咪達(dá)唑侖； 丙泊酚； 缺血再灌注損傷； 腦水腫； 水通道蛋白

丙泊酚與咪達(dá)唑侖是公認(rèn)對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用的兩種鎮(zhèn)靜藥。目前對(duì)于兩種藥物腦保護(hù)效應(yīng)的對(duì)比主要著眼于運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、神經(jīng)元凋亡、腦梗死面積以及神經(jīng)元的電鏡下形態(tài)等方面[1-3]。關(guān)于兩種藥物哪種更有利于腦缺血再灌注后腦水腫的控制與治療目前尚缺乏較深入的研究。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以在離體星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧模型中通過(guò)蛋白激酶C途徑下調(diào)水通道蛋白4(AQP4)的表達(dá)[4]，提示丙泊酚可以抑制腦缺血再灌注后的腦水腫。然而，咪達(dá)唑侖是否具有該功能目前尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)比在大鼠腦局灶腦缺血再灌注后應(yīng)用丙泊酚與咪達(dá)唑侖對(duì)腦水腫的影響，探討兩種藥物哪種更適用于腦缺血-再灌注患者的鎮(zhèn)靜，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠72只(體質(zhì)量250～280 g，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于20 ℃室溫、安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前禁食6 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)分為四組(腦缺血再灌注組、假手術(shù)組、丙泊酚處理組、咪達(dá)唑侖處理組)，每組動(dòng)物6只。腦缺血再灌注組采用MCAO模型，栓塞大腦中動(dòng)脈2 h后恢復(fù)灌注；假手術(shù)組僅行分離手術(shù)，不栓塞大腦中動(dòng)脈(上述兩組手術(shù)方法見(jiàn)下條說(shuō)明)；丙泊酚處理組于恢復(fù)再灌注后選擇行為學(xué)評(píng)分1分及以上者給予丙泊酚腹腔注射100 mg/kg，2次/天，共3次。咪達(dá)唑侖處理組：恢復(fù)再灌注后選擇行為學(xué)評(píng)分1分及以上者給予咪達(dá)唑侖10 mg/kg腹腔注射，2次/天，共3次。

1.3 材料與試劑 MCAO栓線購(gòu)自北京沙東生物技術(shù)有限公司。免疫印跡用試劑盒采用碧云天生物技術(shù)公司。AQP4二抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology Incorporation。

1.4 MCAO模型的制備 參照Longa等[5]的線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻閉模型動(dòng)物飼養(yǎng)及手術(shù)室溫控制于25 ℃左右，術(shù)前12 h禁食不禁水，將大鼠以10%水合氯醛35 kg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，取頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈近心端，于頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端備線，在頸總動(dòng)脈近分叉處剪一約0.2 mm的V形切口，將直徑為0.26 mm的頭端包被多聚賴氨酸的尼龍線經(jīng)該切口順頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈(18±1)mm，感到有輕微阻力時(shí)停止，使大腦中動(dòng)脈起始部阻塞，扎緊備線并固定栓線，縫合皮膚切口2 h后，將栓線撥出約10 mm 恢復(fù)再灌注。麻醉清醒后觀察出現(xiàn)右側(cè)Horner綜合征，左側(cè)前肢為主的活動(dòng)障礙判為手術(shù)成功。再灌注72 h后進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分和取材行下一步實(shí)驗(yàn)，假手術(shù)組條件同上，置線栓深度為10 mm，麻醉清醒后觀察無(wú)右側(cè)Horner綜合征，左側(cè)前肢為主的活動(dòng)障礙為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 行為學(xué)評(píng)分 每組動(dòng)物均于處死前進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Longa 5分制法[5](0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失)。分值越高，說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

1.6 腦梗死灶體積測(cè)定[6]隨機(jī)取各組6只動(dòng)物過(guò)量麻醉后斷頭，將腦組織取出后置于-80 ℃冰箱快速凍冷5 min，去除嗅球、小腦及低位腦干后由前向后冠狀切4刀，片厚約2 mm，置于2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 磷酸緩沖液中，37 ℃避光孵育30 min，顯色完全后置10%甲醛溶液固定。因線粒體過(guò)氧化氫酶可氧化TTC 故存活組織呈深紅色，梗死組織不著色呈蒼白色。染色后腦片經(jīng)拍照后進(jìn)行圖像處理,計(jì)算梗死灶(蒼白區(qū))范圍,將每一腦片的梗死面積乘以厚度(2 mm)，再將各腦片數(shù)值相加后得到腦梗死灶體積的近似值,取腦梗死體積占全腦體積的百分比作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

1.7 腦含水量測(cè)定[6]各組隨機(jī)選取6只大鼠，過(guò)量水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦，采用干濕重法于缺血側(cè)及缺血對(duì)側(cè)取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm腦組織約120 mg，包括皮質(zhì)和白質(zhì)，稱取濕重后于85 ℃烤箱中烘烤72 h至恒重后稱取干重按Elliott公式，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8 蛋白印跡(Western Blot)法測(cè)定腦組織的AQP4表達(dá)[6]余下6只動(dòng)物過(guò)量水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦，于冰面上分離切取右側(cè)半球視交叉前2 mm至視交叉后2 mm腦組織 液氮迅速凍冷-70 ℃保存待用。標(biāo)本加入含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液手動(dòng)勻漿后超聲破碎，經(jīng)4 ℃12 000 r/min離心1 h，上清液為胞漿蛋白成分。沉淀再加裂解液，重懸，4 ℃、24 000 r/min離心1 h，重復(fù)兩次，上清液即為實(shí)驗(yàn)所需胞膜蛋白。測(cè)濃度后，蛋白煮沸變性，待用。制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳，待溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部時(shí)結(jié)束電泳，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將NC膜浸入含10%TBST的封閉液中，置于水平搖床上，室溫封閉4 h，將NC膜加入稀釋的AQP4抗體及β-actin抗體中4 ℃過(guò)夜，TBST清洗3次，放入稀釋好的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。NBT-BCIP顯色試劑盒顯色。所得蛋白條帶掃描照片，以Photoshop 軟件進(jìn)行灰度值分析，并按公式(相對(duì)值=各處理組條帶灰度值/假手術(shù)組條帶灰度值)計(jì)算相對(duì)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較 假手術(shù)組行為較正常無(wú)變化，缺血再灌注組評(píng)分為(2.5±0.8)分，丙泊酚處理組為(1.3±0.5)分，咪達(dá)唑侖處理組為(1.3±1.0)分。丙泊酚處理組與咪達(dá)唑侖處理組兩組行為學(xué)評(píng)分與假手術(shù)組、缺血再灌注組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05)，丙泊酚處理組與咪達(dá)唑侖處理組兩組間評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 四組大鼠梗死面積比較 假手術(shù)組無(wú)梗死，缺血再灌注組梗死面積為(24.5±3.2)%,丙泊酚處理組梗死面積為(16.1±2.4)%，咪達(dá)唑侖處理組梗死面積為(18.7±4.2)%，丙泊酚處理組與咪達(dá)唑侖處理組兩組梗死面積較缺血再灌注組明顯降低(P<0.05)，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 四組大鼠腦含水量測(cè)定 丙泊酚與咪達(dá)唑侖均可以明顯改善腦局灶缺血再灌注后腦水腫，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 四組大鼠腦含水量測(cè)定

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05；與缺血組比較,bP<0.05；與對(duì)側(cè)比較,cP<0.05。

2.4 四組大鼠腦AQP4表達(dá)的影響 Western Blot分析結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組AQP4相對(duì)值為2.28±0.28，丙泊酚處理組AQP4相對(duì)值為1.44±0.19，與缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；咪達(dá)唑侖處理組相對(duì)值為1.60±0.20，與缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。丙泊酚處理組與咪達(dá)唑侖處理組兩組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，缺血再灌注損傷過(guò)程中因?yàn)槟X水腫導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高造成腦疝是缺血性腦卒中患者死亡的重要原因，控制腦水腫也是該類患者早期臨床治療的方向。

腦水腫主要分為血管源性腦水腫與細(xì)胞毒性腦水腫。血管源性腦水腫是指由于血腦屏障損害導(dǎo)致其通透性增加造成的腦水腫，主要發(fā)生于創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥和低氧等情況；而細(xì)胞毒性腦水腫發(fā)生在血腦屏障完整的情況下，主要是由于腦細(xì)胞膜上鈉鉀泵的功能障礙，引發(fā)大量水分子進(jìn)入腦細(xì)胞從而導(dǎo)致的腦水腫，主要發(fā)生于中毒、創(chuàng)傷、低氧等情況。在腦局灶缺血后主要發(fā)生的是細(xì)胞毒性腦水腫[8]。

反映腦水腫的指標(biāo)除直接測(cè)定腦含水量外，還可以由通過(guò)AQP的表達(dá)變化來(lái)監(jiān)測(cè)，其中AQP4是哺乳動(dòng)物腦中調(diào)節(jié)水平衡的最主要的分子。AQP4可以在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)與細(xì)胞內(nèi)分布調(diào)節(jié)來(lái)改變自身對(duì)水分子的通透性，也可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)上調(diào)AQP4的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)水分子的進(jìn)出。在細(xì)胞毒性腦水腫，AQP4通過(guò)表達(dá)上調(diào)造成細(xì)胞膜對(duì)水分子的通透性增加[9]。因此考察以細(xì)胞毒性腦水腫為主要特征的腦局灶缺血再灌注損傷時(shí)主要觀察腦內(nèi)AQP4表達(dá)的變化。既往研究顯示在腦局灶缺血1 h后使用丙泊酚后處理可以明顯減輕腦水腫，抑制AQP4的表達(dá)。其機(jī)制可能與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)受抑制有關(guān)[10]。還有研究認(rèn)為丙泊酚對(duì)細(xì)胞毒性腦水腫的緩解作用主要是在鋅離子幫助下專屬性抑制AQP4的結(jié)果[11]。

目前，對(duì)于咪達(dá)唑侖減輕腦水腫的效果尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究。本研究通過(guò)與丙泊酚對(duì)照觀察咪達(dá)唑侖對(duì)局灶腦缺血再灌注后腦水腫的影響，發(fā)現(xiàn)咪達(dá)唑侖與丙泊酚減輕腦水腫的作用無(wú)明顯差別，提示咪達(dá)唑侖同樣能夠抑制缺血再灌注后腦水腫，且這種作用也是通過(guò)AQP4的表達(dá)下調(diào)實(shí)現(xiàn)的。咪達(dá)唑侖腦保護(hù)的機(jī)制認(rèn)為一方面它通過(guò)作用于GABAA受體減輕谷氨酸堆積所致的神經(jīng)中毒；另一方面它還能通過(guò)降低腦代謝率來(lái)改善腦的氧供需失衡[3]。而咪達(dá)唑侖通過(guò)什么途徑調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)尚不清楚，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Comparative study on influences of midazolam and propofol on rat brain edema induced by ischemia/reperfusion injury*

XUJin-bu1,SHIQing-shan1△,XUPeng-cheng2,WANGLu2,MAYan-yan1,WANGYun-zhen1

(1.DepartmentofIntensiveCareMedicine,LianyungangMunicipalSecondPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222000,China;2.KeyLaboratoryAnesthesiologyofJiangsuProvince,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221004,China)

Objective To compare the influences of midazolam and propofol on brain edema induced by ischemia/reperfusion(I/R) injury.Methods 72 male Sprague-Dawley(SD) rats were randomized into four groups:sham operation group undergoing sham operation;ischemia/reperfusion group undergoing the thread embolism of the left middle cerebral artery occlusion(MCAO) for 2 h and then removement of thread;propofol treatment group,which accepted propofol treatment on the basis of ischemia/ reperfusion for 72 h;midazolam treatment group,which accepted midazolam treatment on the basis of ischemia/ reperfusion for 72 h.After 72 h of reperfusion the rats were assessed and assigned the neurological deficit scores,then decapitated to evaluate the cerebral infarction volumes,brain water contents and the expression of AQP4.Results In the comparison with the I/R group,both the midazolam treatment group and the propofol treatment group could improve the neurological score,ameliorate brain edema,and down-regulate the expression of AQP4,the differences had no statistical significance(P>0.05).Conclusion Midazolam is equally potent as propofol in ameliorating brain edema induced by I/R injury,and is a suitable sedative for such condition.

midazolam； propofol； ischemia/reperfusion injury； brain edema； aquaporin

蚌埠醫(yī)學(xué)院科研課題計(jì)劃(byky13123)。

徐進(jìn)步，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)專業(yè)?！?/p>

，E-mail:sqs003@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.007

A

1672-9455(2015)13-1834-03

2015-01-20

2015-02-25)