BLCA－4對評估膀胱腫瘤瘤旁2cm組織切除術(shù)的臨床意義

王 浩，王曉鵬，郭 利，張政偉，王志勇

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，河北承德067000）

膀胱腫瘤是國內(nèi)泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其術(shù)后高復(fù)發(fā)率，以及需要長期的病情監(jiān)測給患者和社會帶來了嚴重的醫(yī)療負擔。易復(fù)發(fā)是膀胱腫瘤特性之一，手術(shù)時腫瘤病變的殘留被證明是重要因素之一，因此更加準確的臨床干預(yù)至關(guān)重要。盡管膀胱腫瘤在放療、化療、生物免疫治療方面取得了明顯的進步，但經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumor，TUR－BT）及開放切除至今仍然是治療膀胱腫瘤的主要方式。TUR－BT被公認為非肌層浸潤性膀胱尿路上皮癌的首選治療手段，但對于手術(shù)中腫瘤邊緣切除的范圍說法不一，從0．5～3．0cm不等，且多為經(jīng)驗性切除，無病理統(tǒng)計意義［1－4］。BLCA－4是膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白家族中的一員，通過對其多肽序列的檢測，展現(xiàn)出此蛋白極強的組織和疾病特異性［5］，是目前診斷膀胱腫瘤最敏感（89%～96%）且最特異（95%～100%）的標志物［6］。本研究通過觀察膀胱腫瘤組織、瘤旁2cm外正常組織中膀胱癌特異性核基質(zhì)蛋白（BLCA－4）的表達，從分子生物學角度探討B(tài)LCA－4在評估膀胱腫瘤瘤旁2cm切除術(shù)的臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集本院泌尿外科2012年9月至2013年4月收治的早期非肌層浸潤性膀胱腫瘤患者24例，其中5例由于廣基、腫瘤較大（大于2cm）、位于頂壁原因行膀胱腫瘤部分切除術(shù)，其余19例行單純經(jīng)尿道電切手術(shù)，男16例，女8例，年齡44～80歲，平均年齡（60．9±10．5）歲。經(jīng)術(shù)后病理確認所有患者均為非肌層浸潤性尿路上皮癌，通過CT影像學和相關(guān)輔助檢查，無一例患者有淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移。

1．2 方法

1．2．1 手術(shù)方法 部分切除術(shù)均取下腹部正中切口，依次切開皮膚、筋膜、肌肉，劃開膀胱壁一小口吸凈提前灌入其中的蒸餾水，觀察瘤體形狀和部位，切除腫瘤和周邊2cm正常組織，蒸餾水浸泡20min后縫合；TUR－BT術(shù)取截石位，首先置入膀胱鏡觀察腫瘤部位、大小形態(tài)，為防止電切組織攣縮提前在瘤周2cm處電凝作一標記，設(shè)定電切功率120W，電凝功率70 W，灌洗液為甘露醇溶液，然后用電切鏡依次施行瘤體及瘤蒂切除，深度達肌層，切除范圍包括腫瘤周圍2cm的正常黏膜，徹底電凝止血，用沖洗器將組織塊及血塊沖出體外，電切術(shù)后即刻灌注吡柔比星予以輔助化療。

1．2．2 組織處理 組織離體后固定于10%中性甲醛溶液中，固定液體積均至少10倍于組織，在常溫條件下固定8～24h后將手術(shù)標本（不論開放或是電切）剪取不同位點腫瘤和瘤旁組織各2塊，大小約3mm×3mm×3mm，放入預(yù)設(shè)置好程序的自動脫水透明機中，隨后對組織進行包埋處理，連續(xù)5μm切片，進行常規(guī)蘇木素－伊紅（HE）染色，用中性樹脂封片、晾干待病理醫(yī)師觀察。BLCA－4的免疫組織化學切片經(jīng)過二甲苯徹底脫蠟和梯度乙醇脫水后應(yīng)用PBS沖洗10min，以3%的過氧化氫甲醇在37℃溫箱中孵育30min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后進行抗原修復(fù)，PBS沖洗3×5min后滴加山羊血清封閉，傾去封閉液直接加抗體置于濕盒中4℃過夜，第2天轉(zhuǎn)放于37℃溫箱中復(fù)溫30min，然后順序滴加生物素標記二抗及酶標記鏈親和素各孵育30min，最后用現(xiàn)配的DAB液進行顯色，利用純水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染脫水透明后封片觀察。陰性對照采用PBS液替代BLCA－4抗體，其余染色步驟不變。

1．2．3 切片觀察 全部常規(guī)HE染色的病理切片先后經(jīng)過3個病理科醫(yī)師反復(fù)觀察確認，按照國際抗癌協(xié)會2009年第7版TNM分期法和2004年WHO分級法進行分析，經(jīng)討論后作出最終診斷。另外，免疫組織化學結(jié)果采用下述判定方式，在染色強度均勻的區(qū)域選取5個高倍（×400）視野，按陽性細胞百分率進行染色廣度評分：0～5%為0分，＞5%～20%為1分，＞20%～50%為2分，＞50%為3分；按染色的深淺進行強度評分：淺黃色為1分，深黃色為2分，棕褐色為3分。結(jié)合染色廣度和強度的分值之和對染色結(jié)果綜合判斷：0～＜3分為陰性，3分為陽性。

1．3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17．0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用Fisher確切概率法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 HE染色 將24例腫瘤組織進行病理切片觀察發(fā)現(xiàn)所有腫瘤均為非浸潤性尿路上皮癌，其中83．3%（20／24）處于Ta期，另有4例腫瘤組織侵及黏膜下層，為T1期。根據(jù)WHO 2004分級法確定有6例為高級別癌，其余18例均為低級別癌。在瘤旁組織的病理確認中發(fā)現(xiàn)，3例組織切片檢查有癌細胞浸潤，均為高分級，其余21例瘤旁組織未發(fā)現(xiàn)異常，瘤旁浸潤率較高，達12．5%。

2．2 免疫組織化學染色 BLCA－4的免疫組織化學切片可見，24例腫瘤組織染色均陽性，相應(yīng)的癌旁組織有33．3%（8／24）染色陽性，包括病理鑒定為癌浸潤的3例和病理正常的5例。通過對染色陽性的患者進行臨床資料的對比發(fā)現(xiàn)（表1），病理正常而免疫組織化學染色陽性的5例癌旁組織中有2例為高級別，另外3例染色陽性組織雖然為低級別但腫瘤均較大，數(shù)據(jù)顯示高級別BLCA－4的陽性表達率83．3%，高于低級別陽性率，黏膜下層浸潤的T1期組織染色均為陽性表達，腫瘤大于2cm者BLCA－4陽性率85．7%（6／7），高于腫瘤較小者的陽性 率 11．8%（2／17），F(xiàn)isher檢驗 有 統(tǒng) 計 學 差 異 （P＜0．05），提示BLCA－4染色陽性與性別、年齡因素無關(guān)，分期或級別高、瘤體大是癌旁浸潤廣的危險因素。

表1 癌旁組織BLCA－4陽性表達與臨床病理資料的關(guān)系

3 討 論

膀胱腫瘤是泌尿系最常見腫瘤，經(jīng)尿道切除術(shù)（transurethral resection，TUR）是目前診治膀胱腫瘤的主要方法，但TUR仍然有其不足。Divrik等［7］認為，中、高分級的T1期膀胱癌，首次電切術(shù)后腫瘤殘余率可以達到33．8%～36．0%，原位殘余的腫瘤是導(dǎo)致膀胱癌復(fù)發(fā)的重要因素，并且經(jīng)膀胱灌注化療也不能降低因切除不全導(dǎo)致的復(fù)發(fā)。Richterstetter等［8］在膀胱腫瘤患者初次TUR時即行擴大切除術(shù)，發(fā)現(xiàn)腫瘤周邊組織樣本中有38%顯示有癌浸潤，切除的完整性受腫瘤大小、浸潤深度和分級的影響。根據(jù)歐洲泌尿外科學會（EAU）和美國泌尿外科學會（AUA）指南，對初次TUR的患者在術(shù)后2～6周進行常規(guī)的二次切除，可以降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率和進展率，但增加了患者的經(jīng)濟負擔，同時也增加了膀胱穿孔、出血、尿道感染等發(fā)病率，因此，初次手術(shù)時的有效切除或許能帶來更大的益處。

細胞核基質(zhì)蛋白（nuclear matrix proteins，NMPs）決定著細胞核的形態(tài)并且在細胞的眾多功能中（包括DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等基因表達調(diào)控）起重要的作用［9－10］。細胞癌變過程中，細胞、細胞核形態(tài)及基因的表達發(fā)生改變，這些變化可能是癌細胞中NMPs表達異常的原因或結(jié)果，BLCA－4即特異性表達于膀胱腫瘤組織中。2000年Konety等［11］利用蛋白印跡法檢測膀胱癌患者腫瘤組織和瘤旁組織及正常人膀胱組織中的BLCA－4水平，結(jié)果75%的癌組織和100%的瘤旁組織BLCA－4染色陽性，正常組織中均陰性。2011年，上海Feng等［12］應(yīng)用免疫組織化學發(fā)現(xiàn)正常膀胱組織中BLCA－4無表達，癌組織中陽性染色得分高，24份癌旁組織中有10份表達陽性。2012年，Zhao等［13］也通過免疫組織化學方法檢測到78．2%的腫瘤組織表達陽性。

本實驗檢測了24例非浸潤性膀胱腫瘤患者術(shù)中切除的組織標本，結(jié)果顯示癌旁2cm正常組織中有3例病理確認為癌浸潤，均為高級別腫瘤。BLCA－4免疫組織化學顯示，全部腫瘤組織和3例病理異常的癌旁組織均為陽性，其余21例病理正常的癌旁組織中有5例BLCA－4染色陽性，同時對染色陽性的患者進行臨床資料對比發(fā)現(xiàn)：腫瘤基底廣、直徑較大的高級別腫瘤浸潤癌旁2cm的可能性更大。另外，病理正常的組織切片BLCA－4染色陽性說明組織在可見的腫瘤病理學變化之前已有蛋白分子學改變。本研究表明，應(yīng)用免疫組織化學法檢測膀胱腫瘤組織及癌旁組織中BLCA－4的表達，在預(yù)測術(shù)后原位腫瘤復(fù)發(fā)上優(yōu)于病理檢查。膀胱腫瘤瘤旁2cm切除術(shù)所切取的瘤旁組織中BLCA－4表達陽性，提示腫瘤級別高，復(fù)發(fā)概率增大，通過優(yōu)化手術(shù)切除范圍，從手術(shù)水平減少因原位腫瘤殘留所致復(fù)發(fā)，是目前治療膀胱腫瘤的重要方式。當然，對于高?；颊呤欠駪?yīng)在此基礎(chǔ)上行擴大性切除仍需要進一步基礎(chǔ)和臨床循證醫(yī)學的研究。

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