FGF－23（R176Q）過表達(dá)對(duì)成年小鼠下頜骨形成和礦化的影響＊

劉 洪，孫 雯，鄭陽玉

（1．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)技術(shù)教研室，江蘇鹽城224005；2．南京醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)系 210029；3．南京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所 210029）

常染色體顯性遺傳低磷性佝僂?。╝utosomal－dominant hypophosphatemic rickets，ADHR）［1］是一種常見的佝僂病。導(dǎo)致ADHR的主要原因在于FGF－23（R176Q）錯(cuò)義突變后無法被蛋白水解酶水解，導(dǎo)致FGF－23在體內(nèi)蓄積，腎臟磷酸鹽回收不足導(dǎo)致磷酸鹽尿，腎臟1－羥化酶（1－alpha－h(huán)ydroxylase，1－ase）的合成被抑制，1，25（OH）2D3合成減少［2］。利用轉(zhuǎn)基因的手段將錯(cuò)義突變的人FGF－23基因轉(zhuǎn)入小鼠，構(gòu)建ADHR的小鼠動(dòng)物模型FGF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠。表型分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出發(fā)育緩慢、肌張力降低、手足搐搦、囟門閉合不全等佝僂病的癥狀，與ADHR患者的癥狀基本一致［3］。但是，F(xiàn)GF－23（R176Q）過表達(dá)對(duì)下頜骨的形成、礦化是否有影響，目前，未見有相關(guān)報(bào)道。本研究利用8周齡的FGF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩的野生型小鼠，通過X線掃描、組織學(xué)等手段進(jìn)行觀察，試圖闡明FGF－23（R176Q）對(duì)小鼠下頜骨形成和礦化是否有影響以及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用同窩的8周齡野生型（wild type，WT）小鼠和FGF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠各15只，雌雄不限，飼養(yǎng)于無特殊病原體級(jí)動(dòng)物房，使用常規(guī)飲食（1．0%鈣，0．5%磷）進(jìn)行飼養(yǎng)。

1．2 動(dòng)物基因型鑒定及分組 剪取1mm長鼠尾，使用酚－氯仿－異戊醇法進(jìn)行DNA的提取，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）進(jìn)行小鼠基因型的鑒定。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行觀察。根據(jù)基因型的結(jié)果分為TG組和WT組，PCR電泳結(jié)果有436bp條帶者為FGF－23（R176Q）小鼠，無條帶者為 WT小鼠［4］。

1．3 血清學(xué)檢查 小鼠使用乙醚進(jìn)行麻醉，麻醉后固定于動(dòng)物臺(tái)上，使用1mL注射器進(jìn)行心臟采血，4℃下以2 000 r／min離心10min，抽取上層血清，使用放射免疫法進(jìn)行血清鈣、磷和1，25（OH）2D3濃度檢測。

1．4 取材 解剖分離小鼠的左側(cè)下頜骨并免疫電鏡固定液固定，采用乙二胺四乙酸（EDTA）法脫鈣2周，脫水包埋，按照下頜第1磨牙近中根根管方向?qū)ο骂M骨進(jìn)行橫斷面切片，切片厚度5μm。解剖分離小鼠的左側(cè)下頜骨，使用75%乙醇固定，進(jìn)行CT檢查。

1．5 CT檢查 使用SkyScan 1072scanner掃描儀對(duì)75%乙醇固定的小鼠下頜骨進(jìn)行掃描檢查，掃描電壓100kV，電流98 mA，通過CT檢查觀察兩組小鼠的下頜骨骨密度變化情況。

1．6 染色觀察

1．6．1 總膠原染色 石蠟切片脫蠟水化，用配制好的苦味酸直紅染色液孵育1h，流水沖洗5min，蘇木精染色10min，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1．6．2 二聚糖免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片使常規(guī)脫蠟水化，用5%正常兔血清封閉20min，分別加入羊抗鼠二聚糖一抗（1∶500，美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜，PBST清洗，加兔抗羊IgG二抗（1∶200，美國Sigma公司），室溫孵育30 min；PBST清洗，加Elite－ABC（英國Vector公司）孵育30min，PBS清洗，加DAB溶液（英國Vector公司）室溫避光孵育5～8 min，蘇木精復(fù)染1min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察攝片，計(jì)算聚糖在下頜骨中的陽性面積比例。

1．6．3 HE染色 石蠟切片使常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色10 min，流水沖洗后使用伊紅染色30s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下測量2種不同基因型小鼠下頜骨成骨細(xì)胞密度（Ob．s／B．Pm）。

1．7 骨鈣素（osteocalcin，OCN）和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平檢測 解剖小鼠的下頜磨牙，一步法提取總RNA，常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用real time RT－PCR方法檢測下頜骨的OCN和Ⅰ型膠原（typeⅠcollagen）基因的表達(dá)水平。OCN正向引物序列為：5′－CAA GTC CCA CAC AGC AGC TT－3′，反向引物序列為：5′－AAA GCC GAG CTG CCA GAG TT－3′，產(chǎn) 物 370 bp，Ⅰ型膠原正向引物序列為：5′－TCT CCA CTC TTC TAG TTC CT－3′，反向引物序列為：5′－TTG GGT CAT TTC CAC ATG C－3′，產(chǎn)物269bp，使用 Applied biosystems 7300型實(shí)時(shí)定量RT－PCR儀擴(kuò)增并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以WT組的表達(dá)量作為參照。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 血清學(xué)指標(biāo)檢查 WT組小鼠血清鈣、磷和1，25（OH）2D3濃度均明顯高于TG組，而WT組的PTH的濃度低于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表1。

表1 兩組小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢查（x±s）

2．2 CT檢查結(jié)果 CT的檢查結(jié)果顯示，而TG組頜骨X線阻射程度低于WT組小鼠，并且TG組下頜第1磨牙有齲壞發(fā)生（圖1）。

圖1 2種小鼠CT掃描

2．3 總膠原染色結(jié)果 WT組下頜骨相對(duì)骨量為（68．56±19．65）%；TG組下頜骨相對(duì)骨量為（38．14±14．29）%，TG組的下頜骨相對(duì)骨量低于 WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4．85，P＜0．05），見圖2。

圖2 2種小鼠總膠原染色結(jié)果（×200）

2．4 HE染色結(jié)果 通過對(duì)HE染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT組成骨細(xì)胞密度（26．24±7．56）／mm，而 TG組為（14．68±6．89）／mm，WT組成骨細(xì)胞密度高于 TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4．38，P＜0．05），見圖3。

圖3 2種小鼠HE染色結(jié)果（×400）

2．5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 通過對(duì)TG組和WT組的DSP和聚糖免疫組織化學(xué)陽性百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT

組的聚糖陽性百分比為（6．52±1．28）%，TG 組為（12．68±2．54）%，TG組高于 WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8．39，P＜0．05），見圖4。

圖4 2種小鼠聚糖免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×400）

2．6 ALP和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平檢測 通過使用RTPCR檢測TG組和WT組OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT組的OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平均明顯高于TG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表2。

表2 兩組小鼠OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)TG組小鼠的血清鈣、磷和1，25（OH）2D3的濃度均低于WT組小鼠，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。其原因在于體內(nèi)過高濃度突變的FGF－23抑制1羥化酶的活性，導(dǎo)致1，25（OH）2D3的合成減少，同時(shí)減少腎臟、小腸對(duì)鈣和磷的重吸收，從而導(dǎo)致了血清鈣、磷濃度降低［5］。

CT掃描結(jié)果表明，TG組小鼠的下頜骨X線透光率明顯高于WT組小鼠，表明TG小鼠下頜骨存在礦化障礙，這個(gè)研究結(jié)果與對(duì)1－羥化酶敲除小鼠研究結(jié)果基本一致［6］。同時(shí)，總膠原染色結(jié)果顯示TG組小鼠的下頜骨骨量明顯低于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。同時(shí)，HE染色結(jié)果也發(fā)現(xiàn)TG組的單位長度上的成骨細(xì)胞數(shù)目也明顯少于WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。上述研究結(jié)果表明，F(xiàn)GF－23（R176Q）過表達(dá)導(dǎo)致了成骨細(xì)胞減少，進(jìn)而影響了下頜骨的骨基質(zhì)的形成和礦化。此外，二聚糖的免疫組織化學(xué)結(jié)果也提示FGF－23（R176Q）過表達(dá)導(dǎo)致了二聚糖在下頜骨中的表達(dá)增加。聚糖僅在未礦化的組織中如前期牙本質(zhì)、未礦化類骨質(zhì)表達(dá)［7］，礦化完成后二聚糖即被分解，而高濃度的二聚糖能夠抑制礦化過程的持續(xù)進(jìn)行［8］。本研究同樣表明，當(dāng) FGF－23（R176Q）過表達(dá)時(shí)，二聚糖在下頜骨骨基質(zhì)的蛋白沉積水平增加，表明其下頜骨骨基質(zhì)中未礦化的基質(zhì)比例明顯增加，由此導(dǎo)致了下頜骨礦化障礙。

此外，F(xiàn)GF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠下頜骨的OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平均明顯低于 WT小鼠，表明FGF－23（R176Q）過表達(dá)抑制了下頜骨成骨細(xì)胞的OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)。研究表明，OCN能夠促進(jìn)羥基磷灰石晶體的形成和沉積［9］，能促進(jìn)牙齒和骨骼的礦化［10－11］，而Ⅰ型膠原是骨骼的主要胞外基質(zhì)，在骨質(zhì)的形成中起到無機(jī)質(zhì)礦化的框架作用［12］。作者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF－23（R176Q）在體內(nèi)過表達(dá)一方面導(dǎo)致抑制了下頜骨成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原的合成，導(dǎo)致了下頜骨的胞外基質(zhì)分泌減少，另外一方面導(dǎo)致了下頜骨成骨細(xì)胞OCN合成減少，導(dǎo)致了下頜骨礦化出現(xiàn)異常。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF－23（R176Q）轉(zhuǎn)基因小鼠下頜骨出現(xiàn)了骨質(zhì)疏松、礦化不良等表型，與作者以前研究的1－羥化酶基因敲除小鼠的下頜骨的表型［13－15］較為相似，其主要原因在于FGF－23（R176Q）過表達(dá)抑制了1，25（OH）2D3的合成，同時(shí)還導(dǎo)致了低鈣、低磷血癥，并且還導(dǎo)致下頜成骨細(xì)胞密度下降，減少了OCN和Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平，阻礙了下頜骨胞外基質(zhì)的合成與分泌和礦化過程的進(jìn)行，最終阻礙了下頜骨的正常發(fā)育和礦化。

［1］ ADHR Consortium．Autosomal dominant hypophospha－taemic rickets is associated with mutations in FGF－23［J］．Nat Genet，2000，26（3）：345－348．

［2］ Yamazaki Y，Okazaki R，Shibata M，et al．Increased circulatory level of biologically active full－length FGF－23in patients with hypophosphatemic rickets／osteomalacia［J］．J Clin Endocrinol Metab，2002，87（11）：4957－4960．

［3］ Bai X，Miao D，Li J，et al．Transgenic mice overexpressing human fibroblast growth factor 23（R176Q）delineate a putative role for parathyroid hormone in renal phosphate wasting disorders［J］．Endocrinology，2004，145（11）：5269－5279．

［4］ 劉洪，孫雯，鄭陽玉．FGF－23（R176Q）過表達(dá)對(duì)成年小鼠磨牙齲損的影響［J］．實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，30（3）：322－326．

［5］ Liu P，Bai X，Wang H，et al．Hypophosphatemia－mediated hypotension in transgenic mice overexpressing human FGF－23［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297（4）：H1514－1520．

［6］ 劉洪，楊留才，苗登順．1，25二羥維生素D＿3缺乏對(duì)小鼠繼發(fā)性牙本質(zhì)生成、礦化和齲損的影響［J］．華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，28（6）：599－602，606．

［7］ Bae CH，Lee JY，Kim TH，et al．Excessive Wnt／beta－catenin signaling disturbs tooth－root formation［J］．J Periodontal Res，2013，48（4）：405－410．

［8］ Haruyama N，Sreenath TL，Suzuki S，et al．Genetic evidence for key roles of decorin and biglycan in dentin mineralization［J］．Matrix Biol，2009，28（3）：129－136．

［9］ 劉紅，廖二元，伍賢平．骨鈣素與代謝性骨?。跩］．國外醫(yī)學(xué)：內(nèi)分泌學(xué)分冊，2004，24（4）：239－240，249．

［10］Sun W，Sun W，Liu J，et al．Alterations in phosphorus，calcium and PTHrP contribute to defects in dental and dental alveolar bone formation in calcium－sensing receptor－deficient mice［J］．Development，2010，137（6）：985－992．

［11］葉凌，李江寧，李聯(lián)欽，等．骨鈣素在體內(nèi)的表達(dá)［J］．國外醫(yī)學(xué)：口腔醫(yī)學(xué)分冊，2002，29（4）：228－229．

［12］劉洪，苗登順．1－α羥化酶基因敲除導(dǎo)致小鼠牙本質(zhì)形成和前期牙本質(zhì)礦化障礙［J］．南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，28（8）：985－989，1002．

［13］劉洪，高璀鄉(xiāng)，楊留才，等．內(nèi)源性1，25（OH）2D3缺乏對(duì)哺乳期小鼠牙齒礦化和牙本質(zhì)形成的影響［J］．口腔醫(yī)學(xué)研究，2011，27（7）：575－579．

［14］劉洪，丁風(fēng)云，顏成東，等．1，25二羥維生素D3在小鼠下頜骨礦化作用機(jī)制研究［J］．口腔生物醫(yī)學(xué)，2011，2（3）：131－135，139．

［15］劉洪，王子露，王琰玲，等．1，25（OH）2D3缺乏對(duì)小鼠下頜骨體及髁突骨形成的影響［J］．實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（5）：597－602．