初始pH對(duì)厭氧環(huán)境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響

錢燕云，徐莉柯，蘇超，鄭吉，陳紅

浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境工程研究所，杭州 310058

初始pH對(duì)厭氧環(huán)境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響

錢燕云，徐莉柯，蘇超，鄭吉，陳紅*

浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院環(huán)境工程研究所，杭州 310058

污水處理廠產(chǎn)生大量的剩余污泥中含有豐富的抗性基因，給環(huán)境帶來(lái)了潛在風(fēng)險(xiǎn)。以城市污水處理廠的剩余污泥為研究對(duì)象，在不同初始pH(對(duì)照組、初始pH=3、5、7、9、11)下觀察厭氧條件下，8種抗生素濃度以及四環(huán)素類抗性基因(tet A、tet G、tet L、tet M、tet O、tet Q、tet W、tet X)、磺胺類抗性基因(sulI、sul II)和Ⅰ類整合子(intI 1)的行為特征。研究結(jié)果顯示，初始pH對(duì)抗生素的降解影響較小，污泥中總抗生素的平均去除率為42%。對(duì)照組及初始pH為3、5、7、9、11下的總四環(huán)素類抗性基因分別削減0.65 log、0.96 log、0.75 log、0.62 log、0.86 log和0.98 log。不同四環(huán)素類抗性基因表現(xiàn)相似，在初始pH=3和初始pH=11下部分抗性基因削減較多，特別是tet A、tet G、tet L、tet O和tet X。2種磺胺類抗性基因均無(wú)削減，濃度平均上升0.18 log。相關(guān)性分析顯示，總抗性基因與TN、NH3-N、TP、SCOD(溶解性COD)均存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。上述研究結(jié)果為污泥厭氧消化中抗生素抗性基因減量條件提供參考依據(jù)。

抗生素；抗性基因；污泥；初始pH；厭氧環(huán)境；序批式

抗生素特別是醫(yī)用和獸用抗生素的大量使用和濫用，給環(huán)境中的細(xì)菌造成了長(zhǎng)期的選擇性壓力，使得環(huán)境中的抗性細(xì)菌和抗性基因的豐度不斷增加，從而給人類的健康帶來(lái)了潛在的風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前已有大量研究表明，污水處理廠中含有高濃度的抗性基因和抗性細(xì)菌，因此污水處理廠已成為抗性細(xì)菌增殖和擴(kuò)散的聚集地[2-4]。Marti等[5]研究了污水處理廠的出水對(duì)附近河流中抗性基因和細(xì)菌群落組成的影響，發(fā)現(xiàn)污水處理廠排水點(diǎn)的河流下游比上游，在抗性基因的數(shù)量上明顯增高，細(xì)菌群落組成也有很大的區(qū)別，這表明污水處理廠的出水可能促進(jìn)了抗性基因傳播到環(huán)境中并且影響受納水體的細(xì)菌群落組成。Ben等[6]研究發(fā)現(xiàn)，污泥的吸附作用使水中的抗生素易轉(zhuǎn)移到污泥中，故相比于污水，污泥中抗生素濃度更高，而污泥中抗性基因的濃度也更高[7-8]。目前，剩余污泥主要的處置措施是填埋或土地利用，這又給周圍環(huán)境和土壤造成了很大的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[9]。采用污泥處理技術(shù)對(duì)污泥進(jìn)行預(yù)處理以有效減少污泥中抗性基因的含量成為新的研究方向，也具有一定的實(shí)踐意義。Burch等[10]研究了空氣干燥床對(duì)市政污水處理廠剩余污泥中抗性基因(erm B、sulI、tetA、tetW、tetX)和Ⅰ類整合子(intI1)的削減影響，結(jié)果顯示空氣干燥床可以削減所有目的基因，削減量范圍為1～5個(gè)數(shù)量級(jí)。之后，Burch等[11]又采用半連續(xù)傳統(tǒng)好氧消化技術(shù)處理剩余污泥以削減其中的抗性基因，研究發(fā)現(xiàn)tetA、tetW和erm B的削減超過(guò)了90%，intI1沒(méi)有減少，tetX反而增加了5倍。半連續(xù)模式之后改為序批式來(lái)確定一級(jí)削減系數(shù)，半衰期范圍為2.8～6.3 d。該結(jié)果表明好氧消化可以用來(lái)削減污泥中的抗性基因，但削減率根據(jù)反應(yīng)器設(shè)計(jì)和特定的抗性基因不同變化很大，而且這個(gè)衰減速率比土地利用更快。

除此之外，另有研究證明污泥厭氧處理可以有效地減少污泥中高濃度的抗性基因[12-14]，pH也影響著污泥在厭氧反應(yīng)中的微生物群落[15]，但pH對(duì)污泥中抗性基因行為特征影響的研究還比較少。因此，本研究采用1 L體積的序批式實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)置污泥的初始pH為3、5、7、9、11，測(cè)定8種抗生素(四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、氧四環(huán)素(OTC)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、甲氧芐氨嘧啶(TMP))、四環(huán)素類抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)、磺胺類抗性基因(sulI、sulII)以及Ⅰ類整合子(intI1)在厭氧環(huán)境下的變化特征，同時(shí)測(cè)定總氮、總磷、SCOD(溶解性COD)和氨氮，探尋氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素與抗性基因以及intI1之間的相關(guān)性。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

本實(shí)驗(yàn)采用1 L的三口圓底燒瓶為發(fā)酵罐，水浴恒溫磁力攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠，中國(guó))來(lái)保證消化溫度恒定，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速使裝置中污泥達(dá)到全混狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)污泥取自臨安城市污水處理廠的剩余污泥，加入去離子水，使得含固率在3%～5%之間，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。之后，將污泥分裝到6個(gè)1 L的發(fā)酵罐中，攪拌1 d以達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)，測(cè)定其初始pH為7.61，加入一定量的HCl(化學(xué)純，中國(guó)國(guó)藥有限公司)和NaOH(化學(xué)純，中國(guó)國(guó)藥有限公司)調(diào)節(jié)pH分別為3、5、7、9、11，并設(shè)置對(duì)照組。密封發(fā)酵罐，將發(fā)酵罐一口通入盛有水的錐形瓶，觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否有氣泡產(chǎn)生。向裝置中通氮?dú)?高純，杭州今工特種氣體有限公司)5 min，除去其中的空氣并檢查裝置氣密性。恒定溫度設(shè)為35℃的中溫條件，控制溫差在1 ℃左右。

1.2 樣品的采集及預(yù)處理

在第0、5、10、20、30、40、60天(實(shí)驗(yàn)周期為60 d)進(jìn)行采樣，每個(gè)發(fā)酵罐各取15 mL，并進(jìn)行分析。采集的樣品先用大容量冷凍離心機(jī)(Thermo公司，德國(guó))在10 000 r·min-1、4 ℃下冷凍離心10 min，上清液再用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾。之后及時(shí)收集濾液，并測(cè)定其中的總氮、總磷、SCOD和氨氮，將濾膜和濕泥樣放入物料盤在真空冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技有限分公司，中國(guó))中預(yù)凍4～6 h，然后凍干12 h，將濾膜上的干污泥與干燥的泥樣混合，磨碎過(guò)篩(80目)后儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 樣品中水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

pH測(cè)定采用pH值測(cè)試儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))。SCOD測(cè)定采用重鉻酸鉀消解法，使用智能型多功能消解器(蘭州連華環(huán)?？萍加邢薰?，中國(guó))，使樣品在150 ℃下消解2 h后，再用DR5000紫外可見分光光度計(jì)(北京安恒測(cè)試技術(shù)有限公司，中國(guó))測(cè)定其吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得SCOD值?？偟獪y(cè)定采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ636—2012)。氨氮測(cè)定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)?？偭诇y(cè)定采用鉬酸銨分光光度法(GB11893—89)。

1.4 超高液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜

泥樣中8種抗生素(TC、CTC、OTC、SD、SMX、SM1、SM2、TMP)含量的測(cè)定采用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)[16]。首先對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，稱取冷凍干燥過(guò)篩后的干污泥0.08 g，采用震蕩-超聲-離心法萃取抗生素，重復(fù)3次，并用超純水稀釋至800 mL左右，目的是降低甲醇含量至2%以下。之后采用固相萃取法將稀釋后的提取液進(jìn)一步凈化提純，使用氮?dú)獯蹈蓛x(天津市東康科技有限公司，中國(guó))將洗脫液吹至2 mL以下，用甲醇∶水(V∶V=1∶1)定容至5 mL。預(yù)處理后的樣品需要密封避光儲(chǔ)存于-20 ℃，并在40 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)前，添加內(nèi)標(biāo)物溶液。超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀為Waters Acquity TM Ultra Performance LC串聯(lián)Quattro Premier Micromass(Waters, USA)，色譜分析柱為Waters AcquityTM UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，檢測(cè)器為Quattro Premier Micromass，電離源為電噴霧電離源(ESI)，采用MRM檢測(cè)模式，Masslynx 4.0工作站(美國(guó)Waters公司)。定量方法為同位素內(nèi)標(biāo)法，可以消除其中基質(zhì)干擾效應(yīng)，根據(jù)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)物峰面積、待測(cè)物峰面積的比值，結(jié)合內(nèi)標(biāo)工作曲線得到實(shí)際樣品的濃度。

1.5 熒光定量PCR

本實(shí)驗(yàn)首先采用FastDNA Spin Kit Forsoil試劑盒提取樣品中的DNA，并用微量蛋白質(zhì)核酸分析儀測(cè)定DNA的濃度和純度。目的基因?yàn)樗沫h(huán)素類抗性基因(tetA、tetG、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetX)、磺胺類抗性基因(sulI、sulII)、Ⅰ類整合子整合酶基因(intI1)以及16S rRNA。定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行。反應(yīng)體系為7.5 μL的SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3 μL的ROX Reference溶液，0.3 μL濃度為10 μmol·L-1的正向引物，0.3 μL濃度為10 μmol·L-1的反向引物，4.6 μL的ddH2O，2 μL的DNA模板。定量PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃下熱變性30 s；然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段，95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，延伸的同時(shí)掃描熒光信號(hào)，溶解曲線程序?yàn)?5 ℃至95 ℃，每個(gè)樣品3次重復(fù)，根據(jù)測(cè)得的Ct值對(duì)照同批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品中抗性基因的濃度。表1為本實(shí)驗(yàn)中的引物和PCR條件。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)臨安污水處理廠剩余污泥進(jìn)行每周1次為期1個(gè)月的采樣，用DNA提取試劑盒提取DNA，并通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的基因。之后采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，測(cè)定其DNA含量和純度并調(diào)節(jié)至合適濃度，將調(diào)節(jié)后的DNA連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)入E. coli感態(tài)細(xì)胞DH5α。然后將感態(tài)細(xì)胞接種到含有氨芐青霉素，X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為12～16 h。挑選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nhn.nih.gov/blast/)上進(jìn)行Blast序列同源性比對(duì)。質(zhì)粒提取采用QIAGEN質(zhì)粒專用提取試劑盒，微量核酸蛋白質(zhì)分析儀監(jiān)測(cè)提取質(zhì)粒的含量及純度，并確保質(zhì)粒DNA的A260/A280比值在1.8左右。將符合要求的質(zhì)粒作為該基因的標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算濃度(質(zhì)粒濃度=(質(zhì)量/分子量)×6.02×1023)。將已知濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍稀釋，保證質(zhì)粒濃度梯度在108～103ng·μL-1之間，然后進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果采用Bio-Rad iQ5軟件分析得到各抗性基因的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素變化規(guī)律

實(shí)驗(yàn)污泥均檢測(cè)出上述8種抗生素，且四環(huán)素類抗生素濃度明顯高于磺胺類抗生素。四環(huán)素類抗生素中氧四環(huán)素(OTC)濃度最高，達(dá)到1 633.3 μg·kg-1(干污泥)，四環(huán)素(TC)和金霉素(CTC)的濃度分別為620.3 μg·kg-1(干污泥)和639.1 μg·kg-1(干污泥)?；前奉惪股刂谢前芳讎f唑(SMX)檢出含量最高，達(dá)到376.5 μg·kg-1(干污泥)?；前范奏奏?SM2)的檢出濃度最低，低于50 μg·kg-1(干污泥)，磺胺甲基嘧啶(SM1)和磺胺嘧啶(SD)的濃度也相對(duì)較低，在70～100 μg·kg-1(干污泥)之間。該檢出結(jié)果與Zhou等[22]對(duì)廣東2個(gè)污水處理廠污泥中抗生素的檢測(cè)結(jié)果一致，四環(huán)素類抗生素顯著較高，特別是氧四環(huán)素，因?yàn)樵擃惪股匾孜皆谖勰嗌希胰祟悓?duì)四環(huán)素類抗生素的使用率更高?；前奉惪股睾枯^低，因?yàn)樵擃惪股刂饕陨锝到鉃橹?，不易吸附在污泥上。抗生素的降解主要是依靠水解作用，環(huán)境條件的變化很大程度上影響著抗生素的降解[23]。

表1 本實(shí)驗(yàn)中的引物和PCR條件Table 1 Primer and PCR conditions used in this study

圖1 不同初始pH下厭氧環(huán)境污泥中抗生素的濃度變化

圖2 不同初始pH下厭氧環(huán)境污泥中四環(huán)素類抗性基因的變化趨勢(shì)

如圖1為不同初始pH下抗生素的變化趨勢(shì)，初始pH對(duì)抗生素的降解影響不顯著(P>0.05)，污泥中的部分抗生素得到削減。反應(yīng)過(guò)程中總抗生素的平均去除率為42%，其中四環(huán)素類抗生素平均去除率為40%，磺胺類抗生素為43%，大部分抗生素仍殘留在污泥 中。

2.2 抗性基因變化規(guī)律

在原始污泥中，使用定量和定性PCR，均未檢測(cè)出tetQ，而其中tetX的檢出濃度最高，達(dá)到1.0×108copies·g-1(干污泥)，tetA和tetG的濃度也較高，達(dá)到107copies·g-1(干污泥)，tetL的濃度最低，為5.1×105copies·g-1(干污泥)。該檢測(cè)結(jié)果與Zhang等[24]對(duì)15個(gè)國(guó)內(nèi)外污水處理廠污泥中抗性基因的研究結(jié)果相似，15個(gè)污水處理廠的污泥樣品中也均未檢測(cè)到tetQ，而之前的研究顯示在污水處理廠、河流及土壤中均能檢測(cè)到tetQ[25-27]，該檢出差異的原因可能在于tetQ的轉(zhuǎn)移和傳播機(jī)制還不明確，不同的環(huán)境和不同的地域?qū)ζ湫袨樘卣鞯挠绊戄^大。本研究中，大部分抗性基因的削減幅度很小，tetL和tetW得到較大的削減。如圖2為不同初始pH下四環(huán)素類抗性基因的變化趨勢(shì)，對(duì)照組及初始pH為3、5、7、9、11下的四環(huán)素類抗性基因分別削減0.65 log、0.96 log、0.75 log、0.62 log、0.86 log和0.98 log。對(duì)照組及初始pH=7的裝置中，抗性基因呈下降趨勢(shì)，在20 d后基本無(wú)變化。初始pH為3、5、9、11的裝置中，不同抗性機(jī)理的四環(huán)素類抗性基因表現(xiàn)相似，總體呈波動(dòng)趨勢(shì)，在反應(yīng)前20天，抗性基因平均削減0.75 log，20～30 d抗性基因平均回升0.30 log，30 d后又平均削減0.44 log。在初始pH=3和初始pH=11下部分抗性基因削減較多(與對(duì)照組相比，P<0.05)，特別是編碼“外排泵”抗性基因(tetA、tetG、tetL分別平均削減0.97 log、0.94 log、1.64 log)，編碼核糖體保護(hù)蛋白基因中的tetO(平均削減1.04 log)，以及編碼修飾或鈍化四環(huán)素的酶基因tetX(平均削減1.11 log)。

在全部的污泥樣品中均檢測(cè)出2種常見的磺胺類抗性基因(sulI、sulII)，濃度分別為1.81×109copies·g-1(干污泥)、5.39×108copies·g-1(干污泥)。如圖3，反應(yīng)過(guò)程中磺胺類抗性基因均無(wú)削減，濃度反而平均上升0.18 log。各個(gè)初始pH下抗性基因變化趨勢(shì)相似，反應(yīng)前20天時(shí)，平均削減0.85 log，這與大部分四環(huán)素類抗性基因變化相似。但不同的是反應(yīng)超過(guò)20 d后，sulI、sulII濃度急劇上升，平均上升達(dá)1.02 log。初始pH=3和初始pH=11下磺胺類抗性基因濃度相對(duì)較低。

Ⅰ類整合子(intI1)是一段DNA片段，可嵌入外源基因盒并將它們轉(zhuǎn)換為能正確表達(dá)的功能性基因，可影響抗性基因的傳播[28]。本研究每個(gè)樣品中均檢測(cè)出高濃度的Ⅰ類整合子整合酶基因(intI1)，范圍在4.57×107copies·g-1(干污泥)～2.02×108copies·g-1(干污泥)之間。如圖4，intI1在不同初始pH下削減幅度較小，平均削減0.25 log。整體趨勢(shì)與磺胺類抗性基因相似。相比于其他初始pH，intI1在初始pH為3和11的裝置中的豐度較低，說(shuō)明在一定程度上改變污泥的酸堿性能改變微生物生長(zhǎng)環(huán)境，對(duì)細(xì)菌種屬有一定的選擇性，從而影響抗性基因的行為特征。

圖4 不同初始pH下厭氧環(huán)境污泥中Ⅰ類整合子的變化趨勢(shì)

微生物群落的結(jié)構(gòu)與環(huán)境條件相關(guān)聯(lián)，環(huán)境條件的變化會(huì)引起微生物種群的演替，這是微生物群落對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制。微生物可以生長(zhǎng)的pH范圍極廣，但絕大多數(shù)種類的細(xì)菌生活在pH 5.0～9.0之間。在反應(yīng)的前期，外界環(huán)境的酸堿性急劇變化，使得其中對(duì)酸堿耐受性差的微生物種群數(shù)量和活性受到了抑制，相關(guān)代謝功能出現(xiàn)衰退[29]。甚至有些功能微生物因不適應(yīng)環(huán)境而衰亡，細(xì)胞裂解釋放的DNA，與胞外的DNA被部分水解或者生物降解，而且在這個(gè)過(guò)程中新的優(yōu)勢(shì)種群還未形成。因此，反應(yīng)前20天，污泥中的抗性基因削減較多，且當(dāng)酸堿性越大，條件越惡劣，抗性基因削減越多。外界pH發(fā)生改變，但微生物細(xì)胞內(nèi)的pH相當(dāng)穩(wěn)定，一般接近中性。實(shí)驗(yàn)測(cè)得20 d后，各個(gè)裝置中的pH已經(jīng)接近中性，說(shuō)明微生物已經(jīng)適應(yīng)并改變了周圍環(huán)境，在此過(guò)程中可能又形成了新的優(yōu)勢(shì)菌群，為抗性基因提供更多的宿主，因此在20 d后抗性基因濃度有所回升，特別是磺胺類抗性基因。另外，intI1的回升可能引起了基因的橫向轉(zhuǎn)移，污泥環(huán)境中的高生物量及多樣性為橫向基因轉(zhuǎn)移提供更多的可能性[30]。除此之外，Calero-Ca′ceres等[31]研究發(fā)現(xiàn)污泥中的細(xì)菌噬菌體內(nèi)含有高濃度的抗性基因，噬菌體可以將抗性基因存儲(chǔ)在處理過(guò)的污泥中，即使是經(jīng)過(guò)厭氧處理的污泥。其中有些噬菌體會(huì)為抗性基因提供更多的宿主選擇，因此對(duì)抗性基因的傳播起重要作用。

2.3 相關(guān)性分析

微生物與周圍的環(huán)境具有復(fù)雜的相互影響和相互作用。pH的改變會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝也會(huì)影響周圍的環(huán)境。因此，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同初始pH下裝置中TN、TP、NH3-N和SCOD含量，觀察其變化規(guī)律，分析其與抗性基因變化的相關(guān)性。如圖5，SCOD和TP濃度變化呈下降趨勢(shì)，而NH3-N和TN總體呈上升趨勢(shì)。

微生物生長(zhǎng)環(huán)境的酸堿性改變，影響微生物膜表面電荷的性質(zhì)和膜的通透性，也可能改變污泥中某些有機(jī)化合物的離子化狀態(tài)，從而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[32]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)TN、NH3-N、TP、SCOD與抗性基因的相關(guān)性進(jìn)行分析結(jié)果如表2，星號(hào)標(biāo)注表示兩者具有顯著相關(guān)性(P <0.05)。由表可知，總抗性基因豐度與TN、NH3-N、TP、SCOD皆存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。單個(gè)抗性基因有tetW和sulII與TN、NH3-N、TP、SCOD存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，另外tetL、tetM、sulI與TP存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，tetA、tetG、sulI與SCOD存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。

圖5 不同初始pH下厭氧環(huán)境TN、TP、NH3-N和SCOD的變化趨勢(shì)

表2 抗性基因與SCOD、NH3-N、TN、TP的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of ARGs and SCOD, NH3-N, TN and TP

注：* 表示兩者具有顯著相關(guān)性(P<0.05)。

Note: Asterisk means there was a significant correlation of ARGs and SCOD, NH3-N, TN and TP.

此外，研究還發(fā)現(xiàn)intI1與TP、SCOD存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。污泥中微生物多樣性復(fù)雜，已有研究通過(guò)質(zhì)粒宏基因組分析證明了污水處理廠的污泥中含有高濃度的抗性基因以及移動(dòng)基因盒，在Ⅰ類整合子整合酶的作用下，細(xì)菌可能捕獲外源的基因盒，使得其中的抗性基因在整合子上游啟動(dòng)子的作用下得到表達(dá)，從而使細(xì)菌具有耐藥性，因此這些移動(dòng)基因盒一定程度上促進(jìn)了抗性基因的橫向轉(zhuǎn)移[33]。磷與intI1的顯著相關(guān)性，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)元素是抗性基因擴(kuò)散和傳播的影響因素，但具體影響程度和范圍仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Effect of Initial pH on Antibiotic Resistance Genes Behavior During Anaerobic Treatment of Sludge

Qian Yanyun, Xu Like, Su Chao, Zheng Ji, Chen Hong*

Department of Environmental Engineering, College of Environmental and Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Received 31 August 2015 accepted 12 October 2015

The residual sludge produced from sewage treatment plant contains high concentrations of antibiotic resistance genes (ARGs), which may bring the potential risk to the environment. In this study, residual sludge was operated at different initial pH (control group, 3, 5, 7, 9, 11) to investigate the fate of antibiotics and ARGs under anaerobic treatment. Antibiotics were analyzed by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and the abundances of tetracycline resistance genes (tetA, tetG, tetL, tetM, tetO, tetQ, tetW, tetX), sulfonamide resistance genes (sulI, sulII) and class 1 integron (intI1) were quantified by real-time polymerase chain reaction during the process. The results showed that initial pH had slight influence on the removal of antibiotics. The average removal of antibiotics was 42%. The removal rate of tet genes in the control group and the group at initial pH 3, 5, 7, 9, 11 were 0.65 log, 0.96 log, 0.75 log, 0.62 log, 0.86 log and 0.98 log, respectively. For sul genes, the abundance decreased and then increased by 0.18 log. Correlation analysis showed total resistance genes had positive correlations with TN, NH3-N, TP and SCOD (P<0.05).

antibiotics; antibiotic resistance genes; sludge; initial pH; anaerobic; sequencing batch

國(guó)家重大水專項(xiàng)(2014ZX07101-012)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21277117)

錢燕云(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲廴究刂萍百Y源化技術(shù)，E-mail: aileen@zju.edu.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chen_hong@zju.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897. 20150831001

2015-08-31錄用日期：2015-10-12

1673-5897(2015)5-047-09

X171.5

A

陳紅(1969—)，女，博士，教授，主要研究方向?yàn)槲廴究刂萍百Y源化技術(shù)和環(huán)境生物技術(shù)。

錢燕云, 徐莉柯, 蘇超, 等. 初始pH對(duì)厭氧環(huán)境下污泥中抗生素抗性基因行為特征的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(5): 47-55

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