胡桃醌在土壤中的殘留分析

趙亞洲等

摘要：通過乙酸乙酯振蕩提取和HPLC-PAD測定方法，獲得胡桃醌在土壤樣品中的殘留量。結(jié)果表明：當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0、10.0 mg/kg時，胡桃醌在黃壤、水稻土、石灰土中的添加平均回收率分別為85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、78.1%～84.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%；胡桃醌的最低檢出量為5.0 ng，在土壤中的最低檢出濃度為1.0 mg/kg。該方法操作簡單，準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌殘留量的檢測。

關(guān)鍵詞：胡桃醌；土壤；殘留分析；高效液相色譜

中圖分類號： O657.7+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0294-03

收稿日期：2014-04-25

基金項目：國際合作項目（編號：2011DFB41640）；貴州科學(xué)院青年基金項目（編號：黔科院J合字[2011]25號、黔科院J合字[2014]14號）；貴州科學(xué)院青年基金項目（編號：黔科院J合字[2013]11號）。

作者簡介：趙亞洲（1989—），男，陜西渭南人，碩士研究生，研究方向為環(huán)境毒理。E-mail：zhao-yazhou-1234@163.com。

通信作者：譚紅，研究員，主要從事食品安全、環(huán)境監(jiān)測、新化學(xué)物質(zhì)毒理測試研究。E-mail：tan-hong@tom.com。胡桃醌（juglone）別稱5-羥基-1，4-萘醌、5-羥基-1，4-萘二酮，主要存在于胡桃科核桃屬植物胡桃楸（Juglans Mandshurica Maxim.）和核桃（Juglans regia）的根皮、樹皮、青龍衣中，是胡桃屬中分離出來的小分子萘醌[1]。Hejl等通過水溶液培養(yǎng)液毒性測試試驗，證明了胡桃醌對某些植物有潛在的毒理作用[2]；Inbaraj等發(fā)現(xiàn)在胡桃醌培養(yǎng)液中胡桃醌表現(xiàn)出抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌的活性功效[3]。研究還發(fā)現(xiàn)，胡桃醌在醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)藥行業(yè)以及食品、日用品等方面有著廣泛的應(yīng)用價值[4]，并且其在環(huán)境中的行為特性研究也受到了人們的關(guān)注。

萘醌類化合物根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征分為α-（1，4）、β-（1，2）及amphi-（2，6）3種類型，至今從自然界得到的大都是α-萘醌類化合物[5]。宮玉濤等研究了萘醌類化合物中的2-羥基-1，4萘醌在土壤中的降解作用和淋溶行為，5 g土壤樣品（2-羥基-1，4萘醌添加濃度為1、2、10、20 mg/kg）通過加入25 mL的去離子水，振蕩萃取30 min后離心15 min，上清液直接用HPLC測定，該方法的回收率為70.24%～7712%[6]，盡管胡桃醌與2-羥基-1，4萘醌同屬萘醌類化合物，但由于-OH基團(tuán)的位置不同，使得它們的水溶性差別較大，因此在提取土壤中的胡桃醌時，不宜采用水作為提取溶劑。王文澤等用多種提取溶劑提取核桃楸青果皮中胡桃醌，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯作為提取溶劑時提取率較高，達(dá)到0404%[7]。季宇彬等使用多種溶劑從青龍衣中提取胡桃醌，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取率最好[8]。程力惠等用乙醇提取核桃球樹皮中的胡桃醌，發(fā)現(xiàn)超聲提取比冷浸法和回流法提取率高[9]。Yang等用氯仿對東北核桃種植園土壤、松葉林土壤以及核桃-松葉林植被間土壤中的胡桃醌進(jìn)行提取，測得胡桃醌回收率分別為87.1%、85.4%、86.2%[10]。De Scisciolo等在提取不同季節(jié)胡桃樹下土壤中胡桃醌含量時采用甲醇-冰乙酸作為提取溶劑，提取效果較好[11]。索緒斌等使用高效液相色譜法測定青龍衣中的胡桃醌含量，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性好[12]。孫墨瓏等使用分光光度法測定胡桃樹皮中胡桃醌含量，方法簡單、易操作[13]。孫墨瓏等采用 GC-MS 聯(lián)用法對胡桃樹皮中胡桃醌進(jìn)行測定，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好[14]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜法測定胡桃醌在土壤中的殘留分析方法，本方法操作簡單，準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌殘留量的測定。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、YRDC-0506低溫冷卻循環(huán)泵、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；HY-8調(diào)速多用振蕩箱（常州國華電器有限公司）；SG5200HDT超聲波清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司）；DT500A電子天平（常熟市意歐儀表有限公司）；移液槍（GILSON）；具塞三角瓶、茄形瓶、抽濾瓶、布氏漏斗以及其他常規(guī)實驗室設(shè)備。

胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)品（99%，國家農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)檢中心），甲醇（色譜純，美國TEDIA公司），乙酸乙脂（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

1.2試驗材料

本試驗以黃壤、石灰土、水稻土作為供試土壤，其中黃壤采于貴州省清鎮(zhèn)市中八茶園；水稻土采于貴州省平壩縣稻田；石灰土采于貴州省關(guān)嶺縣花江旱地。土壤樣品采集后，攤成2 cm厚的薄層，間斷地壓碎、翻拌，揀出碎石、砂礫及植物殘體等雜質(zhì)，置于室溫自然晾干后，磨碎過2 mm篩，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。土壤的理化性質(zhì)見表1。

1.3試驗方法

1.3.1樣品處理稱取20.0 g 土壤（黃壤、水稻土、石灰土）于250 mL的具塞三角瓶中，加入120 mL乙酸乙酯于三角瓶中，置于振蕩器中振蕩（轉(zhuǎn)速190 r/min）提取60 min，抽濾并用5 mL乙酸乙酯洗滌殘渣，合并提取液，旋轉(zhuǎn)至干后加 5 mL 甲醇充分溶解，過0.45 μm有機(jī)濾膜，HPLC定量分析。

1.3.2色譜條件色譜柱：Thermo scientific BETASIL-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流動相：甲醇 ∶水=4 ∶1（體積比）；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測器：PAD；檢測波長：250 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取0.101 0 g（準(zhǔn)確至0.1 mg）胡桃醌（純度為99%）于稱量瓶中，用甲醇少量多次溶解后，將其定量轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，定容、搖勻后即得 1 000 mg/L 的胡桃醌儲備液，冷藏備用。分別量取不同體積的母液，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以胡桃醌的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、響應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。

1.3.4準(zhǔn)確度和精密度試驗方法的準(zhǔn)確度和精密度通過添加回收率和變異系數(shù)來表示[15]。3種土壤均分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.0、500.0 mg/L的胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液0.40 mL，使胡桃醌質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0、10.0 mg/kg，每組設(shè)定5個平行，樣品經(jīng)處理后，用HPLC法測定3種土壤中的胡桃醌殘留量。

1.3.5檢出限和定量限方法的檢出限為空白樣品（待測目標(biāo)物含量最低樣品）多次平行測定（n>5）的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍所對應(yīng)的濃度。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑的選擇

本研究在前人試驗的基礎(chǔ)上比較了5種溶劑（甲醇、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇 ∶乙酸（11 ∶1，體積比）的提取回收率（表2），回收率試驗結(jié)果表明，乙酸乙酯、三氯甲烷和乙腈的提取回收率較高，均能滿足回收率試驗要求，相比較而言，乙酸乙酯、三氯甲烷的回收率最好?？紤]到三氯甲烷毒性較大，一般在實驗室內(nèi)應(yīng)盡量少使用，因此選擇土壤中胡桃醌的提取溶劑時，以乙酸乙酯為佳。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

胡桃醌的峰面積和濃度具有良好線性相關(guān)性，線性方程y=35 288x+4 108.7，r=0.999 9，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。2.0 mg/L 胡桃醌標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2，胡桃醌的保留時間約為4.2 min，最小檢出量為5.0×10-9 g。

2.3儀器的精密度

待基線穩(wěn)定后連續(xù)對同一濃度的標(biāo)樣（2.0 mg/L）進(jìn)行6次平行測定，進(jìn)樣量為10 μL，其結(jié)果見表3。連續(xù)6次重復(fù)測定胡桃醌含量的變異系數(shù)為0.01%，保留時間變異系數(shù)為0.002%，說明該方法重現(xiàn)性好，儀器的精密度高。

2.4準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

由表4可以看出，胡桃醌在黃壤、水稻土、石灰中的平均添加回收率分別為85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、781%～84.6%，RSD分別為6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求[16]，胡桃醌在土壤中的空白回收率色譜圖、添加色譜圖分別見圖3、圖4。

2.5方法的檢出限和定量限

本方法中胡桃醌的最小檢出量為5.0 ng，土壤中的最小檢出濃度（LOQ）為1.0 mg/kg。

3結(jié)論

本研究結(jié)合了前人在提取核桃楸青果皮中胡桃醌時所選用的提取溶劑 通過試驗最終選取如下方法測定土壤中胡桃表4胡桃醌在3種土壤中的平均添加回收率醌含量：以120 mL乙酸乙酯振蕩提取60 min，抽濾并用5 mL乙酸乙酯洗滌殘渣，合并提取液，旋轉(zhuǎn)至干后加5 mL甲醇充分溶解，過0.45 μm有機(jī)濾膜，HPLC定量分析。當(dāng)胡桃醌的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0、10.0 mg/kg，胡桃醌在黃壤、水稻土、石灰土中的添加平均回收率分別為85.5%～86.6%、76.0%～89.1%、78.1%～84.6%，RSD分別為6.3%～8.2%、2.0%～5.9%、2.5%～3.4%，最小檢出量為5.0ng，土壤中最小檢出濃度為1.0 mg/kg。本方法樣品處理簡單，準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于土壤中胡桃醌殘留量的測定。

參考文獻(xiàn)：

[1]曲中原，鄒翔，胡國軍，等. 青龍衣中胡桃醌提取工藝研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報，2008，36（4）：30-32.

[2]Hejl A M，Koster K L.Juglone disrupts root plasma membrane H+-ATPase activity and impairs water uptake，root respiration and growth in soybean（Glycine max）and corn（Zea mays）[J]. Chen Ecol，2004，30：453-471.

[3]Inbaraj J J，Chignell C F. Cytotoxic action of juglone and plumbagin：A mechanistic study using HaCaT keratinocytes[J]. Chemical Research in Toxicology，2004，17（1）：55-62.

[4]李聰，張明曉，陳雯. 胡桃醌的合成研究進(jìn)展[J]. 精細(xì)化工中間體，2010，40（6）：11-15.

[5]劉紅兵，崔承彬，任虹，等. 天然來源萘醌及其人工衍生物抗癌劑的研究進(jìn)展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（1）：104-107.

[6]宮玉濤，宋文華，高敏苓，等. 2-羥基-1，4-萘醌在土壤中降解作用和淋溶行為研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2012，31（5）：957-961.

[7]王文澤，劉洪章，劉淑英，等. 核桃楸青果皮中胡桃醌的提取工藝研究[J]. 北方園藝，2013（15）：153-157.

[8]季宇彬，嚴(yán)琴琴，曲中原，等. 正交試驗法優(yōu)選青龍衣中胡桃醌的提取工藝[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24（3）：151-154.

[9]程力惠，黃曉文. 核桃楸樹皮中胡桃醌提取方法及其工藝研究[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2010，39（4）：33-35.

[10]Yang L X，Wang P，Kong C H.Effect of larch （Larix gmelini Rupr.） root exudates on Manchurian walnut（Juglans mandshurica Maxim.）growth and soil juglone in a mixed-species plantation[J]. Plant Soil，2010，329：249-258.

[11]De Scisciolo B，Leopold D J，Walton D C.Seasonal patterns of juglone in soil beneath Juglans nigra （black walnut）and influence of J.nigra on understory vegetation[J]. Journal of Chemical Ecology，1990，16（4）：1111-1130.

[12]索緒斌，高奎濱，張云凌，等. 高效液相色譜法測定青龍衣中胡桃醌含量[J]. 中藥材，2003，26（11）：793.

[13]孫墨瓏，袁海艦，宋湛謙，等. 分光光度法測定核桃楸樹皮中胡桃醌的含量[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，35（6）：37-38.

[14]孫墨瓏，宋湛謙，方桂珍，等. 減壓蒸餾法提取核桃楸樹皮中的胡桃醌[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27（6）：113-115.

[15]劉光學(xué)，喬雄梧，陶傳江，等，NY/T 788—2004農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則[S]. 北京：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2004.

[16]岳永德，朱魯生. 農(nóng)藥殘留分析[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004：36-80.董蒙蒙，喻樊，劉佳，等. 中華補(bǔ)血草5種黃酮類化合物抗氧化和抗腫瘤活性的比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：297-299.