高效液相色譜法檢測(cè)糖化血紅蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)

張文華，侯晗宇，張建榮，王菊英，周立榮（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004）

糖化血紅蛋白（HbA1c）作為糖尿病篩選、診斷、血糖控制、療效評(píng)價(jià)的有效指標(biāo)，在臨床上已廣泛使用，是監(jiān)測(cè)糖尿病的金標(biāo)準(zhǔn)［1］，高效液相色譜法（HPLC）則被列為檢測(cè) HbA1c參考方法。本中心引進(jìn)一臺(tái)日本TOSOH公司HLC－723 G8全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀，除用于測(cè)定HbA1c外，還可獲得Hb A1、血紅蛋白F（HbF）的值，現(xiàn)對(duì)其檢測(cè)HbA1c性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血樣本，來自本院門診及住院患者。

1.1.2 儀器 日本TOSOH公司HLC－723 G8全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀。

1.1.3 試劑 試劑（批號(hào) EB－102S）、校準(zhǔn)品（批號(hào)ZS0002）、質(zhì)控品（批號(hào)100842），均為原裝配套，由日本TOSOH公司提供。

1.2 方法 樣本檢測(cè)前均采用原公司提供的配套校準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，并用2個(gè)濃度水平的質(zhì)控品進(jìn)行控制，結(jié)果在控，手工操作步驟嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》［2］進(jìn)行。

1.2.1 精密度試驗(yàn)

1.2.1.1 批內(nèi)試驗(yàn) 選取新鮮全血樣本，含正常、異常濃度，分別測(cè)定HbA1c的含量，在一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.1.2 批間試驗(yàn) 采用質(zhì)控品，含正常、異常濃度，分別測(cè)定HbA1c的含量，每天上下午各測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定10 d，計(jì)算變異系數(shù)。

1.2.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 使用校準(zhǔn)物在分析儀上連續(xù)進(jìn)行10次分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算結(jié)果均值與標(biāo)定值的偏倚，偏倚應(yīng)小于或等于3.0%。

1.2.3 攜帶污染率 取高濃度全血樣本，混合均勻后連續(xù)測(cè)定3次，測(cè)定值分別為H1、H2、H3；再取低濃度全血樣本，連續(xù)測(cè)定3次，測(cè)定值分別為L(zhǎng)1、L2、L3。按公式計(jì)算攜帶污染率（≤3.0%）。攜帶污染率＝（L1－L3）×100%／（H3－L3）。

1.2.4 線性試驗(yàn) （1）選取高值 HbA1c（18.1%）和低值HbA1c（4.7%）的人全血樣品。（2）吸取20μL的高值樣品注入樣品管，加入4 mL（200倍稀釋）溶血洗凈液配制成樣品A。（3）吸取20μL的低值樣品注進(jìn)樣品管，加入4 mL（200倍稀釋）溶血洗凈液配制成樣品B。（4）在分析儀上測(cè)定樣品A和樣品B，根據(jù)打印結(jié)果分別確認(rèn)兩個(gè)樣品的色譜峰總面積（Total Area），該總面積表示HbA1c的濃度。（5）調(diào)整總面積，使樣品A與樣品B的色譜峰總面積相近，此時(shí)調(diào)整后樣品B的濃度為4.6%。（6）按照100%、80%、60%、40%、20%、0%比例稀釋混勻（B為稀釋液），每個(gè)樣品檢測(cè)3次，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的均值和預(yù)期值進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計(jì)。將實(shí)測(cè)值與理論值作比較（偏離應(yīng)小于10%），計(jì)算y＝a x＋b，驗(yàn)證線性。（7）要求：a值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2≥0.95。

2 結(jié) 果

2.1 精密度試驗(yàn) 見表1。

2.2 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 見表2。

2.3 攜帶污染率 本次試驗(yàn)驗(yàn)證的攜帶污染率為1.09%，滿足要求（≤3.0%）。

2.4 線性試驗(yàn) 將檢測(cè)結(jié)果的均值和預(yù)期值進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計(jì)。將實(shí)測(cè)值與理論值作比較（偏離應(yīng)小于10%），計(jì)算y＝a x＋b，其中a＝0.9832，r2＝0.9922，滿足要求（a值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2≥0.95）。

表1 精密度試驗(yàn)

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)－定值校準(zhǔn)品

3 討 論

HbA1c水平反映的是在檢測(cè)前120 d內(nèi)的平均血糖水平，而與抽血時(shí)間、患者是否空腹等因素?zé)o關(guān)，是監(jiān)測(cè)糖尿病控制情況的良好指標(biāo)［3］。

美國(guó)頒布的《臨床實(shí)驗(yàn)室修正法案的最終法規(guī)》、ISO 15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)以及美國(guó)病理家學(xué)會(huì)（CAP）的認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)［4-6］均要求實(shí)驗(yàn)室對(duì)引進(jìn)或改變的檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證后方可用于常規(guī)工作。全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀HLC－723 G8基于高效液相色譜分析法的原理，通過陽(yáng)離子交換柱利用電位差將血紅蛋白組分分離。利用3種不同濃度洗脫液使包括HbA1c在內(nèi)的多種血紅蛋白進(jìn)行梯度分離，分離成6個(gè)部分。經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)分離后的各血紅蛋白組分的吸光度，以百分率形式表示出各血紅蛋白的組分結(jié)果與色譜圖。作者通過測(cè)定全血中HbA1c的含量，從以下幾個(gè)方面對(duì)該儀器性能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

3.1 精密度 批內(nèi)變異系數(shù)小于1.0%，批間變異系數(shù)小于1.3%，符合CLIA′88對(duì)室間評(píng)估的允許誤差要求，1／4允許誤差范圍為批內(nèi)不精密度判斷限（≤3.0%），1／3允許誤差范圍為日間不精密度判斷限（≤4.0%），說明該儀器的重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

3.2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 分析廠商提供的HbA1c校準(zhǔn)品，用校準(zhǔn)品校準(zhǔn)后，連續(xù)重復(fù)測(cè)定該批號(hào)校準(zhǔn)品10次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算檢測(cè)均值與標(biāo)定值的偏倚，測(cè)試結(jié)果偏倚均小于3.0%，滿足要求，說明該儀器準(zhǔn)確性高。

3.3 其攜帶污染率小于或等于3.0%，樣品間的交叉污染極小，滿足檢測(cè)要求。

3.4 通過線性試驗(yàn)，可觀察各稀釋點(diǎn)均呈現(xiàn)較好線性，a值及r2均滿足要求，試驗(yàn)所驗(yàn)證項(xiàng)目的測(cè)量范圍符合線性。綜上所述，全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀HLC－723 G8精密度高、準(zhǔn)確性好、交叉污染極小，且具有良好線性等優(yōu)點(diǎn)；另外，測(cè)試速度快、操作簡(jiǎn)便。為臨床調(diào)整糖尿病治療方案提供準(zhǔn)確依據(jù)，有很好的應(yīng)用前景。

［1］王笠，李琳.糖化血紅蛋白的檢測(cè)和臨床應(yīng)用［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2003，18（2）：119－121.

［2］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：223.

［3］紀(jì)立農(nóng)，寧光.糖化血紅蛋白［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：2－16.

［4］魏昊，叢玉隆.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與認(rèn)可指南［M］.北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2004：59－75.

［5］Department of Health and human Services，Centers for Medicare ＆ Medicaid Services.Clinical Laboratory improvement amendments of 1988：final rule［M］.Fed Register，2003：3704.

［6］畢波，呂元.定量檢測(cè)方法學(xué)性能驗(yàn)證的系統(tǒng)設(shè)計(jì)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（2）：143－145.