污水處理廠空氣介質(zhì)抗生素抗性基因的分布

高新磊，邵明非，賀小萌，歐陽(yáng)峰，商丹丹，李繼,*

1． 哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院 深圳市水資源利用與環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518055 2． 北京國(guó)環(huán)清華環(huán)境工程設(shè)計(jì)研究院有限公司深圳分院，深圳 518049

污水處理廠空氣介質(zhì)抗生素抗性基因的分布

高新磊1，邵明非1，賀小萌1，歐陽(yáng)峰1，商丹丹2，李繼1,*

1． 哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院 深圳市水資源利用與環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518055 2． 北京國(guó)環(huán)清華環(huán)境工程設(shè)計(jì)研究院有限公司深圳分院，深圳 518049

考察了污水處理廠空氣介質(zhì)中典型的抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)污染水平和濃度分布，并通過(guò)16S rRNA高通量技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行親緣性及溯源研究。結(jié)果表明，在污水廠空氣樣品中8種抗生素抗性基因的檢出率均超過(guò)50%，其中tetC、sul1、sul2和ermB檢出率為100%。在曝氣池和污泥脫水車(chē)間空氣樣品中8種抗性基因檢出率均為100%。對(duì)其中的sul1、sul2、tetG和tetX共4種ARGs的定量分析結(jié)果表明，以上4種基因的相對(duì)濃度范圍在102～105copies·ng-1DNA之間，與鄰近居民區(qū)空氣樣品抗性基因濃度處于同一水平；空氣樣品16S rRNA高通量測(cè)序聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，居民區(qū)空氣與污水廠園區(qū)內(nèi)空氣有較高的種群相似度，污水廠處理單元對(duì)其鄰近區(qū)域的空氣介質(zhì)微生物組成影響較大。

抗生素抗性基因；空氣介質(zhì)微生物；污水廠

城市市政污水廠是抗生素抗性細(xì)菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)高度富集和增殖的場(chǎng)所，四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和磺胺類(lèi)抗性基因是其中重要的組成部分[1-2]。近年來(lái)有關(guān)污水處理系統(tǒng)中高檢出率和高濃度的抗性基因的報(bào)道已引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注[3-6]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于污水廠環(huán)境中抗生素抗性基因的研究主要集中于水相和污泥相，而對(duì)空氣介質(zhì)中存在的ARGs則關(guān)注較少[7]。污水廠處理工藝中的充氧曝氣以及污泥干燥等過(guò)程可將污水處理系統(tǒng)儲(chǔ)存庫(kù)中的高濃度ARGs轉(zhuǎn)移至空氣中并可能對(duì)處理廠及周邊環(huán)境造成直接影響。Chapin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)豬場(chǎng)室內(nèi)空氣中分離的革蘭氏陽(yáng)性菌菌種中至少98%具雙重耐藥性。Gilbert等[9]發(fā)現(xiàn)醫(yī)院空氣中微生物氣溶膠的DNA提取物含有tetG、ermF和ermX基因。目前報(bào)道的空氣中抗生素抗性基因已有16種之多[10]。動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)和醫(yī)療診所可能是空氣中幾類(lèi)四環(huán)素抗性基因的源頭，并可通過(guò)空氣交換和傳播[11]。有研究采用高通量測(cè)序方法獲得了北京霧霾天PM2.5中微生物的組成，并發(fā)現(xiàn)其中存在少量源于土壤的可能致病或致過(guò)敏微生物的DNA序列，為空氣微生物組成和溯源研究提供了重要的方法依據(jù)[12]。

污水廠空氣中的抗性基因污染對(duì)人的影響較為隱秘因而長(zhǎng)期被人們所忽視。本文針對(duì)幾種典型的ARGs對(duì)污水廠空氣樣品中抗性基因的污染水平、濃度分布開(kāi)展研究，并通過(guò)使用高通量技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行親緣性及溯源研究[13-14]。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 樣品采集

選用深圳市羅湖區(qū)羅芳污水處理廠作為研究對(duì)象，該廠采用AB法工藝處理污水，分別取進(jìn)水、格柵、厭氧、缺氧、好氧、污泥干化及附屬區(qū)域的空氣樣本及相關(guān)構(gòu)筑物內(nèi)污水污泥做分析對(duì)照(如表1)?？諝鈽悠凡捎弥悄艽罅髁縏SP(PM10)采樣器(2031型，青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所，中國(guó)青島)采集，采樣流量為1.05 m3·min-1，每個(gè)樣品采樣時(shí)長(zhǎng)20 h，采樣膜對(duì)折后取其面積的1/8提取DNA。污水污泥樣品采用過(guò)濾或離心方式獲得約0.5 g干泥提取DNA。DNA提取均采用試劑盒提取方法(Fast DNA kit for soil, MP, US)。

表1 采樣信息表Table 1 Sampling information

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

空氣膜樣品預(yù)處理，用消毒過(guò)的剪刀剪取適量樣品膜(本研究使用的大流量TSP采樣器濾膜尺寸230 mm×180 mm，可取1/8，膜面積約為50 cm2)，用鑷子小心將濾膜最表層揭下。水樣預(yù)處理，取一定量水樣直接高速離心獲取DNA或抽濾至濾膜上，將濾膜剪碎放入離心管中備用。將樣品轉(zhuǎn)移至試劑盒提供的Lysing Matix E管中，并參照MP Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品DNA，并使用Nanodrop 2000檢測(cè)樣品濃度及純度。

1.2.2 抗生素抗性基因分析

實(shí)驗(yàn)選用3大類(lèi)8種抗生素抗性基因進(jìn)行檢測(cè)分析，采用PCR技術(shù)檢測(cè)抗性基因，采用qPCR技術(shù)分別對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗性基因(tetG、tetX)和磺胺類(lèi)抗性基因(sul1、sul2)進(jìn)行定量研究，引物信息如表1-2所示。1.2.3 高通量數(shù)據(jù)分析方法

擴(kuò)增測(cè)序區(qū)間為16S RNA片段V3-V4區(qū)域(F314，R805)，采用Qubit 2.0測(cè)定純化后的PCR產(chǎn)物濃度，然后將不同樣品按照1∶1的比例進(jìn)行混合，最后將混合樣品采用Illumina Miseq300PE技術(shù)進(jìn)行基因文庫(kù)構(gòu)建與雙末端(paired-end)測(cè)序，測(cè)序策略為300PE[15]。

本研究序列信息分析主要使用MOTHUR軟件，用于2個(gè)方面：測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理和操作分離單元(OTUs)的聚類(lèi)。

數(shù)據(jù)預(yù)處理，首先使用make.contigs命令進(jìn)行融合雙末端序列，而后通過(guò)各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，然后再通過(guò)get.group命令將數(shù)據(jù)分割為單個(gè)樣品的序列和分組信息(fasta和group)文件。unique.seqs命令用于去除重復(fù)序列，可降低分析后續(xù)過(guò)程中冗余的計(jì)算量。用screen.seqs命令去除測(cè)序質(zhì)量較差的序列。最后使用sub.sample命令對(duì)不同樣品的序列條數(shù)進(jìn)行統(tǒng)一，保證微生物信息分析的有效性。

OTUs的聚類(lèi)，是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中，為了方便分析，人為給某一個(gè)分類(lèi)單元(品系、種、屬、分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。Align命令可將樣品的fasta格式的候選序列文件與比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)SILVA中同樣格式的模板序列對(duì)齊。而使用Cluster命令就能用來(lái)給OTUs分派序列，通過(guò)OTUs分析，就可以知道樣品中的微生物的種群親緣程度、多樣性和不同微生物的豐度。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 抗性基因定性分析

本研究對(duì)污水廠空氣、污水污泥共計(jì)21個(gè)樣品的8種抗性基因(tetC、tetG、tetO、tetX、sul1、sul2、ermB、ermC)使用特征引物擴(kuò)增后，利用凝膠電泳條帶的有無(wú)來(lái)判斷，樣品的檢出情況如下表3所示。

結(jié)果表明，污水廠污水等樣品中ARGs的檢出率均超過(guò)67%，5種ARGs檢出率達(dá)90%以上，其中tetC、sul1、sul2、ermB檢出率為100%；而污水廠空氣樣品檢出率均超過(guò)50%，且在曝氣池、污泥脫水間抗性基因檢出率100%，因此這些區(qū)域空氣質(zhì)量應(yīng)該予以重點(diǎn)關(guān)注。

表2 抗性基因qPCR引物信息Table 2 qPCR primer for antibiotic resistance genes analysis

2.2 抗性基因定量分析

選擇tetG、tetX、sul1、sul2等4種抗性基因，對(duì)污水廠空氣、污水污泥等樣品進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)后，根據(jù)樣品介質(zhì)、區(qū)域差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示。

由圖1中可知，空氣樣品中抗性基因相對(duì)濃度約為102～104copies·ng-1DNA，污水污泥樣品中相對(duì)濃度為104～107copies·ng-1DNA。空氣中微生物攜帶ARGs水平低于污水污泥微生物約2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。在污水污泥樣品中四環(huán)素抗性基因(tetG、tetX)的相對(duì)含量略高于磺胺類(lèi)抗性基因(sul1、sul2)，而在空氣介質(zhì)中磺胺類(lèi)抗性基因相對(duì)含量略高于四環(huán)素抗性基因。

根據(jù)取樣功能區(qū)域的不同，污水廠空氣樣品抗性基因定量結(jié)果如圖2所示。

表3 抗性基因定性結(jié)果Table 3 Qualitative results of antibiotic resistance genes (ARGs)

注：“+”表示檢出，“-”表示未檢出。

Note: ‘+’ positive, ‘-’negative.

圖1 污水廠不同區(qū)域抗性基因分布

圖2 污水廠空氣介質(zhì)抗性基因相對(duì)濃度分布

結(jié)果表明，在污水廠核心工藝單元(厭氧池、缺氧池、好氧池)區(qū)域空氣樣品抗性基因相對(duì)濃度高于其他區(qū)域，其中缺氧池(A5)的sul1、sul2濃度分別達(dá)到4.81×104 copies·ng-1DNA和5.0×104 copies·ng-1DNA，好氧池(A6)的tetX濃度達(dá)到了6.93×103 copies·ng-1 DNA。這可能是由于污水處理單元中增殖的攜抗性基因的微生物逸散至空氣介質(zhì)中所致。

3 討論(Discussion)

基于OTUs結(jié)果，采用PAST軟件對(duì)所有樣品進(jìn)行主成分分析(principal coordinate analysis, PCoA)，并將樣品進(jìn)行聚類(lèi)，用以初步研究不同樣品間的相似性和差異性。對(duì)21個(gè)樣品進(jìn)行主成分分析結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，21個(gè)樣品主要聚為四簇。第I簇為活性污泥及干化污泥樣品，第II簇為污水廠AAO工藝旁空氣樣，第III簇為預(yù)處理段進(jìn)水和附近空氣樣品，第IV簇為其他區(qū)域空氣樣。第I簇與第II簇距離較小，表明污水處理工藝單元的活性污泥對(duì)其臨近區(qū)域空氣有較大的影響，活性污泥中的微生物可通過(guò)工藝單元轉(zhuǎn)移至臨近的空氣介質(zhì)中。同樣結(jié)論在第III簇內(nèi)部也可以得到驗(yàn)證，進(jìn)水段空氣中微生物與進(jìn)水中的微生物有較高的親緣性，可能是由于該廠預(yù)處理段中包含的曝氣等工段在處理過(guò)程中將水中的微生物轉(zhuǎn)移至空氣介質(zhì)中。第IV簇中包含的居民區(qū)空氣樣品與污水廠其他區(qū)域空氣樣品距離較小，表明污水廠附近居民區(qū)空氣中微生物的種群特征與污水廠內(nèi)部分區(qū)域無(wú)明顯差異。

抗性基因定性結(jié)果顯示，污水廠的污水、污泥和空氣樣品中含有高檢出率的四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗性基因，這與相關(guān)抗生素在本地區(qū)的大量使用有較大的聯(lián)系。污水廠及周邊居民區(qū)空氣樣品中高濃度的抗性基因表明其污染在空氣介質(zhì)中已經(jīng)達(dá)到了普遍的污染水平?？諝饪剐曰虻亩拷Y(jié)果顯示，周邊居民區(qū)空氣樣品抗性基因濃度與污水廠園區(qū)內(nèi)空氣樣品濃度近似一致，且其濃度與距離污水處理工藝的距離有關(guān)，距離越大相差越大，故活性污泥中的抗性基因可能通過(guò)充氧曝氣等過(guò)程轉(zhuǎn)移至空氣中，造成了局部污染。

通過(guò)高通量數(shù)據(jù)分析可知，污水廠厭氧、缺氧、好氧等工藝段活性污泥與其臨近采樣點(diǎn)的空氣樣品有較高的親緣性，表明污水廠中曝氣、跌水、干燥等處理單元可能將污水污泥中的微生物轉(zhuǎn)移至空氣中。污水廠園區(qū)內(nèi)及周邊居民區(qū)的空氣樣品有較高的親緣性，可推斷出2種原因，一為污水廠作為其附近空氣介質(zhì)微生物污染的源頭，不僅影響到廠內(nèi)更影響到了附近的居民區(qū)，二是污水廠區(qū)及周邊居民區(qū)的空氣微生物受到大區(qū)域的微生物污染影響達(dá)到一致水平，其中的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)求證。

圖3 不同樣品基于Bray-Curtis距離的主成分分析

污水廠空氣介質(zhì)中的微生物及抗性基因污染具有隱秘性、長(zhǎng)期性的特點(diǎn)，由此對(duì)周邊居民健康產(chǎn)生的潛在威脅也極易被忽視，，因此對(duì)這一領(lǐng)域應(yīng)該給予更多的關(guān)注和重視。

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Distribution of Airborne Antibiotic Resistance Gene in Wastewater Treatment Plant

Gao Xinlei1, Shao Mingfei1, He Xiaomeng1, Ouyang Feng1, Shang dandan2, Li Ji1,*

1． Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen Key Laboratory of Water Resource Utilization and Environmental Pollution Control, Shenzhen 518055, China

2． Shenzhen Branch of Beijing Guohuan Tsinghua Environment Engineering Design and Research Institute, Shenzhen 518049, China

Received 28 May 2015 accepted 26 August 2015

The pollution level and concentration distribution of the typical antibiotic resistance genes (ARGs) in the air of WWTP were investigated, then their affinity and emission sources were traced using 16S rRNA based high-throughput sequencing in the present study. Results showed that the positive detection rates were higher than 50% for the eight target ARGs in the air samples of WWTP and four of them (tetC,sul1,sul2 andermB) were 100%. Moreover, all the ARGs in the air samples were 100% detected near the aeration tank and sludge dewatering tank. The quantitative analysis of four ARGs (sul1,sul2,tetGandtetX) showed that their relative concentration range is 102～105copies·ng-1DNA, which was comparable with that of the air samples in the residential area nearby. Cluster analysis based on 16S rRNA high-throughput sequencing indicated that microbial community in the air in residential area had a high similarity with that in the WWTP, and treatment process in WWTP had a significant influence on the microbial composition of its ambient environment.

ARGs; airborne bacteria; wastewater treatment plant

環(huán)保公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201309031);國(guó)家自然科學(xué)基金(31200104)；深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃(JCYJ2012061315435096)

高新磊(1987-)，男，博士研究生，研究方向?yàn)槲⑸餁馊苣z生化特征，E-mail:gaoxinleiuser@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: liji99@gmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150528006

2015-05-28錄用日期：2015-08-26

1673-5897(2015)5-089-06

X171.5

A

李繼(1973-)，男，哈爾濱工業(yè)大學(xué)深圳研究生院教授、博導(dǎo)，主要研究方向?yàn)楦吲欧艠?biāo)準(zhǔn)城市污水處理工藝、工業(yè)廢水處理、飲用水深度處理、空氣污染微生物、抗生素耐藥微生物及耐藥基因，已發(fā)表學(xué)術(shù)論文70余篇。

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