3種細(xì)胞因子在膀胱尿路上皮癌的表達(dá)及其臨床意義*

張宗顯，王沈陽，劉 翠，郭永順，高同斌，王穎慧

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室，山東濰坊261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 261000；3.山東省泗水縣柘溝中心衛(wèi)生院 273200)

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·論 著·

3種細(xì)胞因子在膀胱尿路上皮癌的表達(dá)及其臨床意義*

張宗顯1，王沈陽2△，劉 翠3，郭永順2，高同斌2，王穎慧2

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室，山東濰坊261053；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 261000；3.山東省泗水縣柘溝中心衛(wèi)生院 273200)

目的 探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、CD74、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)80例膀胱尿路上皮癌患者癌組織和15例膀胱正常組織中MIF、CD74和VEGF的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 MIF、CD74和VEGF在膀胱尿路上皮癌組織中高表達(dá)，在正常膀胱黏膜組織中無或弱表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)MIF、CD74和VEGF的表達(dá)與組織學(xué)分類、病理分級(jí)、臨床分期均呈正相關(guān)(P<0.05 )。而且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MIF與CD74在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.839，P<0.05)，且MIF與VEGF在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)亦呈正相關(guān)(r=0.753，P<0.05)。結(jié)論 MIF可能通過與CD74相互作用，上調(diào)VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤微血管生成，促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展,使其有望成為膀胱尿路上皮癌治療的有效靶分子。

膀胱腫瘤； 尿路上皮癌； 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子； CD74； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

膀胱尿路上皮癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤且易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。雖然有關(guān)該病的診斷治療近年取得了較大進(jìn)展，但其具體發(fā)生機(jī)制目前并未完全明確。前期研究表明，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)是細(xì)胞因子的異常表達(dá)[1]，因此進(jìn)一步研究膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)基因，對(duì)確定特異性腫瘤標(biāo)志物、早期診斷、了解預(yù)后因素、確定生物治療靶標(biāo)有重要意義。為了探討巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、CD74、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)與膀胱尿路上皮癌的關(guān)系及臨床意義，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MIF、CD74 和VEGF蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 80份標(biāo)本均取自濰坊市人民醫(yī)院泌尿外科2012年10月至2014年4月行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的膀胱尿路上皮癌組織。80份膀胱尿路上皮癌組織按世界衛(wèi)生組織病理(1998)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)23例，Ⅱ級(jí)27例，Ⅲ級(jí)30例。其中男56例，女24例，所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療，所取標(biāo)本患者年齡29～89歲，平均64歲。15份作對(duì)比的膀胱正常組織為前列腺TURP手術(shù)中所取。

1.2 材料 MIF(FL-115)兔抗人多克隆抗體、鼠抗人CD74單克隆抗體及DAB顯色液購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)有限公司。VEGF(NAB-O243)鼠抗人單克隆抗體、S-P試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 10%甲醛固定組織，常規(guī)石蠟包埋組織，連續(xù)切片4 μm厚，每例各備4張，分別作HE染色和免疫組化染色，采用SP免疫組織化學(xué)三步法，具體操作按說明書進(jìn)行，試劑盒內(nèi)已知陽性片作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組織化學(xué)染色定量和定性分析應(yīng)用尼康高級(jí)研究型顯微鏡(Nikon80i，Japan)盲法進(jìn)行。在高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，分別由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法根據(jù)切片中細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，染色結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度作為判斷依據(jù)，獨(dú)立觀察后一起作出判斷。標(biāo)本無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)少于 25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性細(xì)胞百分比例評(píng)分兩項(xiàng)指標(biāo)相乘大于或等于4分為陽性表達(dá)，小于4分為陰性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有資料采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行組間比較分析。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MIF、CD74、VEGF的蛋白表達(dá)與組織學(xué)分類、病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系 在膀胱尿路上皮癌組織中MIF、CD74、VEGF三者的陽性表達(dá)明顯高于膀胱正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。并且在膀胱尿路上皮癌組織中三者的蛋白表達(dá)與病理分級(jí)、組織學(xué)分類、臨床分期有關(guān)，表明MIF、CD74、VEGF在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)隨著腫瘤的惡性程度增高而增強(qiáng)(圖1及圖2)，在浸潤(rùn)型腫瘤中表達(dá)明顯高于非浸潤(rùn)型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

圖1 高分化膀胱尿路上皮癌組織中MIF

臨床特征nMIFCD74VEGF組織學(xué)分類正?；颊?51(6.67)2(13.33)2(13.33)腫瘤患者8064(80.00)66(82.50)68(85.00)病理分級(jí)高分化5036(72.00)37(74.00)38(76.00)

續(xù)表1 膀胱尿路上皮癌組織中MIF、CD74、VEGF 蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

注：低分化(Ⅲ期)，高分化(Ⅰ期+Ⅱ期)；浸潤(rùn)型(Ⅱ期+Ⅲ期+Ⅳ期)，非浸潤(rùn)型(Tis期+Ⅰ期 )。

圖2 低分化膀胱尿路上皮癌組織中

2.2 MIF、CD74、VEGF蛋白在膀胱尿路上皮癌中表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman非參數(shù)相關(guān)檢驗(yàn)，結(jié)果MIF與CD74在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.839，P<0.05)；MIF與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.753，P<0.05)。見表2、3。

表2 80例膀胱尿路上皮癌組織切片免疫組化中 MIF和CD74表達(dá)相關(guān)性

注：+表示陽性，-表示陰性。

表3 80例膀胱尿路上皮癌組織切片免疫組化中 MIF和VEGF表達(dá)相關(guān)性

注：+表示陽性，-表示陰性。

3 討 論

MIF 是1966年Bloom等[2]首次發(fā)現(xiàn)由活化T淋巴細(xì)胞分泌的可抑制單核巨噬細(xì)胞移動(dòng)的細(xì)胞因子。MIF在惡性腫瘤中的作用越來越受到人們重視。研究報(bào)道MIF在肝癌、 肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌及食管癌等腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，提示MIF參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[3-7]。CD74存在于某些上皮細(xì)胞表面，是MIF的高親和力受體，有研究發(fā)現(xiàn)MIF與CD74在癌組織中共表達(dá)，兩者結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞的增殖并可調(diào)節(jié)促血管新生的趨化因子分泌，而VEGF是目前活性和專屬性最強(qiáng)的血管生成因子,在正常組織和腫瘤組織中都發(fā)揮著強(qiáng)大的促血管生成作用。血管生成是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵之一,并且VEGF幾乎都參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[8]。在膀胱尿路上皮癌中MIF可能通過作用于其細(xì)胞表面受體CD74，使其分泌VEGF，為腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移奠定營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，在膀胱尿路上皮癌組織中MIF、CD74、VEGF蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)，與膀胱正常組織相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明MIF、CD74、VEGF可能在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。MIF在膀胱尿路上皮癌低分化腫瘤中表達(dá)明顯高于高分化腫瘤，其表達(dá)量與膀胱尿路上皮癌惡性度呈正相關(guān)，說明其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。雖然MIF促進(jìn)膀胱尿路上皮癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制仍不完全清楚，但推測(cè)可能與其受體CD74結(jié)合形成復(fù)合物有關(guān)[9]。作為組織相容性抗原重要分子伴侶CD74，不僅在抗原遞呈細(xì)胞表達(dá)[10]，還在上皮細(xì)胞如膀胱上皮細(xì)胞中高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。一般認(rèn)為CD74 作為MIF 的受體，二者的結(jié)合能夠激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，刺激細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果也提示MIF和CD74在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示與CD74分子結(jié)合可能是MIF在膀胱尿路上皮癌中發(fā)揮作用所必需的一個(gè)步驟，從而使腫瘤細(xì)胞無限制地增長(zhǎng)、增殖。

腫瘤細(xì)胞可自分泌或旁分泌VEGF，促進(jìn)血管的構(gòu)建，為腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)，從而促使癌細(xì)胞迅速增長(zhǎng)[11-12]。VEGF具有較強(qiáng)的血管滲透作用，可引起血漿蛋白及纖維蛋白外滲，隨著血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，最終形成新的基質(zhì)和血管。本研究結(jié)果表明MIF和 VEGF在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織，且呈正相關(guān)關(guān)系，提示MIF可能通過上調(diào)VEGF表達(dá)，刺激腫瘤新生血管形成，為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供了豐富的血液，從而促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

本研究表明MIF、CD74、VEGF三者在膀胱尿路上皮癌組織中表達(dá)增高，且呈正相關(guān)協(xié)同一致性，MIF可能通過上調(diào)CD74及VEGF的表達(dá)促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的進(jìn)展，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。深入探究這些基因可為膀胱尿路上皮癌的診斷、治療方案的選擇及預(yù)后判斷提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The expression and clinical significance of cytokines in urothelial cell carcinoma of bladder*

ZHANGZong-xian1，WANGShen-yang2△，LIUCui3，GUOYong-shun2,GAOTong-bin2,WANGYing-hui2

(1.Teaching-researchOfficeofSurgery,WeifangMedicalUniversity，Weifang,Shandong261053，China；2.People′sHospitalofWeifang,Weifang,Shandong261000，China；3.ZhegouTownHospitalofSishuiCounty,Weifang,Shandong273200，China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of macrophage migration inhibitory factor (MIF),CD74 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the urothelial cell carcinoma of bladder.Methods The expressions of MIF,CD74 and VEGF in 80 samples of urothelial cell carcinoma bladder tissues and 15 samples of normal bladder tissues were detected by immunohistochemistry method,and the relationships between these indicators with clinicopathological features and prognosis were analyzed.Results The expressions of MIF,CD74 and VEGF in the bladder urothelial cell carcinoma tissues elevated significantly compared with those of the normal bladder tissues,the differences were significant (P<0.05).The expressions of MIF,CD74 and VEGF in the tumor cell plasma were positively related with the histological classification,pathological grade and clinical stages (P<0.05).The correlation analysis showed that the expression of MIF was positively related with CD74 and VEGF in the bladder urothelial cell carcinoma tissues (r=0.839;r=0.753,P<0.05).Conclusion MIF might interact with CD74 to upregulate the expression of VEGF,promote the angiogenesis and involved in the tumor development and progression,MIF might be an effective molecular target in the treatment of urothelial cell carcinoma of the urinary bladder.

urothelial cell carcinoma； bladder neoplasms； macrophage migration inhibitory factor； CD74； vascular endothelial growth factor

山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(第20121159號(hào))。

張宗顯，男，在讀研究生，主要從事泌尿外科的臨床研究。△

,E-mail：1035187938@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.010

A

1672-9455(2015)04-0457-03

2014-07-29

2014-10-28)