紫色達利菊縮合單寧對大腸桿菌的抑制作用

劉秀麗 王玉璽 李元恒 許中軍 金 龍 ，4 侯勇躍*

(1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，呼和浩特 010031;2.加拿大農業(yè)與農業(yè)食品部列橋研究中心，列橋 T1J4B1，加拿大;3.中國農業(yè)科學院草原研究所，呼和浩特 010010;4.東北農業(yè)大學動物科學與技術學院，哈爾濱 150030)

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)O157∶H7是一種食源性致病菌，可引起人類腹瀉、出血性腸炎，部分病人很快轉為溶血性尿毒綜合征，病死率很高。大腸桿菌已嚴重威脅到人類的健康，成為全世界重要的公共衛(wèi)生問題之一。目前，世界上已有30多個國家報告有其感染的病例，尤其美國、加拿大和日本是流行較廣的國家。據報道，美國每年用于防治因此菌引起的疾病花費約為4.5億美元［1］。我國首次分離到大腸桿菌O157∶H7是在1986年江蘇省徐州市［2－3］，之后在其他14個省市都分離到了該病菌，但沒有引起爆發(fā)。在1999—2000年間，我國首次在江蘇淮北地區(qū)爆發(fā)了大規(guī)模由大腸桿菌O157∶H7引起的人感染并導致急性腎衰竭的疫情，病死率極高，1999年的病死率為87.37%;而2000年的病死率為89.47%，之后波及到安徽和河南等省份［3］。此次爆發(fā)也是世界上迄今為止規(guī)模最大，時間最長，發(fā)病原因最復雜，死亡人數最多的一次。反芻動物被認為是該致病菌的最主要宿主和傳播源［4－5］，因為放牧條件下糞便的長期暴露會造成環(huán)境的污染，或者是屠宰過程中攜帶者對畜產品的污染，到目前為止，還沒有有效的措施防治該病的發(fā)生，主要是以抑制該致病菌的排出為主，因此，認為尋找安全、綠色、無毒等的天然抗生素將成為有效的策略?？s合單寧(condensed tannins，CT)作為植物的次生代謝產物，具有抑制大腸桿菌生長的特性，已成為目前研究的熱點。紫色達利菊(purple prairie clover，Dalea purpurea Vent.，PPC)是一種適口性極好的豆科牧草，廣泛分布在北美草原上，具有較好的抗旱性，在營養(yǎng)生長期和盛花期的平均干物質消化率在50%～65%，而蛋白質的平均含量在12%～20%［6］。在植物的不同生長階段，動物都愿意采食。研究表明，PPC含有很高的CT，含量分布在58～94 g/kg DM［7］。CT 對大腸桿菌的抑制作用具有物種依賴性，研究顯示，從9種不同的牧草中分離的CT，僅僅在PPC中表現出了較強抗大腸桿菌 O157∶H7 生長的作用。Jin 等［8－9］連續(xù) 3 年對春、秋2季草場放牧試驗中的肉牛糞便研究發(fā)現，長期給牛飼喂PPC可以有效減少糞中大腸桿菌O157∶H7 的排出。Huang 等［10］也對羊進行了大腸桿菌抑制的體內試驗，口服接種5株大腸桿菌混合培養(yǎng)物后，在28 d內采集糞樣做平板涂布并計大腸桿菌數，發(fā)現飼喂PPC使羊排出的大腸桿菌數減少。但是，由于反芻動物復雜的消化系統(tǒng)，很難判斷CT對大腸桿菌發(fā)生作用的具體部位。

因此，本文在結合前人試驗研究［11－13］的基礎上，通過體外模擬反芻動物瘤胃和大腸環(huán)境，探討CT含量高的PPC在牛體內對大腸桿菌生長的影響。針對其所含CT對大腸桿菌抑制的研究，主要集中在對細胞外膜的通透性、蛋白質和脂質體的作用，對細胞凝聚、形態(tài)變化方面的影響［14］，本研究通過開展以非致病性大腸桿菌ATCC 25922為研究模型，以紅豆草所含CT作為對比，觀察PPC的CT對大腸桿菌細胞內膜的影響，來評價PPC的CT對大腸桿菌內膜通透性的影響，從而為闡明牧草所含CT抑制細菌細胞生長的機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和材料

試驗牛:帶有瘤胃瘺管的安格斯肉牛5頭，來自加拿大農業(yè)部萊斯布里奇研究中心養(yǎng)殖場，健康，正常喂養(yǎng)飼糧(其中沒有添加含有CT高的PPC和紅豆草)。

牧草:PPC、紅豆草和苜蓿(alfalfa)均為加拿大農業(yè)部萊斯布里奇研究中心反芻動物營養(yǎng)實驗室基地種植、采集并凍干，經帶1 mm篩孔粉碎機粉碎，備用。

PPC的CT和紅豆草的CT:加拿大農業(yè)部萊斯布里奇研究中心反芻動物營養(yǎng)實驗室提取，純度均大于98.0%。

試驗菌株:非致病性大腸桿菌(菌株ATCC 25922)和致病性大腸桿菌 O157∶H7(菌株H4420N和E318N的新鮮菌液按1∶1混合)均來自加拿大農業(yè)部萊斯布里奇研究中心的微生物保藏中心。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基的配制

主要試劑及培養(yǎng)基(麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和普通肉湯培養(yǎng)基)等均按使用說明進行配制，備用。

1.3 主要儀器設備

熒光顯微鏡(2420A，Leica，德國);紫外分光光度計(SP－8001，Metertech);微孔板讀數儀(Thermo，美國);96 孔微孔板(Coring，美國);高速離心機(SLA-1500，Thermo，美國);恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國);凍干機(Goldfisch，美國)

1.4 方法

1.4.1 體外模擬試驗評價PPC對肉牛瘤胃和大腸中大腸桿菌生長的抑制作用

實驗室測定PPC和苜蓿營養(yǎng)水平［15］相近(表1)，而只有 PPC含有高濃度 CT［8］，所以本試驗以PPC和苜蓿為底物來培養(yǎng)大腸桿菌，以比較二者在反芻動物瘤胃和大腸環(huán)境下的生長來評價PPC的抑菌效果。

1.4.1.1 菌種活化

將實驗室保存凍干菌種經常規(guī)方法進行活化3代后，備用。

1.4.1.2 PPC 對大腸桿菌在瘤胃中生長的抑制作用

晨飼前，從試驗牛取瘤胃液200 m L，用4層紗布進行過濾，濾液直接加入3 000 m L緩沖液［16］中，并放置在50℃磁力攪拌器上進行攪拌。一直保持通入CO2，維持厭氧環(huán)境。預先稱好用1 mm篩孔粉碎機粉碎的PPC和苜蓿牧草各200 mg，分別放入20 m L的螺口玻璃管中。取5 m L上述混合液，加入離心管中，同時加入100μL大腸桿菌菌懸液(105CFU/m L)，同時通 CO2，并將蓋子蓋好，37 ℃振搖(120 r/min)培養(yǎng)，并分別在 0、1.5、3.0、6.0、24.0 h 的時間點取樣，通過麥康凱培養(yǎng)基平板涂布，計大腸桿菌菌落數。每個樣3個重復， 涂布3個平板。共重復3次。

表1 盛花期苜蓿與PPC的營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Nutrient levels of alfalfa and PPC harvested at the full-flowering(DM basis)(n=5) g/kg

1.4.1.3 PPC 對大腸中大腸桿菌的抑制作用

取直腸糞樣 50 g，加緩沖液 1 000 m L［16］，攪拌，用紗布過濾到燒瓶中，50℃磁力攪拌器上攪拌，通入CO2，保持厭氧。預先稱好用1 mm篩孔粉碎機粉碎的PPC和苜蓿牧草各200 mg，分別放入20 m L的螺口玻璃管中。取5 m L上述液體加入到玻璃管中，每管中同時加入100μL菌液(105CFU/m L)，37 ℃振搖(120 r/m in)培養(yǎng)，并分別在 0、1.5、3.0、6.0、24.0 h 的時間點取樣，通過麥康凱培養(yǎng)基平板涂布，計大腸桿菌菌落數。每個樣品做3個重復，涂布3個平板。共重復3次。

1.4.2 PPC的CT對大腸桿菌內膜的影響

在前期研究中發(fā)現紅豆草的CT和PPC的CT都有抑菌作用，但PPC的CT對大腸桿菌的抑菌效果要比紅豆草CT強［16］。因此，為了解PPC的CT抑制大腸桿菌的作用機理，選擇了以紅豆草的CT為比對，觀察PPC的CT對大腸桿菌內膜的影響。

1.4.2.1 菌懸液制備

從普通瓊脂平板培養(yǎng)基上挑取單個菌落，接種到M 9培養(yǎng)基(M 9礦物質鹽11.28 g，酪蛋白氨基酸5 g，加去離子水到1 000 m L，溶解后，121℃高壓30 m in。再無菌加入已高壓30%葡萄糖15 m L，0.1 mol/L 氯化鈣溶液 1 m L，1 mol/L 硫酸鎂溶液2 m L，混勻即可)中。在細菌培養(yǎng)過程中，試驗組:分別加入PPC的CT和紅豆草的 CT［10μg/m L，此濃度的選擇是基于PPC的CT的最小抑菌濃度(m inimum inhibition concentration，M IC)(25%～50%)所設定］;對照組:不加入 CT培養(yǎng)的菌懸液。每組3個重復，培養(yǎng)3瓶，均培養(yǎng)10 h。收獲菌體，離心(15 600×g，10 m in)2 次;用pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)重懸菌體，并調整OD420 nm 為1.0，備用。

1.4.2.2 PPC 的 CT 對大腸桿菌內膜通透性的影響［17］

內膜通透性的測定是通過測定細菌細胞膜內釋放的β－D－半乳糖苷酶的能力來判斷。鄰－硝基苯－β－D－半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactoside，ONPG)是β－D－半乳糖苷酶的底物，它被酶水解后生成半乳糖和黃色的鄰－硝基苯酚(ONP)，ONP在410～420 nm處有紫外吸收。試驗組按19∶1混合菌懸液和ONPG溶液(30 mmol/L)，對照組用雙蒸水取代ONPG，放置在室溫(22℃)下，備用。旋渦混勻 30 s后，分別在 0、40、80、120、160 m in時取出2 m L，11 000×g離心3 m in。取上清液進行微孔板點樣，200μL/孔，在416 nm波長下進行讀數。

1.4.2.3 CT在不同pH條件下對細胞內膜通透性的影響［17］

大腸桿菌為兼性厭氧，最適生長pH為6.8～8.0，pH 低于 6.0 或高于 8.0 則生長緩慢。因此，在上述 1.4.2.1中所述的前處理中，對離心后的菌體進行重懸時，選擇利用不同 pH 的 PBS(5.3、6.8、7.4、8.0、9.0)，對在培養(yǎng)過程中經過處理的細菌菌體進行重懸，觀察不同情況下內膜通透性在不同時間點(0、40、80、120、160 m in)的變化。

1.4.2.4 CT 在不 同溫 度下 對 大 腸 桿 菌 內膜通透性的影響

在上述 1.4.2.1中所述的前處理中，對離心后的菌體進行重懸時，每個時間點的樣品分別分成2份，一份放置在室溫(22℃)，一份放置在4℃，觀察不同情況下內膜通透性在不同時間點(0、80、120、300 m in)的變化。

1.5 數據分析

試驗數據是經SAS 9.2分析軟件m ixed程序進行分析。處理為主要因素，試驗重復及每個試驗中的重復為隨機因素，每個時間點數據單獨分析，以P＜0.05作為差異顯著性的標準。

2 結果

2.1 PPC和苜蓿底物瘤胃環(huán)境中大腸桿菌生長的影響

如圖1所示，針對大腸桿菌ATCC 25922，在體外瘤胃液試驗的0～3.0 h取樣中，PPC對瘤胃液中大腸桿菌ATCC 25922的數量沒有表現出抑制作用，同苜蓿組變化基本一致，PPC組與苜蓿組無顯著差異(P＜0.05);在 6.0 h 取樣中發(fā)現，隨著細菌生長繁殖加快，同苜蓿組相比，PPC對大腸桿菌ATCC 25922生長表現出了抑制作用，數量顯著降低(P＜0.05);在 24.0 h 取樣中 PPC 仍然對大腸桿菌ATCC 25922表現出了抑制作用，數量顯著降低(P＜0.05)。針對大腸桿菌 O157∶H7，在 6 h 取樣中發(fā)現，隨著細菌生長繁殖加快，同苜蓿組相比，PPC對大腸桿菌O157∶H7生長表現出了抑制作用，數量顯著降低(P＜0.05);在 24.0 h 取樣中，隨著細菌本身數量的減少，與苜蓿組相比，PPC仍然對大腸桿菌O157∶H7生長表現出了抑制作用，數量顯著降低(P＜0.05)。

圖1 PPC和苜蓿底物對大腸桿菌ATCC 25922(a)和大腸桿菌O 157∶H 7(b)在瘤胃環(huán)境中生長的影響Fig.1 Influence of PPC and alfalfa substrates on grow th of E.coil ATCC 25922(a)and E.coil O157 ∶H7(b)in the rum inal condition

2.2 PPC和苜蓿底物對大腸環(huán)境中大腸桿菌生長的影響

如圖2所示，同苜蓿組相比，在0～24.0 h取樣中，隨著細菌的不斷生長繁殖、數量的持續(xù)增加，PPC對大腸中大腸桿菌ATCC 25922和大腸桿菌O157∶H7 生長表現出了抑制作用，在 1.5～24.0 h數量顯著降低(P＜0.05)。

2.3 PPC的 CT和紅豆草的 CT對大腸桿菌ATCC 25922細胞內膜通透性的影響

2.3.1 CT對細菌細胞內膜通透性的影響

如圖3所示，和無CT培養(yǎng)的菌懸液相比，隨著時間的增加，在培養(yǎng)大腸桿菌ATCC 25922過程中加入10μg/m L PPC的CT和紅豆草的CT的菌懸液有著較高的ONP含量，說明CT可以使細菌細胞內膜的通透性增加，膜內物質ONP不斷地釋放，但是2種CT間差別不大。

2.3.2 不同 pH條件下，CT對細菌細胞內膜通透性的影響

如圖 4所示，在 pH 為 5.3～9.0，2 種 CT 對大腸桿菌內膜通透性的變化趨勢并不一致。PPC所含CT對細菌細胞內膜的通透性影響最大，隨著pH的增加，環(huán)境由偏酸到偏堿，內膜通透性逐漸增大;而紅豆草中所含CT隨著pH的增加對內膜通透性的影響很小，尤其是在堿性和中性環(huán)境(pH 7.4、8.0、9.0)中，影響不大，在酸性環(huán)境(pH 5.3、6.8)中細胞內膜的通透性有所增加。

圖2 PPC和苜蓿底物對大腸桿菌ATCC 25922(a)和大腸桿菌O 157∶H 7(b)在大腸環(huán)境中生長的影響Fig.2 Influence of PPC and alfalfa substrates on grow th of E.coil ATCC 25922(a)and E.coil O157 ∶H7(b)in the large intestinal condition

圖3 PPC的CT和紅豆草的CT對大腸桿菌ATCC 25922細胞內膜通透性的影響Fig.3 Influence of CT from PPC and sainfoin on cell inner-membrane permeability of E.coil ATCC 25922

2.3.3 不同溫度條件下，CT對細菌細胞內膜通透性的影響

如圖5所示，不同溫度條件下，CT對大腸桿菌細胞內膜通透性均有變化。隨著時間的增加，加CT和無CT培養(yǎng)的細菌細胞內膜的通透性都是增加的。但是，在4℃條件下，經過CT培養(yǎng)的大腸桿菌的β－D－半乳糖苷酶的釋放量小，ONP含量增長非常緩慢，細菌生長明顯受到抑制;而在室溫條件下，隨著時間的延長，加CT培養(yǎng)的細菌細胞的內膜通透性增加;但當100 m in以后，經紅豆草的CT培養(yǎng)的細菌通透性有所下降。

3 討論

大腸是大腸桿菌在動物體內的主要寄宿處，試驗表明CT能在此處抑制其生長，具有重大意義。單就CT本身來說，將其同時置入反芻動物瘤胃和大腸環(huán)境下，其在大腸中抑菌作用要比在瘤胃中的大，因為瘤胃中的干擾因素較多，尤其是蛋白質的含量要高的多。而實際上，CT在大腸中的抑菌作用可能要受到其在前消化道中因素的影響，抑菌作用變小，因為動物采食含CT植物后，CT首先要在前消化道中和其他物質如蛋白質發(fā)生作用，從而削弱了它到大腸后的作用。Molan等［18］試驗表明 CT濃度大于400μg/m L時，大量的瘤胃微生物被抑制。已經被證實CT具有對瘤胃微生物細胞壁的結合作用，從而阻止其生長和降低蛋白酶的活性;通過與木質素結合，從而影響微生物對纖維素的利用，同時也可直接抑制瘤胃纖維素降解菌的生長。此外，由于CT具有結合蛋白質的能力，與飼料蛋白質結合從而減少了瘤胃微生物對氮的利用或者多酚與微生物細胞壁和微生物分泌的細胞外酶相結合，從而抑制微生物的大量增殖。當富含CT的飼草被動物咀嚼后，不溶的CT與其他底物結合物的生成，同時，在瘤胃的酸性環(huán)境中，CT有可能與細菌細胞結合成聚合體等［19］，都能間接影響微生物的生長。從紅豆草中提取的CT被發(fā)現對4種瘤胃細菌［溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)A38、牛鏈球菌(Streptococcus bovis)45S1、反芻獸普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)B14和嗜淀粉瘤胃桿菌(Ruminobacter amylophilus)WP225］細胞壁都有結合作用［19］，同時有試驗表明經反芻動物咀嚼后釋放的高濃度自由CT，能夠與瘤胃微生物釋放的酶相結合并抑制瘤胃碳水化合物的發(fā)酵［20］。在革蘭氏陽性(G+)細菌中也發(fā)現了CT對其生長和蛋白質酶的抑制，以及對細胞形態(tài)的影響［21］，所以也假定CT是通過對細菌細胞壁進行選擇性抑制的。

圖4 不同pH條件下，PPC的CT(a)、紅豆草的CT(b)和無CT(c)對大腸桿菌ATCC 25922細胞內膜通透性的影響Fig.4 Influence of CT from PPC(a)and sainfoin(b)，and w ithout tannin(c)on cell inner-membrane permeability of E.coil ATCC 25922 under different pH conditions

圖5 不同溫度條件下，PPC的CT(a)和紅豆草的CT(b)對大腸桿菌ATCC 25922細胞內膜通透性的影響Fig.5 Influence of CT from PPC(a)and sainfoin(b)on cell inner-membrane permeability of E.coil ATCC 25922 under different tem perature conditions

Je等［17］在對甲殼素通過干擾細菌內膜和外膜的研究中也表明，甲殼素有效的干擾了由脂多糖構成的外膜中高度帶負電的低聚糖單元。因為革蘭氏陰性(G－)細菌的內膜結構是由類似于磷脂酰甘油和雙磷脂酰甘油的陰離子脂質構成，也是與陽離子結合的部位，因此也干擾了內膜結構。在PPC的CT對大腸桿菌的外膜通透性試驗中，我們也證實了CT明顯的增加了外膜的通透性［14］，因此，對內膜的影響可能也是通過相同的機制進行。

關于綠茶中的多酚類化合物兒茶酚素，已被證明具有干擾細胞膜完整性、抑制細胞代謝重要過程的作用，如氧化磷酸化以及干擾膜內外物質的轉運過程。兒茶素組群中的一些成分如表兒茶素(epicatechin)和表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate)就是通過引起細菌細胞膜的破壞并干擾外膜中脂質體的變化而起到殺菌作用的［22－25］。

4 結 論

PPC在瘤胃及大腸環(huán)境下均具有抑制大腸桿菌體外生長的作用，其所含CT抑制大腸桿菌生長的機理部分與其增加細胞內膜的通透性有關，且細胞內膜通透性受到生長環(huán)境，如溫度和pH的影響。

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