5種蛋白在腸道腺癌中的表達(dá)及臨床意義*

唐大峻,文立新,秦胡蘭

(重慶市石柱土家族自治縣人民醫(yī)院:1.病理科；2.普外科 409100)

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·論 著·

5種蛋白在腸道腺癌中的表達(dá)及臨床意義*

唐大峻1,文立新2△,秦胡蘭1

(重慶市石柱土家族自治縣人民醫(yī)院:1.病理科；2.普外科 409100)

目的 探討腸道腺癌中肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、P-糖蛋白(P-gp/P170)、拓?fù)湟讟?gòu)酶(ToPoⅡ)、胸腺嘧啶合成酶(Ts)及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)-π的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測(cè)96例原發(fā)性腸道腺癌及15例正常腸黏膜中Ts、P170、ToPoⅡ、LRP、GST-π的表達(dá)情況，并綜合分析其與各臨床參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 LRP、P170、ToPoⅡ、Ts在腸道腺癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)；5種蛋白在癌組織中的表達(dá)水平與年齡、性別無(wú)關(guān)，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，LRP、P170在低分化腺癌組織中的表達(dá)明顯高于高中分化腺癌，而Ts的表達(dá)明顯低于高中分化腺癌；浸潤(rùn)肌層及以內(nèi)的腺癌表達(dá)ToPoⅡ明顯高于浸潤(rùn)至漿膜者；LRP、P170、Ts陽(yáng)性表達(dá)患者的5年存活率低于陰性表達(dá)者。結(jié)論 Ts、P170、ToPoⅡ、LRP、GST-π 5種耐藥蛋白與腸道腺癌分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及5年存活率均有不同程度的相關(guān)性，這在制訂腸道腺癌的個(gè)性化化療方案以及患者預(yù)后評(píng)估上具有重要的臨床意義。

腸道腺癌； 多藥耐藥； 免疫組織化學(xué)

聯(lián)合化療是中晚期腸道癌的綜合性治療手段之一，而腫瘤對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥是導(dǎo)致化療失敗的重要原因之一。而肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、P-糖蛋白(P-gp/P170)、拓?fù)湟讟?gòu)酶(ToPoⅡ)、胸腺嘧啶合成酶(Ts)及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)-π在腸道腺癌的耐藥機(jī)制中起到重要作用。因此，本文主要采用免疫組化檢測(cè)腸道腺癌中這5種蛋白的表達(dá)情況，分析其與腸道腺癌臨床病理特征的關(guān)系以及對(duì)預(yù)后的影響，探討腸道耐藥機(jī)制，從而為臨床制訂個(gè)體化化療方案和預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2006年1月至2013年12月原發(fā)性腸道腺癌96例，其中男61例，女35例；年齡37～78歲，平均61歲，≤55歲39例，>55歲57例；高中分化癌69例，低分化癌27例；浸潤(rùn)肌層及以內(nèi)54例，浸潤(rùn)漿膜層42例；有41例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，55例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另取15例正常腸黏膜作為對(duì)照組。所有標(biāo)本經(jīng)中性甲醛液固定后，石蠟包埋，4 μm切片，行免疫組織化學(xué)染色。此外，對(duì)2006年1月至2008年12月具有完整隨訪資料的有27例病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)判斷方法 LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π的一抗均購(gòu)自福州邁新公司，二抗及顯色液購(gòu)自北京中山生物技術(shù)公司。免疫組化染色具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ToPoⅡ陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞核，Ts、GST-π定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核，LRP、ToPoⅡ、定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色均為棕黃色。光鏡下計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞少于10%為陰性，大于或等于 10%為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分率表示，比較用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π在腸道腺癌中的表達(dá)情況 在96例腸道腺癌中，陽(yáng)性表達(dá)：48例LRP，55例P170，63例ToPoⅡ，34例Ts，69例GST-π，陽(yáng)性率分別為50.0%、57.3%、65.6%、35.4%、71.9%。在15例正常腸黏膜中，陽(yáng)性表達(dá)：3例LRP，1例P170，4例ToPoⅡ，1例Ts，7例GST-π，陽(yáng)性率分別為20.0%、7.0%、26.7%、7.0%、46.7%。LRP、P170、ToPoⅡ和Ts 4種蛋白在癌組織和正常黏膜中的陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而GST-π差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5種蛋白在癌組織中的表達(dá)水平與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)。LRP、P170在低分化腺癌組織中的表達(dá)明顯高于高中分化腺癌，而Ts的表達(dá)明顯低于高中分化腺癌。浸潤(rùn)肌層及以內(nèi)的腺癌表達(dá)ToPoⅡ明顯高于浸潤(rùn)至漿膜者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，5種蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 5種蛋白正常腸黏膜和腸道腺癌中的表達(dá)與各臨床參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表1 5種蛋白正常腸黏膜和腸道腺癌中的表達(dá)與各臨床參數(shù)的關(guān)系

2.2 LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π的表達(dá)與腸道腺癌預(yù)后的關(guān)系 對(duì)2006年1月至2008年12月具有完整隨訪資料的27例病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在術(shù)后5年內(nèi)死亡15例，存活5年以上12例，5年存活率為44.4%。在27例中，LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π陽(yáng)性表達(dá)病例數(shù)分別為11、15、20、9、19例，陽(yáng)性表達(dá)病例中5年存活例數(shù)分別為2、4、7、1、9例；陰性表達(dá)病例數(shù)分別為16、12、7、18、8例，陰性表達(dá)病例中5年存活例數(shù)分別為10、8、5、11、3例。其中LRP、P170、Ts陽(yáng)性和陰性表達(dá)者5年存活率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π與5年存活率的關(guān)系

續(xù)表2 LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π與5年存活率的關(guān)系

3 討 論

LRP是人類的穹隆體主蛋白，在正常組織和腫瘤細(xì)胞中廣泛分布。作為核孔復(fù)合物的轉(zhuǎn)運(yùn)單位，主要定位于核孔復(fù)合物上，其功能是控制多種底物的雙向核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。LRP能阻止烷化劑和順鉑等以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，即使進(jìn)入細(xì)胞核的某些藥物也能通過(guò)LRP被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，通過(guò)胞吐方式排至胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而參與腫瘤耐藥發(fā)生[1]。Berger等[2]發(fā)現(xiàn)LRP的表達(dá)強(qiáng)度與耐藥程度、組織學(xué)類型、細(xì)胞分化程度呈正相關(guān)，而與臨床分期無(wú)關(guān)。P170是由MDR-Ⅰ編碼的相對(duì)分子質(zhì)量為170×103的糖蛋白，定位于胞膜上，其功能為能量依賴性跨膜外排泵，可將胞內(nèi)高濃度的脂溶性化療藥物泵出至細(xì)胞外，使得胞內(nèi)藥物蓄積量降低，從而使細(xì)胞對(duì)藥物耐藥[1]。此外，有研究提示腫瘤患者P170表達(dá)越高，預(yù)后越差，P170不僅參與耐藥機(jī)制，也與惡性生物學(xué)行為有關(guān)[3]。在本研究中，腸道腺癌組織中LRP和P170處于高水平狀態(tài)，并且分化程度越低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其表達(dá)越高，同時(shí)它的高表達(dá)與低的5年存活率具有相關(guān)性。

ToPoⅡ是一種基本的核酶，其主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，起著DNA內(nèi)切酶及連接酶的作用，能夠催化DNA雙鏈拓?fù)湟讟?gòu)體的相互轉(zhuǎn)換，從而改變DNA的拓?fù)湫问?，在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及修復(fù)中起著重要作用。有研究證實(shí)胃癌細(xì)胞在SG2/M期時(shí)ToPoⅡ濃度快速上調(diào),而在有絲分裂后濃度下調(diào)[4]。而ToPoⅡ是多種抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn),其表達(dá)的下調(diào)或性質(zhì)改變會(huì)影響DNA酶易解離復(fù)合物的形成,降低化療藥物的敏感性,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)耐藥表型GST及Pgp 在惡性腫瘤中的表達(dá)及其DNA 的合成,使惡性腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。ToPoⅡ表達(dá)的高低與腫瘤耐藥呈反比，這與其他的耐藥蛋白有明顯區(qū)別[5]。在本研究中，ToPoⅡ在腸道腺癌組織中處于高水平狀態(tài)，淺浸潤(rùn)者和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高表達(dá)，但是，它的表達(dá)與5年生存率無(wú)明顯關(guān)系，這提示ToPoⅡ并不在腸道腺癌的耐藥過(guò)程以及預(yù)后影響中發(fā)揮主要作用。Ts是一個(gè)二聚體蛋白，且是增殖期細(xì)胞內(nèi)必需蛋白，它能使尿嘧啶脫氧核苷酸甲基化后轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶脫氧核苷酸，是DNA合成反應(yīng)中重要的關(guān)鍵酶之一。因此在腫瘤中抑制Ts就能夠抑制DNA的合成，從而使腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)得到抑制，染色體斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。5-氟尿嘧啶(5-Fu)的抗癌機(jī)制之一就是抑制Ts,干擾脫氧胸苷酸合成與DNA復(fù)制。最新的研究證實(shí)，Ts是5-Fu類藥物的靶向酶，其在腫瘤中的表達(dá)情況與5-Fu的療效密切相關(guān)，Ts低表達(dá)的腫瘤組織，5-Fu類藥物療效好，患者總生存期延長(zhǎng)；Ts高表達(dá)的腫瘤組織，則會(huì)對(duì)5-Fu類藥物產(chǎn)生耐藥[6-7]。馮繼鋒等[8]分析了24例直腸癌術(shù)后輔助化療患者后發(fā)現(xiàn)，Ts低表達(dá)患者的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均明顯低于高表達(dá)患者。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ts在腸道腺癌組織中以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高表達(dá)，在高中分化程度的癌組織中表達(dá)水平比低分化組織中低，但是高表達(dá)Ts的患者5年生存率明顯低于陰性表達(dá)者。

GST 是一種Ⅱ相代謝酶,與細(xì)胞解毒功能密切相關(guān)，分為α、μ和π等5種同工酶，且各有GST家族的相應(yīng)基因編碼。某些GST同工酶的表達(dá)，特別是π類，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在多種人類腫瘤和動(dòng)物腫瘤模型中GST-π表達(dá)上調(diào)，是腫瘤細(xì)胞耐藥的標(biāo)志之一[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，GST高表達(dá)對(duì)化療耐藥有重要影響，當(dāng)GST表達(dá)越高,腫瘤細(xì)胞的惡性程度及對(duì)化療藥物的耐受性增高,預(yù)示患者的預(yù)后不良[10]。但在本研究中，腸道腺癌組織中的GST-π表達(dá)并不高，并且與性別，年齡，分化程度，浸潤(rùn)深度以及5年生存率均無(wú)明顯相關(guān)性，以此提示GST-π跟ToPoⅡ一樣，在腸道腺癌的耐藥過(guò)程和預(yù)后中發(fā)揮的作用非常微弱。

腫瘤組織多藥耐藥(MDR)的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，是多種基因共同作用的結(jié)果，目前已發(fā)現(xiàn)的耐藥基因有11種，已明確的機(jī)制有以下4種[11-12]:(1)由MDR1及其產(chǎn)物P-gp介導(dǎo)的藥泵蛋白，即經(jīng)典型MDR;(2)由Topo-Ⅱ介導(dǎo)的DNA修復(fù)酶，非典型MDR;(3)GST-π的表達(dá)導(dǎo)致多功能藥物代謝酶的解毒作用;(4)Ts的表達(dá)?？傊?，通過(guò)對(duì)LRP、P170、ToPoⅡ、Ts、GST-π這5種耐藥蛋白在腸道腺癌中的表達(dá)檢測(cè)，以及與臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系的分析研究發(fā)現(xiàn)，多種耐藥蛋白在腸道腺癌中都處于高水平狀態(tài)，并與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)聯(lián)，同時(shí)，影響著患者的5年生存率，他們的表達(dá)直接影響著腫瘤患者的療效和預(yù)后。因此，在選擇化療藥物時(shí)，應(yīng)根據(jù)耐藥蛋白的表達(dá)情況，制訂合理的個(gè)體化方案，避免耐藥蛋白高表達(dá)導(dǎo)致化療的失敗，提高腸道腺癌患者的有效生存期。同時(shí)，通過(guò)對(duì)耐藥蛋白的測(cè)定，對(duì)化療的療效和患者預(yù)后評(píng)估也將給予極大的幫助。

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Expression and significance of five kinds of protein in intestinal colorectal carcinoma*

TANGDa-jun1,WENLi-xin2△,QINHu-lan1

(1.DepartmentofPathology,2.DepartmentofGeneralSurgery,People′sHospitalofShizhuTujiaAutonomousCounty,Chongqing409100,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of Thymine synthetase(Ts),P-glycoprotein(P170),toposiomerase(ToPoⅡ),lung resistance-related protein(LRP),glu tathione tfan sferase(GST-π) in colorectal carcinoma tissue.Methods The expression of Ts,P170,ToPoⅡ,LRP and GST-π in 96 patients with colorectal carcinoma and 15 healthy persons were detected by immunohistochemical technique,and their relationship with clinical indicators and prognosis of carcinoma were explored.Results LRP,P170,ToPo Ⅱ and Ts in in testinal tissues showed high expression in intestinal adenocarcinoma.The five kinds proteins expression levels in the adenocarcinoma had no relationship with age and gender,but these were higher in the cases with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis.The levels of LRP,P170 in low differentiation adenocarcinoma were significant higher than that in high differentiation adenocarcinoma,while the expression of Ts was significant lower than that in high differentiation adenocarcinoma.The expression of ToPo Ⅱ was significant higher in invasion muscle layer than that of infiltrated serosa.The five years survival rate of patients with positive expression of LRP,P170 were lower than that of the negative expression cases.Conclusion Ts,P170,ToPo Ⅱ,LRP and GST- π have relationships with intestinal adenocarcinoma differentiation degree,invasion depth,lymph node metastasis and the survival rate of five years,these relationships important for personalized chemotherapy scheme and prognostic evaluation.

colorectal carcinoma； multidrug resistance gene； immunohisto -chemistry

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012-2-336)。

唐大峻，男，本科，主治醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤及生殖道腫瘤的臨床病理研究。

△通訊作者,E-mail：1834571481@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.009

A

1672-9455(2015)04-0454-03

2014-04-28

2014-09-06)