新質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnrB24的基因分析*

邵宜波，李 旭，謝琴秀，胡立芬，顧有為

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.感染管理科；2.感染科；3.中心實驗室，合肥 230022)

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·論 著·

新質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因qnrB24的基因分析*

邵宜波1，李 旭2△，謝琴秀2，胡立芬3，顧有為1

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.感染管理科；2.感染科；3.中心實驗室，合肥 230022)

目的 對新的質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥基因(qnrB24)進行相關(guān)研究和分析。方法 對新發(fā)現(xiàn)的qnrB24基因陽性菌株進行轉(zhuǎn)移接合實驗，了解qnrB24對喹諾酮類藥物的耐藥性，堿裂解法提取接合子質(zhì)粒，Southern blot明確質(zhì)粒大小。采用熱不對稱交錯聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)研究基因5′端以及3′端未知側(cè)翼堿基序列。結(jié)果 這個突變基因命名為qnrB24(Genbank登錄號HM192542)。藥敏試驗結(jié)果顯示攜帶qnrB24基因接合子對環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度(MIC)值為0.125 μg/mL，左氧氟沙星MIC值為0.190 μg/mL。接合子對常見氟喹諾酮類抗菌藥物的敏感性較大腸桿菌J53受體菌下降約8～11倍，接合子耐藥水平低于臨床分離菌株。Southern雜交顯示該基因位于約60.0 Kb質(zhì)粒上。熱不對稱交錯PCR結(jié)果顯示,qnrB24基因5′端為假定的轉(zhuǎn)座酶。結(jié)論 qnrB24通過質(zhì)粒介導(dǎo)引起細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性上升，容易發(fā)展成高水平耐藥，因此需要監(jiān)測其在細菌中的流行性。

質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因； 氟喹諾酮耐藥； qnrB24； 功能分析

質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(PMQR)近幾年已成為研究的熱點。最初發(fā)現(xiàn)qnr是一種質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播的喹諾酮類耐藥基因，其編碼蛋白可以解除喹諾酮類藥物對DNA旋轉(zhuǎn)酶的毒性[1]。隨后全球已報道包括qnrA、qnrB，qnrC、qnrD在內(nèi)的多種qnr基因。該類基因的表達不僅可引起喹諾酮類藥物的低水平耐藥，而且可明顯增加其他耐藥機制的作用。因其位于質(zhì)粒上，耐藥基因可以通過質(zhì)粒在不同菌株、甚至不同菌屬間水平傳播，容易引起耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的傳播流行；而且這些基因可以通過質(zhì)粒接合、轉(zhuǎn)座等途徑和位于質(zhì)粒上的其他耐藥基因一起迅速傳播[2-3]，使得菌株呈現(xiàn)多重耐藥，給臨床用藥帶來巨大威脅，從而導(dǎo)致臨床治療困難、醫(yī)院內(nèi)感染增加。本文對臨床上分離的1株弗勞地枸櫞酸桿菌中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因新亞型qnrB24(該基因已經(jīng)在GENBANK注冊，注冊號HM192542)做了Southern雜交、轉(zhuǎn)移接合、并用熱不對稱聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法研究該基因的旁側(cè)序列。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 1株本院臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌(編號09-906546)于2009年7月7日分離自本院普通外科4病區(qū)1例66歲男性患者的中段尿標(biāo)本。

1.2 qnrB 引物：共用2 對qnrB引物,引物序列見表1。

1.3 抗菌藥物E-Test紙條 瑞典AB BIOMERIEUX公司提供左氧氟沙星，環(huán)丙沙星E-Test紙條。

1.4 試劑 大連寶生物公司提供Taq酶、dNTP、10×buffer,DNA marker,上海生物工程有限公司合成PCR引物，MH瓊脂購自英國Oxoid公司，德國QIAGEN質(zhì)粒提取用試劑盒，武漢博士德有限公司提供雜交試劑盒，大連寶生物公司提供熱不對稱交錯PCR試劑盒。

表1 qnrB24引物序列和PCR反應(yīng)參數(shù)

1.5 方法

1.5.1 轉(zhuǎn)移接合試驗 按照文獻[4]的方法對臨床分離產(chǎn)qnrB24基因型菌株進行轉(zhuǎn)移接合實驗。大腸桿菌(E.coli)J53為接合實驗的受體菌。選擇性平板為含氨芐西林(64 μg/mL)和疊氮鈉(100 μg/mL)的MH瓊脂平板,在MH平板上生長的白色小菌落即為接合子,并傳代3次。對接合子進行生化鑒定和PCR。

1.5.2 藥敏試驗方法 用E-Test紙條判斷臨床菌株,接合子及受體菌對喹諾酮類藥物敏感性，采用2010年美國臨床和實驗室標(biāo)準協(xié)會(CLSI)標(biāo)準判斷藥敏結(jié)果。

1.5.3 質(zhì)粒抽提 qnrB24基因型接合子質(zhì)粒的提取按照QIAGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作步驟進行。

1.5.4 Southern雜交操作程序 按武漢博士德有限公司雜交試劑盒說明書進行操作。

1.5.5 熱不對稱交錯PCR 按大連寶生物公司熱不對稱交錯PCR試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 qnrB24基因的檢測 qnrB24基因PCR陽性結(jié)果見圖1。qnrB24基因與qnrB10同源性為98.67%，與qnrB1同源性是96.92%。與qnrB10相比，共6個堿基位點發(fā)生變化，42位T→A,139位C→A，257位C→T，643位C→T，670位A→G，672位T→G。其中139位、257位、670位堿基位點改變導(dǎo)致了氨基酸發(fā)生變化，氨基酸的改變分別為47位亮氨酸→蛋氨酸，86位丙氨酸→纈氨酸，224位異亮氨酸→纈氨酸。qnrB24與qnrB10、qnrB1氨基酸同源性見表2。

注：M為DL2000；1為qnrB通用引物擴增結(jié)果；2為qnrB24全CDS引物擴增結(jié)果。

圖1 PCR 擴增qnrB24基因結(jié)果表2 qnrB24與qnrB10、qnrB1氨基酸的同源性

2.2 臨床菌株、受體菌接合子的最小抑菌濃度(MIC)值 攜帶qnrB24基因接合子對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星敏感性均有下降，均較E.coliJ53受體菌下降大約8倍,臨床分離菌株耐藥水平高于接合子，見表3。

表3 臨床菌株、受體菌和轉(zhuǎn)移接合株對常見喹諾酮 類抗菌藥物的MIC值 (μg/mL)

2.3 Southern 雜交結(jié)果 Southern Blotting 分析再次證實qnrB24的基因位于質(zhì)粒上,并定位于60.0 Kb 的質(zhì)粒，見圖2。

注：A 接合子質(zhì)粒電泳圖，B對應(yīng)的Southern雜交圖(qnrB探針)。

圖2 Southern雜交結(jié)果

注：M1為λ-Hind Ⅲ digest；1～3為AP1 1st 2nd 3rd PCR產(chǎn)物；4～6為AP2 1st 2nd 3rd PCR產(chǎn)物；7～9為AP3 1st 2nd 3rd PCR產(chǎn)物；10～12為AP4 1st 2nd 3rd PCR產(chǎn)物；13～15為正對照 1st 2nd 3rd PCR產(chǎn)物；M2為DL2000。

圖3 qnrB24基因5′端未知側(cè)翼序列1、2、3次的PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.4 熱不對稱交錯PCR旁側(cè)測序結(jié)果 通過 PCR 擴增后發(fā)現(xiàn)編號09-906546的弗勞地枸櫞酸桿菌不攜帶有Ⅰ類整合子基因盒插入序列。并通過對編碼qnrB24基因上下游分析發(fā)現(xiàn)，在目的基因的上下游不存在典型的整合子結(jié)構(gòu)。qnrB24基因的5′端未知側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物克隆測序堿基序列在Genbank比對后發(fā)現(xiàn)，和5′端相連的核苷酸序列是一個假定的轉(zhuǎn)座酶，3′ 端旁側(cè)未擴增出特異性結(jié)果。該突變株5′端熱不對稱PCR電泳結(jié)果見圖3。

3 討 論

自從qnrA被Martinez-Martinez等[1]首次發(fā)現(xiàn)后，qnrB、qnrS、qnrC、qnrD等越來越多的PMQR基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[5-6]。研究已經(jīng)證明qnr及其同源基因廣泛存在革蘭陰性細菌中[7-8]。研究表明該類基因編碼的蛋白能夠逆轉(zhuǎn)喹諾酮類對DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制作用，從而引起細菌對喹諾酮類藥物的低水平耐藥[9]。同時，qnr的存在還能促進染色體gyrA、gyrB、parC、parE基因耐藥決定突變區(qū)(QRDRs)的變異，導(dǎo)致高水平耐藥[10]。同時發(fā)現(xiàn)含有qnr的質(zhì)粒與β-內(nèi)酰胺類，復(fù)方磺胺甲噁唑，氨基糖苷類等抗菌藥物的耐藥性有關(guān)[2-3,11]。最早發(fā)現(xiàn)的qnrB1，它的質(zhì)粒命名為PMG298，在PMG298中orf1005的下游發(fā)現(xiàn)了tnpA等轉(zhuǎn)座基因，在qnrB2的下游發(fā)現(xiàn)了Orf1的短片段。Corkill發(fā)現(xiàn)qnrB位于攜帶有其他耐藥基因的Ⅰ類整合子上[12]。整合子是一個DNA元件，具有可移動性，它可以通過位點特異性重組從而捕獲和整合很多耐藥基因，因此可將qnr及其他耐藥基因在不同的細菌間傳播。細菌的多重耐藥往往是qnr與其他多種耐藥基因共同整合在一起而引起的，同時包含qnr的菌株更容易發(fā)生染色體基因的自發(fā)突變從而產(chǎn)生高水平的耐藥菌株[13-14]。目前qnr陽性菌株的多重耐藥現(xiàn)狀嚴重，可能與qnr陽性質(zhì)?；蛘献咏Y(jié)構(gòu)上常包含多種耐藥基因，同時產(chǎn)超廣譜-β內(nèi)酰胺酶(產(chǎn)ESBLs)或AmpC型β-內(nèi)酰胺酶[15]。因此，由于PMQR機制的存在，治療細菌感染時臨床醫(yī)生選擇抗菌藥物的范圍也有所縮小。一旦PMQR在菌株中流行，則對于臨床選藥更是巨大的挑戰(zhàn)。

本研究首次發(fā)現(xiàn)了qnrB新的突變體，測定全基因組序列后命名為qnrB24(GENBANK注冊號HM192542)，并已被http://www.lahey.org/qnrStudies網(wǎng)站收錄。在qnrB亞型中，qnrB24與qnrB10的同源性最高，達98.67%(僅相差3個氨基酸序列)；與qnrB1同源性是96.92%(相差7個氨基酸序列)。接合子的耐藥性明顯高于受體菌耐藥性，說明qnrB24基因可以提高細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性，但對喹諾酮類抗菌藥物靶位點的結(jié)合作用較低，因此接合子對喹諾酮類藥物的耐藥性即使有所升高，但沒達到臨床耐藥折點水平，說明可能有其他因素共同作用提高細菌耐藥性。通過接合試驗及Southern雜交也證實了qnrB24可以通過質(zhì)粒在不同的菌株之間傳播。熱不對稱PCR結(jié)果顯示qnrB24的5′端旁側(cè)是一個假定的轉(zhuǎn)座酶，因此需要注意其在醫(yī)院流行傳播的可能。雖然qnrB24的流行率相對較低，但容易發(fā)展成高水平耐藥，下一步需要進一步監(jiān)測其流行性，同時對其進行全基因序列測序，了解有無與其他耐藥基因共同傳播。

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Analysis of plasmid mediated quinolone resistance gene qnrB24*

SHAOYi-bo1,LIXu2△,XIEQin-xiu2,HULi-fen3，GUYou-wei1

(1.DepartmentofNosocomialContrel,2.DepartmentofInfectiousDisease,3.DepartmentofCentralLaboratory,FirstAffliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230022,China)

Objective To detect and analyze the function of plasmid mediated quinolone resistance gene qnrB24.Methods The positive strains of qnrB24 gene detection were conducted transfer joint experiment,to explore the drug resistant of these strains to quinolonne drug,zygote plasmid was extracted by alkaline lysis method,and the size was detected by southern blot.The unknown base sequence on the wing of gene 5′ end and 3′ end were detected by thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction (PCR) technology.Results Susceptibility results showed that the minimum inhibitory concentration(MIC) of the transconjugant (carrying qnrB24 gene) against ciprofloxacin,levofloxacin were 0.125,0.190 μg/mL respectively.The sensitivity of the transconjugant was lower than the recipient starin,but the drug resistance was lower than the bacterial isolated in clinic.Southern hybridization of plasmid DNA from transconjugant of qnrB24 revealed that the gene was located on about 60 Kb plasmid.The quinolone resistance of qnrB24 could be transferred by conjugation.There was putative transposase adjust to 5′flank of qnrB24 gene.Conclusion The qnrB24 gene is discovered firstly.Gene qnrB24 could improve the drug resistance to fluoroquinolones,it′s necessary to monitor the epidemic characteristic of qnrB24 gene.

plasmid mediated quinolone resistance gene; quinolonne drug; qnrB24

2013年度中華醫(yī)院感染控制研究基金(ZHYY2013-013)；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2012年度國家自然科學(xué)基金青年基金院內(nèi)培育計劃(2012KJ09)。

邵宜波，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事感染控制相關(guān)研究工作。△

,E-mail：aylixu@yahoo.com.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.005

A

1672-9455(2015)04-0444-03

2014-07-07

2014-09-16)