梔子全國生產(chǎn)區(qū)劃中指標(biāo)成分多波長HPLC方法建立

苗琦等

摘要：以梔子為研究對(duì)象，建立了多波長高效液相色譜法對(duì)梔子中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ等 6種有效成分的測定方法，并將此方法應(yīng)用于不同產(chǎn)地梔子成分含量的測定，為梔子全國生產(chǎn)區(qū)劃提供了可靠指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：HPLC；梔子；生產(chǎn)區(qū)劃

中圖分類號(hào)： O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）02-0300-03

收稿日期：2014-09-17

基金項(xiàng)目：國家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2011BAI04B01）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（編號(hào)：20603020110、20603020213）；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)（編號(hào)：JZYC14C09）。

作者簡介：苗琦（1989—），男，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事中藥資源開發(fā)與應(yīng)用研究。E-mail：miaoqi6213963@126.com。

通信作者：羅光明，博士，教授，主要從事中藥資源開發(fā)與應(yīng)用研究。Tel：（0791）7118982；E-mail：jzlgm11@163.com。梔子是茜草科常綠灌木植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的功效。梔子主要生長在長江以南各省，主產(chǎn)于江西省、湖南省、湖北省、浙江省等地，是江西省道地藥材，也是市場上廣泛銷售的大宗藥材。中藥區(qū)劃研究中藥資源及其地域系統(tǒng)的空間分異規(guī)律，對(duì)特定環(huán)境下藥材的適生性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以適當(dāng)?shù)姆绞奖硎境鰜恚沁x擇中藥材引種栽培適生地的基本依據(jù)[1-2]。不同地區(qū)間中藥資源的差異性是中藥區(qū)劃的前提。中藥區(qū)劃研究中通常選取有效成分含量等可以定量化的要素作為區(qū)劃指標(biāo)[1]。2010年版《中國藥典》中只對(duì)中藥梔子中的梔子苷這一有效成分進(jìn)行了明確規(guī)定，但中藥成分的復(fù)雜性決定了單一成分或指標(biāo)難以客觀評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，只將梔子苷單一成分含量作為梔子藥材的區(qū)劃指標(biāo)是無法對(duì)梔子進(jìn)行生產(chǎn)區(qū)劃的。梔子苷并不能代表?xiàng)d子藥材的所有藥效，梔子中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、西紅花苷類、有機(jī)酸等化合物，主要有效成分包括京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ。其中梔子苷具有抗炎、解熱、利膽、輕瀉的作用；京尼平苷酸具有抗腫瘤、抗氧化的作用；京尼平1-β-D龍膽二糖苷能改善戊巴比妥鈉引起的心力衰竭；綠原酸具有顯著的抗癌及保肝利膽作用；西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ是西紅花和梔子中共有的色素類成分，具有去黃疸、利膽及明顯的降血脂作用[3]。本研究以梔子為對(duì)象，建立了多波長高效液相色譜法測定對(duì)梔子中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ 等6種有效成分的方法，旨在為梔子區(qū)劃提供更加合理可靠的指標(biāo)。1材料與方法

1.1儀器

Waters高效液相色譜儀，Empower工作站（美國Waters公司），BP224S電子天平（萬分之一）（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），KQ-300E超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2材料

甲醇色譜純（美國天地有限公司）；乙腈色譜純（美國ACS公司）；甲醇分析純（西隴化工股份有限公司）；娃哈哈純凈水；標(biāo)準(zhǔn)品：京尼平苷酸（111828-201102，純度按 96.0%計(jì)算）、綠原酸（110753-201314，純度按96.6%計(jì)算）、梔子苷（110749-201316，純度按97.5%計(jì)算）、西紅花苷-Ⅰ（111588-201202，純度按91.1%計(jì)算）、西紅花苷-Ⅱ（111589-201304，純度按92.4%計(jì)算）購于中國藥品生物制品檢定所，京尼平1-β-D龍膽二糖苷（批號(hào)為ZM0501BA14，純度>98.0%）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1供試品溶液的制備稱取0.1 g梔子粉末（過4號(hào)篩）置具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾。量取續(xù)濾液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻即得。

1.3.2對(duì)照溶液的制備稱定適量各對(duì)照品，分別置于 50 mL 棕色容量瓶中，用適量75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，分別制成含京尼平苷酸10.176 μg/mL、京尼平1-β-D龍膽二糖苷201.292 μg/mL、綠原酸4.443 6 μg/mL、梔子苷311.61 μg/mL、西紅花苷-Ⅰ 175.276 4 μg/mL、西紅花苷-Ⅱ 17.371 2 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.3色譜條件Durashell C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脫：0～18 min（8%～15% A）；18～25 min（15%～23% A）；25～40 min（23%～35% A）；40～50 min（35%～50% A）；檢測波長：238、330、440 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2結(jié)果與分析

2.1對(duì)照品溶液、供試品溶液多波長HPLC分析

分別得到238 nm（圖1）、330 nm（圖2）、440 nm（圖3）下對(duì)照品、樣品的HPLC色譜圖，與相應(yīng)對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間及紫外光譜圖進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)了6個(gè)色譜峰的歸屬。

由此可知，京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、梔子苷在238 nm處有最大吸收波長；綠原酸在330 nm處有最大吸收波長；西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ在440 nm處有最大吸收波長。故將238、330、440 nm定為6種有效成分的檢測波長。endprint

2.2線性關(guān)系考察

將“1.3.2”節(jié)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別用75%甲醇稀釋2、4、8、16、32、64倍，按“1.3.3” 節(jié)的色譜條件測定，進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣量10 μL中對(duì)照品質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，最佳檢測波長下的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn)取稀釋2倍的混合對(duì)照品溶液10 μL，在“1.3.3”節(jié)的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為0.55%、0.50%、041%、0.48、0.49%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn)取稀釋2倍的混合對(duì)照品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅰ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為1.21%、1.33%、097%、174%、1.51%、1.82%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批藥材，按“1.3.1”節(jié)的方法平行處理5份，同法制成供試品溶液，測定峰面積，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為1.36%、1.89%、0.59%、130%、0.77%、1.43%，表明此法重復(fù)性良好。

2.3.4加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含量的樣品，共5份，加入2 mL混合對(duì)照品溶液，按照“1.3.1”節(jié)的方法制備供試品溶液，按照“1.3.3”節(jié)的色譜條件，進(jìn)樣10 μL，依次測定6種有效成分的峰面積并計(jì)算平均加樣回收率，平均回收率分別為99.32%、99.48%、99.19%、99.34%、99.51%、99.65%，表明此方法回收率較好。

2.3.5樣品的含量測定按“1.3.1”節(jié)的方法制備12個(gè)不同產(chǎn)地的梔子樣品，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾頭過濾后進(jìn)樣10 μL，按“1.3.3”節(jié)的色譜條件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算梔子中6種有效成分的含量，結(jié)果見表2。

3結(jié)論與討論

3.1提取方法的選擇

本研究采用了20、30、40、50、60 min提取時(shí)間下回流、超聲2種提取方法，綜合分離度、峰形、峰數(shù)目、峰面積、重復(fù)性等因素，結(jié)果表明，回流40 min與50、60 min提取效果幾乎無差異，回流40 min為最佳回流提取時(shí)間；超聲 40 min與超聲50、60 min提取效果也幾乎無差別，提示超聲40 min為最佳超聲提取時(shí)間；超聲40 min與回流40 min提取效果幾乎一致，但由于回流重復(fù)性較差，同法制備樣品RSD較超聲高出很多，而且超聲較回流操作方法簡單，故選擇超聲40 min為樣品的提取方法。

3.2流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)過程中嘗試了甲醇-水、乙腈-水等體系，比較了在水中加入磷酸或甲酸峰形、分離度的差別，在確定流動(dòng)相后，嘗試了多個(gè)梯度洗脫方法，結(jié)果表明，乙腈分離效果較甲醇更好，而且隨著乙腈比例的增加，保留時(shí)間顯著縮短，但分離度有所下降；加入磷酸或者甲酸使溶劑體系呈弱酸性，能改善峰形、分離度，但磷酸、甲酸之間并無明顯差別。

3.3檢測波長的選擇

大多數(shù)研究人員采用254 nm或者其他單一波長作為梔子成分的檢測波長，由于中藥成分復(fù)雜，采取單一檢測波長會(huì)出現(xiàn)峰組成單一、峰面積普遍偏小以及特征峰數(shù)量少等情況，后續(xù)的梔子指紋圖譜相似度計(jì)算也無法客觀反映梔子藥材的成分。梔子中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、有機(jī)酸類、西紅花苷等化合物。本試驗(yàn)使用DAD檢測器對(duì)樣品進(jìn)行190～500 nm 全波長掃描，并對(duì)各波長下的色譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明，3類化合物的最佳檢測波長分別是238、330、440 nm。中藥成分的復(fù)雜性決定了單一成分或指標(biāo)難以客觀評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，如果只選取單一波長進(jìn)行檢測，可能造成峰面積信息丟失或殘缺，所以本試驗(yàn)選擇238、330、440 nm作為檢測波長，各峰分離良好，特征峰明顯且峰形較好，3個(gè)波長圖譜最大可能地獲取了色譜組分信息。

3.4不同產(chǎn)地梔子中6種有效成分的含量

本研究表明，不同產(chǎn)地的梔子中均含有梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸，部分產(chǎn)地梔子中由于綠原酸含量極少無法檢出，不同產(chǎn)地梔子中各成分含量既有相似之處，也存在很大的差別。梔子苷含量最高，其次含量較高的是西紅花苷-Ⅰ、京尼平1-β-D龍膽二糖苷等。各成分的含量范圍波動(dòng)較大，這可能是由于不同地區(qū)的土壤、氣候、水分、礦物質(zhì)分布情況、藥材采收期及藥材種源等都會(huì)對(duì)中藥材質(zhì)量產(chǎn)生影響。各地不同的自然生態(tài)環(huán)境條件直接影響生物的種類、數(shù)量、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能等，自然生態(tài)環(huán)境與中藥資源的質(zhì)量、數(shù)量密切相關(guān)[4]。

參考文獻(xiàn)：

[1]張小波，郭蘭萍，周濤，等. 關(guān)于中藥區(qū)劃理論和區(qū)劃指標(biāo)體系的探討[J]. 中國中藥雜志，2010，35（17）：2350-2354.

[2]郭蘭萍，黃璐琦，蔣有緒，等. 2種不同模式中藥適宜性區(qū)劃的比較研究[J]. 中國中藥雜志，2008，33（6）：718-721.

[3]孟祥樂，李紅偉，李顏，等. 梔子化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國新藥雜志，2011，20（11）：959-967.

[4]徐燕，曹進(jìn)，王義明，等. 多波長高效液相色譜法同時(shí)測定梔子中的三類成分[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（7）：543-546.李敏，王自健，路喆，等. 不同產(chǎn)地薰衣草H-701精油理化性質(zhì)比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：303-306.endprint