酶聯(lián)免疫吸附試驗中影響全自動加樣系統(tǒng)加樣準(zhǔn)確性的因素分析*

畢聰璽，梁曉華，臧 亮，鄧雪蓮，王 琳

(遼寧省大連市血液中心 116001)

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·論 著·

酶聯(lián)免疫吸附試驗中影響全自動加樣系統(tǒng)加樣準(zhǔn)確性的因素分析*

畢聰璽，梁曉華△，臧 亮，鄧雪蓮，王 琳

(遼寧省大連市血液中心 116001)

目的 探討酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)中使用不同容量加樣針和分液高度，對全自動加樣系統(tǒng)加樣準(zhǔn)確度和精密度的影響。方法 選取10 μL和100 μL兩種加樣量，每種加樣量分4個小組進行實驗，分別使用不同容量(400 μL和800 μL)的加樣針和不同分液高度(浸潤和未浸潤)加樣，計算每組的最終加樣量、均值相對誤差(E)和變異系數(shù)(CV)，與實際工作標(biāo)準(zhǔn)進行比較。結(jié)果 10 μL加樣E在-37.9%～-2.8%，CV在3.29%～14.49%；100 μL加樣E在-1.9%～0.8%，CV在0.44%～0.95%。結(jié)論 不同容量加樣針和分液高度對10 μL加樣影響較為明顯，對100 μL加樣影響較小，在使用全自動加樣系統(tǒng)進行ELISA時，應(yīng)當(dāng)選擇適當(dāng)容量的加樣針和分液高度。

分液高度； 準(zhǔn)確度； 精密度； 掛滴現(xiàn)象

在對大批量標(biāo)本進行微量加樣時，傳統(tǒng)的手工加樣模式就顯現(xiàn)出很多弊端，比如需要耗費過多人工、過多加樣時間、加樣手法不同導(dǎo)致加樣量產(chǎn)生偏差、加樣時可能孔位加錯等[1]。全自動酶免系統(tǒng)整合的加樣器具有高通量、加樣準(zhǔn)確、人為干預(yù)小等優(yōu)點，對于需要同時進行大批量微量加樣的實驗室來說，利用全自動加樣器進行加樣就顯得尤為必要，近年來全自動加樣器已在國內(nèi)臨床檢驗科和采供血系統(tǒng)廣泛使用[2-3]。實際工作中選用不同容量的一次性加樣針及分液高度等參數(shù)都會對全自動加樣器的加樣準(zhǔn)確性以及后續(xù)實驗產(chǎn)生影響[4-5]，經(jīng)過查閱資料發(fā)現(xiàn)此類有關(guān)報道較少。作者結(jié)合實驗室日常工作，設(shè)計實驗來探討以上兩個參數(shù)對全自動加樣器加樣準(zhǔn)確度和精密度的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與耗材 分析天平(德國沙多利斯)，全自動酶免一體機(ADC ELISA 500煙臺艾德康，加樣器單元為4通道)，潔凈的酶免微孔反應(yīng)板8塊，室溫放置隔夜純水200 mL，潔凈試管16支(加入適量純水作為模擬標(biāo)本)，容量為400 μL和800 μL的全自動酶免一體機配套使用一次性加樣針頭若干。

1.2 方法 根據(jù)加樣量不同將實驗分為10 μL和100 μL兩大組，每大組按加樣參數(shù)不同分A、B、C、D 4個小組(共8組)。A組：使用400 μL容量加樣針，分樣時針尖浸沒于微孔內(nèi)預(yù)先加入的模擬稀釋液(浸潤)；B組：使用400 μL容量加樣針，分樣時針尖高于微孔內(nèi)模擬稀釋液面(未浸潤)；C組：使用800 μL容量加樣針，其他條件同A組；D組：使用800 μL容量加樣針，其他條件同B組。實驗前將預(yù)先準(zhǔn)備好的16個模擬標(biāo)本放入標(biāo)本區(qū)，在全自動酶免一體機控制軟件中將加樣器的3個加樣通道鎖定，只留取1個通道進行加樣。根據(jù)每組實驗標(biāo)準(zhǔn)編輯加樣程序，設(shè)定相應(yīng)的加樣量和分液高度等參數(shù)、選用對應(yīng)容量的加樣針。將微孔板每個微孔掰下，加入100 μL模擬稀釋液后于分析天平稱重，記錄結(jié)果，并將其放回微板對應(yīng)位置，每板(即每小組)標(biāo)本數(shù)為16，單組稱量結(jié)束后將微板放入儀器加樣平臺。運行加樣程序，結(jié)束后立即稱取每個微孔的重量，記錄結(jié)果。將實驗前后對應(yīng)孔位2次稱量數(shù)據(jù)相減即為每孔加樣重量，根據(jù)當(dāng)時室溫查得純水密度后換算每孔加樣量(體積)。

2 結(jié) 果

在進行10 μL加樣時，只有A組滿足實際工作要求，在進行100 μL加樣時，各組均滿足實際工作要求。見表1。

表1 實驗各組加樣量計算結(jié)果(n=16)

注：實際工作10 μL加樣應(yīng)滿足E在±10%，CV≤3.5%；100 μL加樣應(yīng)滿足E在±3%，CV≤1.0%。

3 討 論

實際工作中，微量加樣的準(zhǔn)確性直接影響生物、化學(xué)等實驗結(jié)果[6-9]，而且加樣量越小準(zhǔn)確性越難以控制。如采用ELISA進行丙型肝炎抗體檢測時，微孔先加入100 μL稀釋液，再加入10 μL標(biāo)本進行實驗，此時10 μL加樣準(zhǔn)確性比100 μL更難控制。本實驗在進行10 μL加樣時，只有A組數(shù)據(jù)滿足實際工作標(biāo)準(zhǔn)要求，分析其原因，A和B組比較，B組采用未浸潤分樣，由于液體表面張力的存在，分樣時懸空的加樣針尖會產(chǎn)生1 mm左右的液滴，即掛滴現(xiàn)象，由于血漿類標(biāo)本的黏度存在差異[10]，表面張力即存在差異，液滴大小不一，實驗結(jié)果顯示E為-10.5%，即平均加樣量只有8.95 μL，且CV為8.50%，加樣準(zhǔn)確性無法達(dá)標(biāo)。A組采用浸潤分樣，加樣針尖與稀釋液液面接觸，分樣時產(chǎn)生的液滴隨即溶入稀釋液中，可以有效避免掛滴現(xiàn)象的產(chǎn)生，E為-2.8%，CV為3.29%，準(zhǔn)確度和精密度均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。由以上兩組實驗可見，消除掛滴現(xiàn)象對10 μL加樣的準(zhǔn)確性起著至關(guān)重要的作用，同時也表明浸潤加樣可以有效消除掛滴現(xiàn)象。本實驗在浸潤分樣時針尖會有極微量稀釋液殘留(稀釋液殘留量不會對后續(xù)分樣產(chǎn)生影響)，實際工作中可以進一步調(diào)節(jié)和設(shè)置分樣高度，使針尖高度距稀釋液液面小于產(chǎn)生液滴的直徑，分樣時產(chǎn)生的液滴也可以隨即溶入稀釋液內(nèi)，既可以消除掛滴現(xiàn)象，又可以防止加樣針尖稀釋液殘留。A和C組比較，將樣品吸入加樣針后，加樣器活塞與樣品之間會有一段空氣存在(空腔氣體)，當(dāng)分樣時，活塞并不能直接擠壓需要分配的液體，而是擠壓二者之間的空腔氣體，再將壓力傳導(dǎo)給前部的樣品?？涨粴怏w因黏性樣品的阻力和活塞向外的壓力共同作用產(chǎn)生微小的形變，即體積縮小，活塞擠壓的進程不能完全傳遞給樣品，導(dǎo)致分液體積有所下降，空腔體積越大(大容量加樣針)產(chǎn)生形變越大，對分樣準(zhǔn)確性影響也越大。如實驗結(jié)果所示，10 μL加樣時C組加樣針容量較大，E也越大為-12.4%，即平均加樣量只有8.76 μL，已經(jīng)不能滿足準(zhǔn)確性要求。D組作為B和C組不利條件的疊加，加樣的準(zhǔn)確性變得更低，完全不能滿足實際工作要求。在進行100 μL加樣時，各組加樣數(shù)據(jù)均滿足實際工作標(biāo)準(zhǔn)要求。即全自動酶免一體機如果使用以上兩種不同容量加樣針進行加樣，以及加樣時產(chǎn)生的微量掛滴現(xiàn)象對加樣準(zhǔn)確性的影響均處在允許范圍內(nèi)，因此進行100 μL加樣時，選擇實驗中的4種參數(shù)組合均可。

綜上所述，使用全自動加樣器進行微量加樣時，應(yīng)當(dāng)根據(jù)加樣量的不同來選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)和方法。進行10 μL加樣時，應(yīng)設(shè)計方法(如采用浸潤加樣)盡量減少分液時掛滴現(xiàn)象的產(chǎn)生，同時選用容量小的加樣針以減小空腔氣體，確保分樣準(zhǔn)確；對于100 μL加樣，雖然以上參數(shù)對加樣準(zhǔn)確性有一定影響，但在允許范圍內(nèi)，可以根據(jù)實際情況選擇參數(shù)。而對于一份標(biāo)本需要同時進行多項酶聯(lián)免疫吸附試驗(不同體積)加樣時，可以從加樣準(zhǔn)確性、實驗耗時、耗材使用量等各方面綜合考慮，設(shè)計更適合的加樣參數(shù)和方法，只有這樣才會使加樣的準(zhǔn)確性得到提高，從而降低整個酶聯(lián)免疫吸附試驗的系統(tǒng)誤差，為實際工作提供更為準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)。

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Analysis on factors affecting sampling accuracy of automatic sampling system in ELISA*

BICong-xi,LIANGXiao-hua△,ZANGLiang,DENGXue-lian,WANGLin

(DalianBloodCenter,Dalian,Liaoning116001,China)

Objective To investigate the influence of different volumes of sampling needle and liquid height on the accuracy and precision of the full-automatic sampling system in ELISA tests.Methods The two sample amounts of 10 μL and 100 μL were selected and the each sample amount was divided into 4 groups for conducting the experiment.The different volumes (400 μL and 800 μL) of sampling needle and different liquid heights (infiltration and non-infiltratio) were used to conduct sampling.The final sampling amount,mean relative error (E) and coefficient of variation (CV) were calculated in each group.Then the results were compared with the actual working standard.ResultsEof sampling 10 μL was -37.9%--2.8% andCVwas 3.29%-14.49%;Eof 100 μL was -1.9%-0.8%,CVwas 0.44%-0.95%,respectively.Conclusion The different volumes of sampling needle and liquid height can affect the sampling amount of 10 μL obviously,but less affect the sampling amount of 100 μL.So the appropriate volume of sampling needle and liquid height should be selected to conduct the ELISA experiment when using the full-automatic sampling device.

sampling liquid height； accuracy； precision； hanging drop phenomenon

衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心專項課題(28-8-3)。

畢聰璽，男，主管檢驗技師，本科，主要從事輸血安全研究?！?/p>

，E-mail:xixi19820123@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.003

A

1672-9455(2015)02-0149-02

2014-05-22

2014-09-30)