萊州灣近岸海域中典型抗生素與抗性細(xì)菌分布特征及其內(nèi)在相關(guān)性

何春明，那廣水，陸紫皓，高會(huì),#，葛林科，張琳曉，李瑞婧，李軍，姚瑤

1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306 2. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 3. 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034

萊州灣近岸海域中典型抗生素與抗性細(xì)菌分布特征及其內(nèi)在相關(guān)性

何春明1,2，那廣水2,*，陸紫皓2，高會(huì)2,#，葛林科2，張琳曉3，李瑞婧2，李軍1,2，姚瑤1,2

1. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306 2. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心 國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 3. 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034

為了揭示海陸銜接區(qū)環(huán)境中抗生素與抗性細(xì)菌分布特征及其內(nèi)在相關(guān)性，以萊州灣及其主要入海河流為研究區(qū)域，利用HPLC-MS/MS分析樣品中15種磺胺類抗生素(SAs)和6種喹諾酮類抗生素(QNs)的濃度，并通過改良的Method 1604(US EPA)評(píng)估海水與沉積物中2種典型水傳病原微生物大腸桿菌(E. coli)與金黃色葡萄球菌(S. aureus)的抗生素抗性水平，進(jìn)而探討該區(qū)域水體中抗性菌株的分布特點(diǎn)以及微生物抗性率與相應(yīng)抗生素濃度的相關(guān)性。結(jié)果顯示，萊州灣水體與沉積物中普遍存在磺胺與喹諾酮類抗生素殘留及抗性污染問題。兩大類抗生素在水體中平均殘留濃度分別為3.89 ng·L-1(SAs)和234.68 ng·L-1(QNs)，在沉積物中分別為0.91 ng·g-1(SAs)和49.37 ng·g-1(QNs)，且分布特征基本呈現(xiàn)自河流向海洋逐漸遞減的趨勢(shì)，說明河流輸入是萊州灣抗生素污染的主要來源。在水體中，具有磺胺類抗性的E. coli和S. aureus平均檢出量分別達(dá)到2 018和4 683 CFU·L-1，抗性率范圍分別在0%～ 37.3%和10.6% ～ 45.8%之間；而2種喹諾酮類抗性病原微生物的平均檢出量則相對(duì)較低，分別為1 315 CFU·L-1(E. coli)和1 461 CFU·L-1(S. aureus)，抗性率分別為0% ～ 50.0%和0% ～ 20.8%；此外，相比于E. coli，S. aureus為沉積物中的主要抗性病原微生物，磺胺與喹諾酮類抗性S. aureus檢出率均高于80%，平均檢出量分別為24 CFU·g-1和18 CFU·g-1。相關(guān)性分析表明，萊州灣近岸海域水體中磺胺類抗生素濃度與磺胺類抗性微生物總量之間具有良好的線性關(guān)系，然而其與微生物抗性率之間并未表現(xiàn)出相似的規(guī)律，說明近岸海洋環(huán)境中抗生素的殘留量不是影響抗性菌株豐度的唯一因素。

磺胺；喹諾酮；抗生素抗性菌株；萊州灣；相關(guān)性

長期以來，由于抗生素在治療感染性疾病與集約化養(yǎng)殖業(yè)中長期、大量、不合理的使用，造成了一系列嚴(yán)重的公共健康與環(huán)境問題。世界衛(wèi)生組織在全球首份抗生素耐藥性監(jiān)測(cè)報(bào)告中稱抗生素危機(jī)將比20世紀(jì)80年代的艾滋病疫情更加嚴(yán)重，抗生素耐藥性正嚴(yán)重威脅著全球公共健康，若不采取緊急協(xié)調(diào)措施，全球?qū)⒆呦颉昂罂股亍睍r(shí)代[1]。目前全球范圍內(nèi)不同介質(zhì)中抗生素藥物及其抗性微生物被不斷檢出。中國作為第一大抗生素生產(chǎn)與消費(fèi)國，其年消耗量達(dá)180 000 t[2]，抗生素誤用與濫用現(xiàn)象更為嚴(yán)重，因此迫切需要開展有關(guān)抗生素及其抗性污染的系統(tǒng)研究。

近10年來，國內(nèi)外針對(duì)不同環(huán)境區(qū)域中的抗生素抗性污染狀況開展了大量研究。歐洲、美國、日本、中國等國家和地區(qū)先后在污水處理廠進(jìn)出水[3]、醫(yī)療廢水[4]、地下水[5]以及河流[6]中檢測(cè)到多類抗生素抗性微生物(antibiotic-resistant bacteria, ARB)與生物體內(nèi)的抗性基因(antibiotic reisistance genes, ARGs)，證實(shí)了城市污水、制藥與醫(yī)療廢水中已經(jīng)普遍受到抗生素抗性污染，同時(shí)人類活動(dòng)與抗生素的使用直接影響了抗生素抗性的產(chǎn)生及抗性基因的豐度，但是有關(guān)近岸海洋環(huán)境中典型水傳病原微生物的抗生素抗性水平、分布規(guī)律及其由河流遷移到海洋環(huán)境中的動(dòng)態(tài)變化特征卻鮮有報(bào)道。河口海岸帶是介于河流和海洋之間的生態(tài)交錯(cuò)區(qū)，也是陸海相互作用最強(qiáng)烈的區(qū)域，與內(nèi)陸環(huán)境相比，其地理位置與物理化學(xué)性質(zhì)較為特殊，抗生素殘留量也明顯低于河流、城市污水等。在低濃度抗生素相對(duì)較弱的選擇壓力與復(fù)雜的陸海交互作用雙因素影響下，抗生素抗性微生物的分布與遷移規(guī)律是否與高抗生素殘留量的內(nèi)陸環(huán)境中的情形相一致尚不清楚。

因此，為了深入探討河口海岸帶在低濃度抗生素殘留條件下，水體與沉積物中典型病原微生物的抗生素抗性水平、變化特征及其分布與遷移規(guī)律，本研究選取了萊州灣及其主要河流為代表區(qū)域，并以常用的磺胺類和喹諾酮類抗生素及水傳病原微生物大腸桿菌(E. coli)與金黃色葡萄球菌(S. aureus)為研究對(duì)象，應(yīng)用HPLC-MS/MS法對(duì)水樣中抗生素濃度含量進(jìn)行測(cè)定[7]，并采用以往研究[8-9]基礎(chǔ)上改良的Method 1604(EPA)[10]方法評(píng)估萊州灣近岸海洋環(huán)境中E. coli與S. aureus的抗生素抗性水平，探討抗生素抗性病原微生物在河口海岸帶的動(dòng)態(tài)變化特征及其與相應(yīng)抗生素殘留水平間的內(nèi)在相關(guān)性，以期為盡早采取針對(duì)性措施解決日趨嚴(yán)重的環(huán)境抗生素抗性污染問題提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 樣品采集

2014年12月對(duì)萊州灣近岸海域(SF01～SF06)及小清河、堤河、虞河及彌河等4條主要入海河流入海口(HK01～HK04)進(jìn)行調(diào)查，共設(shè)置10個(gè)站位點(diǎn)采集水樣與沉積物樣品。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS，Thermo Fisher Scientific，USA)，Symmetry? C18柱(2.1 mm × 150 mm，3.5 μm，Waters公司，USA)，渦旋混勻器(QL-901，海門市其林貝爾儀器廠)，固相萃取裝置(VISIPREP 24TMDL，SUPELCO公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GHP-9080，上海一恒)，立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(GI54DWS,致微(廈門)儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)等，氮?dú)饩鶠楦呒兊?/p>

實(shí)驗(yàn)試劑：甲醇(色譜純)、甲酸(99%)分別購自德國Merck KgaA公司和美國Tedia Scientific公司，其余藥品或試劑均為分析純。MI培養(yǎng)基購自美國BD公司，MH(B)培養(yǎng)基購自北京Solarbio公司，磺吡芐頭孢菌素、亞碲酸鉀，氯化鈉均購自中國阿拉丁公司，孔徑0.45 μm的網(wǎng)格濾膜購自美國BD公司?；前反柞?SAAM)、磺胺吡啶(SP)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SM)、磺胺甲噻唑(SMTZ)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺甲基異惡唑(SMX)、磺胺甲氧噠嗪(SMP)、磺胺間二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺二甲異惡唑(SIX)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDX)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CPFX)、洛美沙星(LOME)、恩諾沙星(ENRO)、氧氟沙星(OFL)、沙拉沙星(SARA)均購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，回收率指示劑磺胺嘧啶-13C6(sulfadiazine-13C6)購自J&K公司(純度>99.5%)。所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均溶解在甲醇中，并于暗處4 ℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗生素檢測(cè)

采用Na等[11]開發(fā)的多類抗生素聯(lián)合分析方法對(duì)磺胺類和喹諾酮類抗生素進(jìn)行分析。

圖1 萊州灣采樣站位分布圖

1.3.2 抗性微生物檢測(cè)

分別以典型水傳病原性微生物E. coli與S. aureus為革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌代表，通過改進(jìn)傳統(tǒng)濾膜法結(jié)合MI培養(yǎng)基與VJ培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，并通過侵入不同種類抗生素制成抗性篩選MI-R與VJ-R培養(yǎng)基，依據(jù)無抗生素平板上的菌落數(shù)作為水體中可培養(yǎng)微生物的總數(shù)計(jì)算抗性微生物占微生物總量的百分比來評(píng)價(jià)抗性水平[12]。

1.4 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制(QA/QC)

既然是天意，就不能違抗。他想，也許這對(duì)她來說是一件好事，是一件以后想起來不必矛盾和糾結(jié)的好事。還是原配好。她曾經(jīng)說過。每次在一起面對(duì)他的為難甚至是顯得虛妄的希望時(shí)，她總是這樣潑冷水。顯然，他們不再是狂躁的孩子。她不會(huì)因此離開家庭，雖然因?yàn)榧拍邮芰怂淖非?，并且全身心地享受著這份另類的激情。而他顯出的虛妄多是在她矛盾愧疚的時(shí)候出現(xiàn)。我是好女人嗎？會(huì)遭到唾棄嗎？等高漲的潮水退去的時(shí)候，突兀的巖層理性地裸露出來。于是，在她無序的自責(zé)中，他會(huì)挺身而出，騎士般地說，不要等下輩子了，讓我這輩子就娶你吧。我什么都可以舍得。

替代標(biāo)準(zhǔn)用于補(bǔ)償被分析物質(zhì)在前處理過程中的損失，水體、沉積物樣品中抗生素的平均回收率分別為72.8%和67.5%，水體相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)低于15%，沉積物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)低于13%。分析樣品過程中，同時(shí)分析QA/QC樣品，包括方法空白、空白加標(biāo)和空白加標(biāo)平行樣。抗性菌株的篩選利用沒有抗性的對(duì)照菌株作為陰性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，使用單方差顯著性差異(P<0.05)。微生物實(shí)驗(yàn)操作需在超凈無菌工作臺(tái)中完成，確保無外界環(huán)境雜菌污染。數(shù)據(jù)分析用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 萊州灣近岸海域中磺胺類抗生素分布特征

萊州灣近岸海域中磺胺類抗生素(SAs)濃度總含量分析結(jié)果顯示，15種SAs在河水樣品中檢出率多在80%以上，普遍高于海水樣品，SMX和SMP是主要的磺胺類污染物質(zhì)。河水和海水中SAs濃度范圍分別在ND～9.15 ng·L-1和ND～0.42 ng·L-1，說明萊州灣區(qū)域水體中存在一定量的磺胺類藥物殘留，且河流入?？谔嶴As濃度高于海洋水體中抗生素濃度(如圖2)，與Na等[12]和秦延文等[13]研究北黃海近岸水體和大遼河表層水體中SAs檢測(cè)量分別為ND～584 ng·L-1和ND～91 ng·L-1相比含量偏低。這可能與該區(qū)域內(nèi)SAs的使用量較小或者研究河段水量較大、自凈能力較強(qiáng)以及抗生素降解率高等作用有關(guān)[13]。

所有沉積物樣品中，SP均有檢出，除SDX (91%)和SAAM (82%)外，其余檢出率均低于50%。15種SAs總濃度最高值出現(xiàn)在HK04，為4.88 ng·g-1·，且該采樣點(diǎn)SMX濃度也最高，為1.91 ng·g-1，這也反應(yīng)了SMX在萊州灣區(qū)域的使用較為廣泛。沉積物樣品中檢出率與平均濃度普遍低于水樣，可能是由于磺胺類藥物親水性強(qiáng)，穩(wěn)定性較高，很容易通過排泄和雨水沖刷等方式進(jìn)入到水環(huán)境中[14]。沉積物中SAs濃度較低進(jìn)一步表明該類抗生素在萊州灣海域使用較少。

圖2 萊州灣中水樣(A)和沉積物(B)中磺胺類和喹諾酮類抗生素含量分布狀況

由圖2進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，水和沉積物中SAs濃度分布均呈現(xiàn)：河口區(qū) >近海區(qū)(SF01、SF02、SF03)>較遠(yuǎn)海區(qū)(SF04、SF05、SF06)，且同一縱斷面均呈現(xiàn)濃度遞減趨勢(shì)(HK04>SF01>SF04>SF06，HK01>SF03>SF05>SF06)，SF06濃度值均最低，可能是由于隨著離岸距離的增加，抗生素濃度被海水稀釋，造成含量較低。

2.2 萊州灣近岸海域中喹諾酮類抗生素分布特征

6種喹諾酮類抗生素(QNs)在水樣中除了LOME(53%)其余檢出率均在80%以上，NOR、SARA和CPFX的平均濃度分別為86 ng·L-1、71 ng·L-1和20 ng·L-1，最高濃度分別為172 ng·L-1、108 ng·L-1和37 ng·L-1，均高于ENRO、OFL和LOME(如圖3)。與Zhang等[15]2009年萊州灣的研究結(jié)果相比，QNs檢出率及污染趨勢(shì)基本一致，河流入?？谥蠶Ns濃度高于海洋中濃度。此外，相較于其他河流環(huán)境，萊州灣喹諾酮類抗生素的平均濃度高于海河及其支流[16]，低于白洋淀河流[17]進(jìn)水濃度，與大遼河表層水體中QNs的濃度處于同一水平。

如圖3所示，QNs沉積物樣品檢出率和平均濃度趨勢(shì)與水樣中基本保持一致，但ENRO在沉積物中及大多數(shù)水樣中含量偏低，但在HK01、SF03、SF05這3個(gè)站位水樣中濃度卻遠(yuǎn)高于其他化合物，尤其HK01殘留量最高，這是由于HK01處于入海排污口及養(yǎng)殖區(qū)，污染較大，這也導(dǎo)致同一縱斷面的站位濃度也普遍高于其他化合物，表明河流輸入是萊州灣區(qū)域抗性污染的主要來源。進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，河口區(qū)濃度與海洋區(qū)濃度存在差異，只是未出現(xiàn)明顯的遞減趨勢(shì)，但同一縱斷面均呈現(xiàn)類似的濃度遞減趨勢(shì)，且靠近HK01、HK02附近同一縱斷面采樣點(diǎn)的污染較重，可能是由于該區(qū)域位于萊州灣南部，不僅有堤河、虞河、彌河等多條河流入海，而且在沿岸流的作用下也會(huì)受到西南部小清河入海的影響，即會(huì)受到沿岸農(nóng)業(yè)非點(diǎn)源和水產(chǎn)養(yǎng)殖污染物排放的影響。

圖3 萊州灣水樣(A)和沉積物(B)中不同喹諾酮類抗生素的濃度分布

萊州灣區(qū)域QNs含量差異，可能與周邊抗生素使用量或環(huán)境行為有關(guān)，如NOR和CPFX醫(yī)療用量排名居前[18]，且作為獸藥在畜牧養(yǎng)殖中被廣泛使用，因此在環(huán)境中分布廣泛[15]。而ENRO與OFL作為新型抗菌藥應(yīng)用范圍相對(duì)較窄，使用量有限，因此其在環(huán)境中檢出率與檢出量較低。同時(shí)，抗生素殘留時(shí)間及污染源離采樣點(diǎn)距離的差異可引起抗生素不同程度上的衰減，導(dǎo)致局部殘留出現(xiàn)差異性。

2.3 萊州灣近岸海域中抗性微生物分布特征

2.3.1 水體中抗性細(xì)菌分布特征

萊州灣近岸海域表層水體中大腸桿菌與金黃色葡萄球菌含量如圖4所示，發(fā)現(xiàn)各站位點(diǎn)檢出率及菌體豐度存在一定的差異。河口水體中E. coli與S. aureus平均菌體豐度分別為14 950 CFU·L-1與47 725 CFU·L-1；海洋水體中E. coli與S. aureus平均菌體豐度分別為367 CFU·L-1與10 290 CFU·L-1。2種水傳病原微生物的空間分布具有明顯的區(qū)域特征，即近海區(qū)<河口區(qū)，隨著鹽度的增加水體中的E. coli與S. aureus豐度均表現(xiàn)出不同程度的衰減，如圖4所示?？剐栽u(píng)估實(shí)驗(yàn)表明，河口海岸帶環(huán)境中典型水傳病原微生物普遍存在抗生素抗性污染問題(表1)。河口區(qū)E. coli磺胺抗性率在0%～37.3%之間，平均抗性率為15.62%，其中虞河入?？?HK02)最高。S. aureus磺胺抗性率在10.6%～45.8%之間，平均抗性率為19.2%，其中彌河入?？?HK03)最高。E. coli和S. aureus喹諾酮抗性率分別在9.1%～50%和3.4%～20.8%范圍內(nèi)，平均抗性率為19.28%和8.42%，彌河入海口仍處于較高水平。與施嘉琛等[19]報(bào)道的北京溫榆河流域內(nèi)大腸桿菌抗生素抗性率(10%～35%)結(jié)果相似，而略低于Watkinson等[20]調(diào)查美國Brisbane River中E. coli磺胺類平均抗性率(37% ± 5%)，表明不同的水質(zhì)環(huán)境所導(dǎo)致的抗生素對(duì)抗性細(xì)菌的效應(yīng)也不同，抗性率的高低可能與河口海岸帶環(huán)境的復(fù)雜性以及周圍環(huán)境抗生素的使用水平密切相關(guān)。海洋區(qū)磺胺平均抗性率分別為13.57%和27.77%，E. coli和S. aureus的喹諾酮抗性菌株普遍無檢出。由此可見，與相鄰海洋區(qū)抗生素抗性污染狀況相比，河口區(qū)域病原性微生物的抗生素抗性污染情況更加嚴(yán)重。

2.3.2 沉積物中抗性細(xì)菌分布特征

沉積物中各站位點(diǎn)抗性細(xì)菌的檢出率及菌體豐度值均低于水體樣品，河口沉積物中，E. coli與S. aureus平均菌體豐度分別為3 390 CFU·g-1與1 010 CFU·g-1；海洋沉積物中E. coli與S. aureus平均菌體豐度分別為70 CFU·g-1與600 CFU·g-1。分布特征如圖4所示，呈現(xiàn)近海區(qū)<河口區(qū)趨勢(shì)，與水樣保持一致?？剐栽u(píng)估實(shí)驗(yàn)表明(表1)，河口區(qū)E. coli磺胺抗性率和S. aureus磺胺抗性率分別在0%～29.8%和20.8%～43.2%范圍內(nèi)，平均抗性率為7.2%和31.2%；E. coli喹諾酮抗性率和S. aureus喹諾酮抗性率分別在0%～40.3%和17.2%～31.3%范圍內(nèi)，平均抗性率為9.26%和18.54%。與張婉茹等[12]研究北黃海近岸海域沉積物中E. coli抗性率0%～33%范圍內(nèi)，其平均抗性率為15%，處于同一水平。海洋區(qū)E. coli的抗性菌株普遍均無檢出，而S. aureus抗性檢出率較高，喹諾酮和磺胺的平均抗性率分別為18.48%和21.6%。海水中普遍存在磺胺類抗性E. coli，而在沉積物中無檢出，這可能是由于SAs濃度較低且吸附能力弱，由于海水中鹽度、溫度的變化，抗性微生物生物適應(yīng)性降低，從而導(dǎo)致抗性率偏低。

圖4 萊州灣水樣(A)和沉積物(B)中兩種水傳病原微生物豐度

表1 萊州灣抗性微生物抗性水平在水和沉積物中的分布情況Table 1 Distribution of the resistant level of antibiotic resistance bacteria in water and sediment of Laizhou Bay

2.4 抗生素濃度與抗生素抗性細(xì)菌分布的關(guān)系

抗生素不但會(huì)對(duì)環(huán)境微生物生物量、群落結(jié)構(gòu)及其相關(guān)生態(tài)功能產(chǎn)生影響，而且能加速抗生素抗性基因在細(xì)菌之間的傳播與擴(kuò)散，不斷導(dǎo)致抗性耐藥菌產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，海洋站位點(diǎn)(SF04、SF05、SF06)位于離岸邊較遠(yuǎn)海域，人類活動(dòng)較少，結(jié)果顯示15種SAs濃度較低，但仍可以篩選出磺胺類抗性E. coli且抗性率較高，抗性污染普遍存在，可能是由于抗生素的低濃度誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生，同時(shí)也存在抗性基因傳播的可能性，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

為了研究不同類型的抗生素殘留對(duì)抗性微生物豐度的影響，采用線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，水體中SAs濃度與磺胺類抗性微生物總量之間具有良好的線性關(guān)系，如圖5所示，與Gao等[21]研究發(fā)現(xiàn)的磺胺甲惡唑抗性細(xì)菌和總體所測(cè)磺胺類藥物線性相關(guān)，結(jié)果一致。然而，水和沉積物中QNs濃度與喹諾酮抗性微生物量之間均無良好線性關(guān)系，與歐丹云等[22]對(duì)九龍江下游河口水域調(diào)查發(fā)現(xiàn)的抗性細(xì)菌的豐度與抗生素濃度不具有良好線性關(guān)系結(jié)果相似。為了進(jìn)一步探討河口海岸帶環(huán)境中抗生素殘留量對(duì)典型病原微生物抗生素抗性水平的影響，我們應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0對(duì)不同類型抗生素濃度與相應(yīng)E. coli與S. aureus抗性水平進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，通過對(duì)多組數(shù)據(jù)間的兩兩相關(guān)性分析及合并(表2)發(fā)現(xiàn)水中與沉積物中E. coli磺胺抗性率、S. aureus磺胺抗性率與SAs的濃度均無顯著相關(guān)性，E. coli喹諾酮抗性率、S. aureus喹諾酮抗性率與QNs的濃度均無顯著相關(guān)性。與Na等[12]研究發(fā)現(xiàn)北黃海近岸海域E. coli磺胺抗性率與磺胺類抗生素濃度含量存在顯著相關(guān)性，以及Jiang等[23]對(duì)黃浦江各采樣點(diǎn)磺胺抗性基因污染水平與SAs總濃度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)兩者具有一定的相關(guān)性等結(jié)果，并不一致，這可能是由于以往的研究對(duì)象多集中于內(nèi)陸河流、養(yǎng)殖場(chǎng)、市政與醫(yī)療廢水等，這些區(qū)域抗生素含量較高往往能達(dá)到幾百至幾千納克每升，抗生素能對(duì)相應(yīng)的抗性基因提供較強(qiáng)的選擇壓力，這種選擇壓力成為抗生素抗性基因傳播的主要推動(dòng)力。與內(nèi)陸水環(huán)境相比，河口海岸帶環(huán)境濃度低1到2個(gè)數(shù)量級(jí)，殘留水平僅為幾十納克每升，其含量遠(yuǎn)低于E. coli與S. aureus的最低抑菌濃度，所以其對(duì)環(huán)境中微生物的抗性變化并未起到?jīng)Q定性作用；另外海陸銜接區(qū)物理化學(xué)性質(zhì)更為特殊，存在多種環(huán)境因子及其他污染物，且不同河口海岸帶的環(huán)境條件也不一致，不同的水質(zhì)環(huán)境及內(nèi)部的選擇性壓力都會(huì)使微生物的生物適應(yīng)性降低，如水文、鹽度等條件均可能會(huì)對(duì)微生物的抗性產(chǎn)生影響[24]。

圖5 水樣中磺胺類抗生素濃度與磺胺類抗性微生物總量的線性關(guān)系

表2 抗生素濃度與不同抗性微生物抗性率相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of antibiotics concentrations and resistant levels

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Distribution and Correlation of Typical Antibiotics and Antibiotic-Resistant Bacteria in the Coastal Marine Environment of Laizhou Bay, China

He Chunming1,2, Na Guangshui2,*, Lu Zihao2, Gao Hui2,#, Ge Linke2, Zhang Linxiao3, Li Ruijing2, Li Jun1,2, Yao Yao1,2

1. College of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China 2. Key Laboratory of Coastal Ecology and Environment of State Oceanic Administration, National Marine Environmental Monitoring Center, Dalian 116023, China 3. College of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

Received 18 May 2015 accepted 17 August 2015

To study the distribution and correlation of antibiotics and antibiotic-resistant bacteria in the coastal adjacent land environment, 15 kinds of sulfonamides (SAs) and 6 kinds of quinolones (QNs) in water and sediment were analyzed by a multi-residue chemical analysis methodology, using solid phase extraction coupled with liquid chromatography tandem mass spectrometry, sampled from the rivers discharging to the Laizhou Bay and the seawater of the bay. Furthermore, the resistant levels of E. coli and S. aureus in the water and sediment were assessed by the improved Method 1604 (EPA). Results showed that antibiotic residues and resistance pollution problems were widespread in water and sediment of Laizhou Bay. The mean concentrations of SAs and QNs were 3.89 ng·L-1and 234.68 ng·L-1in water, and 0.91 ng·g-1and 49.37 ng·g-1in sediment. For further analysis, a gradually decreasing trend of antibiotics distribution showed from the river to the sea, which indicated that river was a statistically significant source of antibiotics. Meanwhile, high prevalence of antibiotic resistance bacteria was found in the Laizhou Bay. The levels of resistance to SAs were 0%～37.3% (E. coli) and 10.6%～45.8% (S. aureus) in water. The mean concentrations of SAs-resistant E. coli (S-Re-E. coli) and SAs-resistant S. aureus (S-Re-S. aureus) were high up to 2 018 and 4 683 CFU·L-1. Moreover, the mean concentration of QNs-resistant E. coli (Q-Re-E. coli) and QNs-resistant S. aureus (Q-Re-S. aureus) were 1 315 and 1 461 CFU·L-1in water. The resistant levels of the E. coli and S. aureus were 0%～50.0% and 0%～20.8%. Moreover, S. aureus was the main resistant bacteria in sediment, and the detection rate of the S-Re-S. aureus strains and Q-Re-S. aureus strains were all above 80%. The mean concentration of S-Re-S. aureus and Q-Re-S. aureus were 24 and 18 CFU·g-1, and the resistant levels were 0%～ 54.5% and 0%～33.3% in sediment. Correlation analysis showed that a good linearity between the concentrations of SAs and the abundance of SAs-resistant bacteria in water. Nevertheless, no significant correlations were found between antibiotic concentrations and resistant levels, which indicated that antibiotic residues were not the only factor to affect the abundance of antibiotic-resistant bacteria in the coastal adjacent land environment.

sulfonamide; quinolones; antibiotic-resistant bacteria; Laizhou Bay; correlation

國家自然科學(xué)基金(No.41406088，No.21377032)；國家海洋局海洋公益性科研專項(xiàng)(No.201105013)

何春明(1991-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樾滦臀廴疚锃h(huán)境行為研究，E-mail: hechunming331@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: gsna@nmemc.org.cn；

(Co-corresponding author)，E-mail: hgao@nmemc.org.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150518001

2015-05-18錄用日期：2015-08-17

1673-5897(2015)5-115-10

X171.5

A

那廣水(1977—)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事新型污染物環(huán)境行為及其毒理學(xué)研究。

高會(huì)(1985—)，女，碩士，工程師，主要從事污染物毒理及環(huán)境行為方面的研究。

共同

何春明, 那廣水，陸紫皓, 等. 萊州灣近岸海域中典型抗生素與抗性細(xì)菌分布特征及其內(nèi)在相關(guān)性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(5): 115-123

He C M, Na G S, Lu Z H, et al. Distribution and correlation of typical antibiotics and antibiotic-resistant bacteria in the coastal marine environment of Laizhou Bay, China [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 115-123 (in Chinese)