溫度對(duì)厭氧環(huán)境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響

錢(qián)燕云，鄭吉，徐莉柯，蘇超，陳紅

浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境工程研究所，杭州 310058

溫度對(duì)厭氧環(huán)境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響

錢(qián)燕云，鄭吉，徐莉柯，蘇超，陳紅*

浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境工程研究所，杭州 310058

抗性基因的轉(zhuǎn)移傳播使得污水處理廠成為其重要的儲(chǔ)存庫(kù)，對(duì)人類(lèi)健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)采用序批式厭氧反應(yīng)器，溫度設(shè)定分別為15 ℃、中溫(30 ℃和36 ℃)、高溫(50 ℃和60 ℃)，探究溫度對(duì)污泥厭氧條件下8種抗生素去除效果的影響，以及四環(huán)素類(lèi)抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)、磺胺類(lèi)抗性基因(sulI、sulII)和Ⅰ類(lèi)整合子整合酶基因(intI1)的行為特征。研究發(fā)現(xiàn)溫度升高有利于抗生素及抗性基因的去除，15 ℃、中溫和高溫下總抗生素的平均去除率分別為45%、59%和78%；15 ℃、中溫和高溫下四環(huán)素類(lèi)抗性基因分別削減0.52 log、0.90 log和1.50 log，磺胺類(lèi)抗性基因分別削減0.56 log、0.78 log和1.31 log。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，總抗性基因與總氮、氨氮、SCOD(溶解性COD)均存在顯著相關(guān)性(R2=0.744、0.760、0.315，P<0.05)，而與總磷無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。intI1與總氮、氨氮、SCOD皆存在顯著相關(guān)性(R2=0.698、0.795、0.269，P<0.05)，而與總磷無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。說(shuō)明微生物生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)元素一定程度上影響著抗性基因的傳播和擴(kuò)散。

抗生素；抗性基因；厭氧環(huán)境；溫度；序批式

20世紀(jì)以來(lái)，大量的抗生素被不合理、不規(guī)范地使用，其殘留給周?chē)h(huán)境中的細(xì)菌造成了一種選擇性壓力，使得篩選出的細(xì)菌耐藥性不斷增加，其中含有抗性的DNA片段是環(huán)境中抗性基因的重要來(lái)源[1]。醫(yī)用抗生素不能被人體吸收的部分可誘導(dǎo)腸道內(nèi)的微生物產(chǎn)生耐藥性從而形成耐藥菌株，它們隨糞便排出體外，通過(guò)垂直基因轉(zhuǎn)移和水平基因轉(zhuǎn)移[2]等作用傳播抗性，使得抗性細(xì)菌大量增殖，而這些含有抗性細(xì)菌的污水最終排入城市污水處理廠，并在污水處理廠中傳播擴(kuò)散，使得城市污水處理廠成為抗性基因和抗性細(xì)菌的儲(chǔ)存庫(kù)[3-5]。污水處理工藝并不能有效削減所有抗性細(xì)菌，其出水中仍含有一定豐度的抗性基因，排入自然水體給環(huán)境帶來(lái)了潛在威脅。Lapara等[6]對(duì)德魯斯海港、圣路易斯河中的抗性基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，城鎮(zhèn)污水處理廠經(jīng)三級(jí)處理過(guò)的污水是其水體中抗性基因的重要來(lái)源，即使是處理過(guò)的污水，其排放仍對(duì)地表水中抗性基因豐度影響很大。目前，污水處理廠主要采用活性污泥法處理污水，會(huì)產(chǎn)生大量的剩余污泥，據(jù)國(guó)家環(huán)境保護(hù)部測(cè)算，我國(guó)城市每年污泥產(chǎn)生量預(yù)計(jì)將近3 000萬(wàn)t(以含水率80%計(jì))。這些污泥經(jīng)填埋、露天堆放或土地利用后，其中的抗生素抗性基因會(huì)擴(kuò)散傳播進(jìn)入周?chē)h(huán)境和土壤中[7]。Munir等[8]研究發(fā)現(xiàn)污泥中含有高濃度的抗性基因和抗性細(xì)菌，高級(jí)污泥處理方法(厭氧消化和石灰石穩(wěn)定)相比于傳統(tǒng)污泥處理方法(脫水和重力濃縮)能很大程度上降低抗性基因的豐度。相比于出水，剩余污泥經(jīng)過(guò)農(nóng)業(yè)和土地應(yīng)用后，能夠釋放更多的抗性基因進(jìn)入環(huán)境，給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)更大的風(fēng)險(xiǎn)。

研究表明厭氧處理能有效削減污泥中的抗性基因。Ma等[9]研究了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下不同污泥消化條件對(duì)磺胺類(lèi)(sulI、sulII)，紅霉素類(lèi)(ermB、ermF)，四環(huán)素類(lèi)(tetO、tetW、tetC、tetG、tetX)抗性基因的影響，鑒于其作為預(yù)測(cè)抗性基因橫向轉(zhuǎn)移和多重耐藥性的指標(biāo)，同時(shí)也檢測(cè)了Ⅰ類(lèi)整合子基因(intI1)，研究表明固體停留時(shí)間延長(zhǎng)，有利于大部分抗性基因(sulI、sulII、tetC、tetG、tetX)的削減，而小部分抗性基因(tetW、ermB、ermF)的豐度反而有所升高。Ghosh等[10]比較研究了高溫和中溫厭氧消化對(duì)不同機(jī)理的四環(huán)素類(lèi)抗性基因(tetA、tetO、tetX)以及Ⅰ類(lèi)整合子(intI1)的去除效果。目前，四環(huán)素抗性基因主要有3種機(jī)理[11]：(1)編碼“外排泵”(tetA、tetB、tetC、tetG、tetL)，利用膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將細(xì)菌內(nèi)的抗生素排出細(xì)胞或轉(zhuǎn)移到外周胞質(zhì)內(nèi)來(lái)降低抗生素濃度[12]。(2)編碼核糖體保護(hù)蛋白(tetM、tetW、tetO、tetQ)，這些存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白可以保護(hù)核糖體免受四環(huán)素作用。(3)編碼一種修飾或鈍化四環(huán)素的酶(tetX)，使四環(huán)素失活。研究表明，不同機(jī)理的四環(huán)素類(lèi)抗性基因在厭氧消化過(guò)程中表現(xiàn)出不同的去除效率[10]。Diehl和Lapara[13]研究了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下不同溫度(22 ℃、37 ℃、46 ℃、55 ℃)對(duì)抗性基因(tetA、tetL、tetO、tetW、tetX)以及Ⅰ類(lèi)整合子基因(intI1)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，ARGs的去除效果增加。以上研究均能證明污泥厭氧處理是削減污泥中抗性基因的有效方法。其中，溫度控制污泥中微生物的活性，是重要的影響因素[14]。但大部分的研究主要是連續(xù)或半連續(xù)狀態(tài)的厭氧處理[9-10,13]，溫度對(duì)序批式厭氧消化反應(yīng)削減抗性基因影響的研究較少。

本研究采用序批式實(shí)驗(yàn)，裝置規(guī)模為1 L，分別在15 ℃、中溫(30 ℃和36 ℃)、高溫(50 ℃和60 ℃)下反應(yīng)50 d，過(guò)程中不添加任何物質(zhì)，定期測(cè)定其中的總氮、總磷，SCOD(溶解性COD)、氨氮變化，以及3種抗性機(jī)理的四環(huán)素類(lèi)抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)，磺胺類(lèi)抗性基因(sulI、sulII)。Ⅰ類(lèi)整合子(intI1)廣泛存在于污泥中，可能影響抗性基因的水平轉(zhuǎn)移，因此也作為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)基因之一。泥樣中測(cè)定的抗生素主要包括四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、氧四環(huán)素(OTC)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、甲氧芐氨嘧啶(TMP)。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，了解抗生素和抗性基因在厭氧反應(yīng)中的行為特征和溫度對(duì)其削減的影響。同時(shí)分析其中氮磷營(yíng)養(yǎng)元素與抗性基因以及intI1變化的相關(guān)性，探尋抗性基因在環(huán)境中傳播的潛在影響因素。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)采用序批式實(shí)驗(yàn)，用1 L的三口圓底燒瓶為發(fā)酵罐，水浴恒溫磁力攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠，中國(guó))來(lái)控制發(fā)酵溫度，并達(dá)到全混狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)污泥來(lái)自臨安城市污水處理廠的剩余污泥，含水率為99%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不添加任何物質(zhì)，為了保證微生物對(duì)水的消耗，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，加入少量去離子水。將該污泥分裝到5個(gè)1 L燒瓶中，用三腳架固定在水浴鍋中，燒瓶的一口通入盛有水的錐形瓶，觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否有氣泡產(chǎn)生。向污泥中通氮?dú)?高純，杭州今工特種氣體有限公司)5 min，除去燒瓶中的空氣并檢查氣密性。設(shè)定恒溫水浴鍋的溫度分別為15 ℃、30 ℃、36 ℃、50 ℃、60 ℃，用蠕動(dòng)泵向水浴鍋中加水使得水浴鍋的水位線超過(guò)燒瓶中污泥的水位線，保證污泥的上下恒溫，觀察溫差在1 ℃以內(nèi)。

1.2 樣品采集及預(yù)處理

每個(gè)溫度樣品各取15 mL，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行50 d，對(duì)第0、10、15、20、30、40、50天樣品進(jìn)行采樣分析。將采集的樣品先用大容量冷凍離心機(jī)(Thermo公司，德國(guó))在10 000 r·min-1下冷凍離心10 min，上清液再用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾。收集濾膜，將濾膜與泥樣放入物料盤(pán)于-20 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷凍4～6 h后，使用真空冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限分公司，中國(guó))進(jìn)行凍干，將濾膜上的干污泥混入干燥的泥樣中，用研缽磨碎過(guò)篩(80目)后儲(chǔ)存?zhèn)溆?。收集濾液，進(jìn)行氮磷等的測(cè)定。

1.3 樣品水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

將收集的濾液及時(shí)測(cè)定SCOD、總氮、總磷、氨氮。SCOD采用重鉻酸鉀消解法，用智能型多功能消解器(蘭州連華環(huán)?？萍加邢薰荆袊?guó))在150 ℃下消解2 h后，DR5000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京安恒測(cè)試技術(shù)有限公司，中國(guó))測(cè)定其吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得SCOD值?？偟獪y(cè)定采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)?？偭诇y(cè)定采用鉬酸銨分光光度法(GB11893—89)。氨氮測(cè)定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)。

1.4 超高液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜

本實(shí)驗(yàn)采用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)測(cè)定泥樣中8種抗生素(TC、CTC、OTC、SD、SMX、SM1、SM2、TMP)濃度[15]。樣品預(yù)處理，取0.08 g過(guò)篩(80目)后干污泥，采用震蕩-超聲-離心法萃取抗生素，用超純水稀釋至800 mL，使得甲醇含量在2%以下。經(jīng)過(guò)稀釋后的提取液采用固相萃取方法進(jìn)行進(jìn)一步凈化提純。使用氮?dú)獯蹈蓛x(天津市東康科技有限公司，中國(guó))吹至2 mL以下，用甲醇∶水(V∶V=1∶1)定容至5 mL。處理好的樣品密封避光儲(chǔ)存在-20 ℃，40 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)前，添加內(nèi)標(biāo)物溶液。樣品的測(cè)定采用的超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為Waters Acquity TM Ultra Performance LC串聯(lián)Quattro Premier Micromass(Waters, USA)，色譜分析柱為Waters AcquityTM UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，電離源為電噴霧電離源(ESI)，檢測(cè)器為Quattro Premier Micromass，MRM檢測(cè)模式，Masslynx 4.0工作站(美國(guó)Waters公司)。為了比較完全的消除基質(zhì)干擾效應(yīng)，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，通過(guò)檢測(cè)后內(nèi)標(biāo)物峰面積、待測(cè)物峰面積的比值，同時(shí)配置內(nèi)標(biāo)工作曲線，從內(nèi)標(biāo)物工作曲線中得到實(shí)際樣品的濃度。

1.5 定量PCR

本實(shí)驗(yàn)使用FastDNA Spin Kit Forsoil試劑盒提取DNA，用微量蛋白質(zhì)核算分析儀測(cè)定提取后所得樣品DNA的濃度和純度。試驗(yàn)中選擇了四環(huán)素類(lèi)抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)、磺胺類(lèi)抗性基因(sulI、sulII)、Ⅰ類(lèi)整合子整合酶基因(intI1)以及16S rRNA進(jìn)行檢測(cè)。定量PCR反應(yīng)在StepOne Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(ABI，USA)中進(jìn)行。反應(yīng)體系為7.5 μL SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3 μL ROX Reference溶液，0.3 μL濃度為10 μmol·L-1的正向引物，0.3 μL濃度為10 μmol·L-1的反向引物，4.6 μL ddH2O，2 μL DNA模板。定量PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃下熱變性30 s；然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段，包括95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，延伸的同時(shí)掃描熒光信號(hào)。溶解曲線程序?yàn)?5 ℃至95 ℃之間，每0.5 ℃讀數(shù)，其間停留30 s。每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)每一輪擴(kuò)增掃描到的信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)強(qiáng)弱得出樣品中抗性基因的濃度，反應(yīng)結(jié)果也可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中抗性基因的濃度。表1為本實(shí)驗(yàn)中的引物和PCR條件。

表1 本實(shí)驗(yàn)中的引物和PCR條件Table 1 Primer and PCR conditions used in this study

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

對(duì)臨安污水處理廠剩余污泥進(jìn)行為期1個(gè)月的采樣，采樣頻率為每周1次。樣品使用專(zhuān)用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，普通PCR擴(kuò)增得到目的基因，然后用商業(yè)化凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，測(cè)定DNA含量、純度并調(diào)節(jié)至合適濃度后連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入E. coli感態(tài)細(xì)胞DH5α ，將感態(tài)細(xì)胞涂于含有氨芐青霉素，X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～16 h，挑選陽(yáng)性克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果同NCBI網(wǎng)站的BLAST進(jìn)行序列同源性檢索比對(duì)(http://www.ncbi.nhn.nih.gov/blast/)。使用QIAGEN質(zhì)粒專(zhuān)用提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，微量核酸蛋白質(zhì)分析儀監(jiān)測(cè)提取質(zhì)粒的含量及純度，確保質(zhì)粒DNA的A260/A280比值在1.8左右。符合要求的質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算濃度(質(zhì)粒

濃度=(質(zhì)量/分子量)×6.02×1023)。將已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)⑶冶ＷC質(zhì)粒濃度在108～103之間，然后進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果經(jīng)StepOne Software(version 2.0)分析得到各抗性基因的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素變化規(guī)律

原始污泥中均檢出上述8種抗生素，其中3種四環(huán)素類(lèi)抗生素(TC、CTC、OTC)的檢出濃度較高，分別為1 185.3 μg·kg-1(干污泥)、1 003.2 μg·kg-1(干污泥)、2 639.1 μg·kg-1(干污泥)?；前奉?lèi)抗生素的檢出濃度較低，總濃度為910.8 μg·kg-1(干污泥)。相比于磺胺類(lèi)抗生素，四環(huán)素類(lèi)抗生素較易吸附于污泥顆粒上。抗生素的降解途徑主要是水解作用[21-22]。

圖1 不同溫度下厭氧環(huán)境污泥中抗生素的濃度變化

圖1為不同溫度下抗生素的變化趨勢(shì)，15 ℃、中溫(30 ℃、36 ℃)和高溫(50 ℃、60 ℃)下總抗生素的平均去除率分別為45%、59%和78%。其中四環(huán)素類(lèi)抗生素的去除效果較好，15 ℃、中溫、高溫下的平均去除率分別為46%、60%和81%?；前奉?lèi)抗生素中SD、SM2和TMP的原始濃度較低但降解較多，SM1基本沒(méi)有降解，15 ℃、中溫、高溫下總磺胺類(lèi)抗生素的平均去除率分別為41%、51%和59%?？梢钥闯?，抗生素的降解效果隨溫度的升高而升高。

2.2 抗性基因變化規(guī)律

原始污泥中均檢出8種四環(huán)素類(lèi)目標(biāo)抗性基因，其中tetG的濃度較高，達(dá)到1010copies·g-1(干污泥)，這與Auerbach等[4]的研究一致。圖2為不同溫度下四環(huán)素類(lèi)抗性基因的變化趨勢(shì)，由圖可知溫度升高對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗性基因的削減效果影響顯著，15 ℃、中溫(30 ℃、36 ℃)和高溫(50 ℃、60 ℃)下分別削減0.52 log、0.90 log和1.50 log，但不同抗性機(jī)理的抗性基因表現(xiàn)不一致。編碼“外排泵”基因(tetA、tetG、tetL)中tetA和tetG的變化趨勢(shì)相似，相比于中溫，高溫下該類(lèi)抗性基因(除tetL)的去除效果更佳，分別削減1.55 log和2.20 log。高溫對(duì)tetL的影響與其他基因不同，原因在于其主要存在于革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)論在厭氧還是好氧條件下，溫度升高對(duì)其的削減影響均不大[14]。4種編碼核糖體保護(hù)蛋白基因(tetM、tetW、tetO、tetQ)的變化趨勢(shì)相似，高溫均能促進(jìn)其削減，且在40 d時(shí)削減量達(dá)到最大，分別為1.12 log、2.23 log、1.39 log和0.97 log。其中tetO的削減力度最大，原因在于這類(lèi)抗性基因雖然來(lái)自相同作用機(jī)理，但是存在于不同種類(lèi)的微生物，tetO主要存在于好氧微生物，厭氧環(huán)境促進(jìn)其削減[13]。在反應(yīng)進(jìn)行到50 d時(shí)，只有高溫下的tetM、tetO和tetQ濃度部分回升，分別回升0.49 log、0.84 log和0.54 log。編碼鈍化酶基因tetX的變化趨勢(shì)與編碼核糖體保護(hù)蛋白基因相似，高溫下削減效果更佳，在40 d時(shí)削減量達(dá)到最大，15 ℃、中溫和高溫下分別為0.75 log、1.37 log和2.64 log。反應(yīng)50 d時(shí)，各個(gè)溫度下的tetX濃度都有所回升，平均回升為0.33 log。 污泥中同樣檢出了2種磺胺類(lèi)抗性基因(sulI、sulII)，且兩者濃度很高，分別為2.7×1010copies·g-1(干污泥)和1.3×1010copies·g-1(干污泥)。圖3為不同溫度下磺胺類(lèi)抗性基因的變化趨勢(shì)，由圖可知溫度對(duì)磺胺類(lèi)抗性基因影響顯著，15 ℃、中溫和高溫下分別削減0.56 log、0.78 log和1.31 log。sulI和sulII的表現(xiàn)一致，高溫均能促進(jìn)其削減，在反應(yīng)40 d時(shí)削減量最大，分別為1.07 log和1.86 log，sulII比sulI削減力度更大。但反應(yīng)50 d時(shí)，各個(gè)溫度下的sulI和sulII都出現(xiàn)了少量回升，sulI平均回升0.18 log，sulII平均回升0.07 log。

圖3 不同溫度下厭氧環(huán)境污泥中磺胺類(lèi)抗性基因的變化趨勢(shì)

圖4 不同溫度下厭氧環(huán)境污泥中I類(lèi)整合子的變化趨勢(shì)

Ⅰ類(lèi)整合子(intI1)是允許細(xì)菌結(jié)合外生基因盒并調(diào)節(jié)其表達(dá)的基因片段，對(duì)大部分抗性基因的交流和整合起重要作用[23]。圖4為不同溫度下污泥中intI1的變化趨勢(shì)，15 ℃、中溫和高溫下分別削減0.50 log、0.99 log和1.93 log。但反應(yīng)50 d時(shí)各個(gè)溫度下平均回升0.15 log，這與磺胺類(lèi)抗性基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果相似。目前研究表明高溫對(duì)Ⅰ類(lèi)整合子具有一定的去除效果[9-10,13]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

污泥中細(xì)胞外的DNA會(huì)被水解和生物降解，其降解速率隨溫度的升高而升高，胞外DNA中含有一定數(shù)量的抗性基因，因此高溫相對(duì)于中溫對(duì)胞外抗性基因的去除更有效。除此之外，溫度影響著微生物體內(nèi)的酶活性，改變酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞合成。溫度升高，微生物生長(zhǎng)繁殖可能受限制，微生物種類(lèi)數(shù)量也會(huì)有差異。污泥中微生物多樣性豐富，高密度的生物量是橫向基因轉(zhuǎn)移的先決條件[24]，因此其中的抗性基因可能通過(guò)橫向基因轉(zhuǎn)移而擴(kuò)增，但也有部分抗性基因可能由于特異性而衰減，目前還沒(méi)有定論。本研究中溫度升高，有利于抗性基因的削減，這結(jié)論也在Ma等[9]的研究中得到印證。其變性梯度凝膠電泳(DGGE)結(jié)果顯示高溫下污泥中生物的多樣性比中溫下要低，而低多樣性減少了微生物通過(guò)橫向基因轉(zhuǎn)移找到合適宿主的可能性。生物群落的組成也能很大程度上影響抗性基因?qū)Νh(huán)境變化的響應(yīng)。反應(yīng)50 d時(shí)部分抗性基因有所回升，可能是因?yàn)檫m應(yīng)環(huán)境的微生物增殖而促進(jìn)縱向基因轉(zhuǎn)移，或者是因?yàn)棰耦?lèi)整合子的同樣回升而引起的橫向基因轉(zhuǎn)移。

2.3 相關(guān)性分析

微生物生長(zhǎng)與所在環(huán)境有密切關(guān)系，微生物所需的氮磷營(yíng)養(yǎng)元素一定程度上也影響著微生物的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)定期取樣，測(cè)其中的總氮(TN)、總磷(TP)、氨氮(NH3-N)和SCOD濃度，圖5為其在不同溫度下的變化趨勢(shì)，TP和SCOD濃度在15 ℃和中溫下呈下降趨勢(shì)，高溫下變化幅度很小但濃度較高。NH3-N和TN濃度在各個(gè)溫度下均呈上升趨勢(shì)，高溫下濃度也相對(duì)較高。

相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2，星號(hào)標(biāo)注表示兩者顯著相關(guān)(P<0.05)。由表可知，總抗性基因豐度與TN、NH3-N和SCOD皆存在顯著相關(guān)性，其中與TN和NH3-N的相關(guān)性系數(shù)較高(R2=0.745、0.760，P<0.01)。所有的抗性基因與TN、NH3-N均存在相關(guān)性，其中tetA與這兩者的相關(guān)性系數(shù)最高(R2=0.839、0.809，P<0.01)。所有的抗性基因與TP都不存在顯著相關(guān)性。大部分抗性基因與SCOD皆存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。微生物細(xì)胞中大約含氮5%～13%，是微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要成分，同時(shí)氮源也能提供部分能量供微生物生長(zhǎng)，因此在外界不提供氮源的情況下氨氮等氮源物質(zhì)對(duì)微生物的行為影響很大，微生物對(duì)氮源的需求量也大，從而在一定程度上影響了抗性基因的擴(kuò)增、削減和轉(zhuǎn)移。磷等無(wú)機(jī)鹽參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)組成，并與能量轉(zhuǎn)移、細(xì)胞透性調(diào)節(jié)功能有關(guān)，微生物對(duì)其的需求量在10-4～10-3mol·L-1，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得磷的濃度均大于10-3mol·L-1，因此該厭氧反應(yīng)過(guò)程中磷濃度變化對(duì)微生物的影響較小。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)Ⅰ類(lèi)整合子(intI1)與TN、NH3-N和SCOD皆存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，其中與TN和NH3-N的相關(guān)性系數(shù)較高(R2=0.698、0.795，P<0.01)，這與總抗性基因表現(xiàn)一致。intI1對(duì)細(xì)菌間的基因轉(zhuǎn)移起重要作用，營(yíng)養(yǎng)元素與其相關(guān)性顯著說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)元素一定程度上也影響著抗性基因的橫向轉(zhuǎn)移，但抗性基因的傳播機(jī)制復(fù)雜，仍需進(jìn)一步探究。

圖5 不同溫度下厭氧環(huán)境污泥TN、TP、NH3-N和SCOD的變化趨勢(shì)

表2 抗性基因與SCOD、NH3-N、TN、TP的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of ARGs and SCOD, NH3-N, TN and TP

注：*表示兩者具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。

Note: Asterisk means there was a significant correlation of ARGs and SCOD, NH3-N, TN and TP.

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Effect of Temperature on Antibiotic Resistance Genes Behavior During Anaerobic Treatment of Sludge

Qian Yanyun, Zheng Ji, Xu Like, Su Chao, Chen Hong*

Department of Environmental Engineering, College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Received 11 October 2015 accepted 3 December 2015

Sewage treatment plant became the important storage depot of antibiotic resistance genes (ARGs) because of the transfer and spread of ARGs, which may bring the potential risk to human health. In this study, sequencing batch anaerobic digestion is the main experimental method. Operating temperatures of anaerobic condition were 15 ℃ , 30 ℃, 36 ℃, 50 ℃ and 60 ℃. In the process, liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was taken to analyze 8 kinds of antibiotics concentrations in the sludge samples. The abundances of tetracycline resistance genes (tetA, tetG, tetL, tetM, tetO, tetQ, tetW, tetX), sulfonamide resistance genes (sulI, sulII) and class 1 integron (intI1) were quantified by real-time polymerase chain reaction. The results showed that the degradation rate of antibiotics increased as the temperature increased. The average removal rates of total antibiotics under 15 ℃, mesophilic condition (30 ℃, 36 ℃) and thermophilic condition (50 ℃, 60 ℃) were 45%, 59% and 78%, respectively. The reductions of total tet genes under 15 ℃, mesophilic condition and thermophilic condition were 0.52 log, 0.90 log and 1.50 log, while for sul genes the reductions were 0.56 log, 0.78 log and 1.31 log, respectively. Correlation analysis showed, total resistance genes had positive correlations with TN, NH3-N and SCOD (R2=0.744, 0.760 and 0.315, P<0.05), while they had no correlations with TP (P>0.05). intI1 had positive correlations with TN, NH3-N and SCOD (R2=0.698, 0.795 and 0.269, P<0.05), while they had no correlations with TP (P>0.05). Nutrient elements in environment influenced the transfer and spread of ARGs in a degree.

antibiotics; antibiotic resistance genes; anaerobic; temperature; sequencing batch

國(guó)家重大水專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX07101-012)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21277117)

錢(qián)燕云(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲廴究刂萍百Y源化技術(shù)，E-mail: aileen@zju.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chen_hong@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897. 20151011001

2015-10-11錄用日期：2015-12-03

1673-5897(2015)5-056-10

X171.5

A

陳紅(1969—)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)槲廴究刂萍百Y源化技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)。

錢(qián)燕云, 鄭吉, 徐莉柯, 等. 溫度對(duì)厭氧環(huán)境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(5): 56-65

Qian Y Y, Zheng J, Xu L K, et al. Effect of temperature on antibiotic resistance genes behavior during anaerobic treatment of sludge [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 56-65 (in Chinese)