牛精液新型冷凍保護(hù)劑的研究

桑國俊，邱忠玉，郭海龍，王 珂，容維中

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?44000）

牛的繁殖方式包括本交和人工授精，人工授精又分鮮配和凍配，利用細(xì)管凍精進(jìn)行遠(yuǎn)程和集中實(shí)施人工授精是最主要的牛群繁殖方式。因此，細(xì)管凍精的質(zhì)量是確保人工授精受胎率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)管凍精的質(zhì)量受供精公牛健康狀況、飼養(yǎng)水平、精液品質(zhì)、細(xì)管凍精制作環(huán)節(jié)和保存條件的影響，這些環(huán)節(jié)中除細(xì)管凍精制作外都可以進(jìn)行人工標(biāo)準(zhǔn)控制和實(shí)施，而細(xì)管凍精制作環(huán)節(jié)受冷凍液、冷凍方法的影響較大。常規(guī)冷凍液的冷凍保護(hù)劑為甘油和蛋黃，在應(yīng)用中存在黏度過大、蛋黃脂肪顆粒大而不均勻，影響精子運(yùn)動(dòng)速率的問題，本試驗(yàn)的目的是篩選出一種黏度較小的新型冷凍保護(hù)劑，在不影響精液冷凍效果的前提下，提高精子的運(yùn)動(dòng)速率，提高人工授精的受胎率。

近年來的研究表明，在細(xì)胞、胚胎冷凍過程中，為了克服低溫對(duì)胚胎等微小生命的打擊，減少或消除細(xì)胞和組織間冰晶的形成，必須在培養(yǎng)液中添加一定量的抗凍劑。以前使用的主要是二甲基亞砜（DMSO）或甘油（GL），但是均對(duì)細(xì)胞或胚胎產(chǎn)生了一定的毒副作用，其中DMSO 的毒性比GL 強(qiáng)，所以現(xiàn)多用GL。乙二醇（EG）是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型抗凍劑，用EG 冷凍時(shí)，細(xì)胞產(chǎn)生的冰晶更少；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，EG 對(duì)細(xì)胞的毒副作用較小。本研究將在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，多梯度研究EG 保護(hù)精子的最優(yōu)劑量（精子活力和質(zhì)量最高時(shí)的EG 用量），用EG 替代GL。

1 材料與方法

1.1 種公牛

種公牛來自甘肅省寧縣興旺牧業(yè)牧業(yè)有限責(zé)任公司種牛場，包括西門塔爾牛（002 號(hào)）、夏洛來牛（11號(hào)）、早勝牛（03號(hào)）；甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所牛場的秦川牛（02號(hào)）。

1.2 采精、運(yùn)輸、冷藏冷凍設(shè)備、試劑

臺(tái)牛、人工采精器械、專用保溫箱、吸管、0.25 mL麥管、冰箱、冷凍儀；乙二醇（EG）、甘油（GL）、TCM199、果糖（Fructose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、檸檬酸、檸檬酸鈉、丙酮酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥基氨基甲烷（Tris）、雙蒸水、新鮮精制卵黃（磁力攪拌器攪拌10 min 以上過濾備用）、80萬IU 青霉素鈉（Penicillin Sodium）、泰樂菌素（Tylosine）等。利用臺(tái)牛人工采精，采集后的精液立即用專用保溫箱轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，按照程序進(jìn)行稀釋、分裝后在冰箱冷藏室進(jìn)行平衡處理和冷凍保存。

1.3 冷凍劑配制

傳統(tǒng)配方（對(duì)照組）：第一液：蒸餾水100mL，檸檬酸鈉2.97g，卵黃10mL；第二液：取第一液41.75 mL，加入果糖2.5g，甘油7mL。

試驗(yàn)配方（試驗(yàn)組）：第一液（同對(duì)照組）：蒸餾水100mL，檸檬酸鈉2.97g，精制卵黃10 mL；第二液：取第一液41.75mL，加入果糖2.5g，乙二醇EG的試驗(yàn)范圍為5～9mL。

1.4 解凍效果評(píng)定

對(duì)試驗(yàn)樣本按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)順序，在冷凍保存的24h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行解凍，觀察解凍后的活力、精子形態(tài)、精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行觀察測定，同時(shí)觀察評(píng)定解凍后精子的持續(xù)運(yùn)動(dòng)能力，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為精子直線運(yùn)動(dòng)的比率和運(yùn)動(dòng)速度。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合試驗(yàn)測定時(shí)已經(jīng)掌握的技術(shù)和試驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)計(jì)了分別以GL、EG 為冷凍劑時(shí)牛精液冷凍效果測定試驗(yàn)，其配方見表1和表4，2組各設(shè)計(jì)了12組配方。每個(gè)水平測定10次（重復(fù)），每次制作100支細(xì)管凍精，從中隨即抽檢10枚，每次抽檢測定均在制凍后24h 進(jìn)行。試驗(yàn)資料用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析，LSD 法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1以甘油（GL）為冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果

2.1.1 配方組合 在傳統(tǒng)配方的基礎(chǔ)上，適當(dāng)添加了泰樂菌素、VC、蔗糖和安鈉加。

各組合配方詳見表1。

表1 以甘油（GL）為冷凍保護(hù)劑的配方組合

泰樂菌素為新一代獸藥專用抗生素，抗菌譜廣，藥源性免疫反應(yīng)低；VC 和安鈉加具有較高的抗氧化作用，均有利于精子存活和延長精子存活期。設(shè)計(jì)不同配方組合的目的是在測定傳統(tǒng)配方效果的同時(shí)，還可對(duì)比測定添加其他成分后精子的保存效果，為完善該類型配方提供資料。

2.1.2 不同濃度GL 細(xì)管凍精解凍效果 按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)定的時(shí)間，對(duì)凍存24h后的試驗(yàn)凍精進(jìn)行解凍。解凍時(shí)先準(zhǔn)備好30℃水浴，將細(xì)管凍精在水浴中攪動(dòng)2～3s解凍，用細(xì)管剪剪掉細(xì)管兩端封口，分別在安排時(shí)段提取該管解凍精液抹片觀察和記錄，觀察溫度為25℃。

每組配方測定3枚細(xì)管凍精，對(duì)GL 濃度相同的組合并統(tǒng)計(jì)。解凍效果統(tǒng)計(jì)詳見表2。

表2 以甘油（GL）為冷凍保護(hù)劑時(shí)凍存凍精的解凍效果

測定結(jié)果表明：①不同濃度GL 組的凍精解凍活力不同。0h活力GL0.8、GL1.0、GL1.2高于其他組（P＞0.05）；6h活力GL1.2、GL1.4高于其他組（P＞0.05）；48h活力GL0.6、GL1.0最高，高于GL0.4、GL1.4（P＜0.05）和L0.8、GL1.2（P＞0.05）。

②活力衰減速率不一致。各組在0～6h期間的活力比較穩(wěn)定，6～30h期間活力迅速下降，而在30～48h 期間的活力又趨于穩(wěn)定。活力達(dá)到0.2以上的只有GL0.6、GL1.0和GL1.2組，其他各組的活力已經(jīng)明顯下降。③30h后的活力出現(xiàn)反彈。這是試驗(yàn)過程中出現(xiàn)的一種可視現(xiàn)象，并不能說明此時(shí)精子的受精能力提高了。其原因是部分低活力精子已經(jīng)死亡沉淀，精子濃度已經(jīng)降低，視野中可見精子數(shù)量減少，給人一種運(yùn)動(dòng)精子比例提高的錯(cuò)覺形成的。

2.1.3 相同濃度GL 細(xì)管凍精解凍效果 本項(xiàng)試驗(yàn)中，在測定不同濃度GL的同時(shí)，在平行配方中還添加了葡萄糖（Glucose）或安鈉加。其中1、3、5、7、9號(hào)添加了葡萄糖，12號(hào)添加了安鈉加。測定結(jié)果見表3。

表3 同濃度GL組其他組分變化與活力測定統(tǒng)計(jì)

測定結(jié)果表明：①在0～12h、36～48h階段，添加葡萄糖組合的活力顯著低于未添加組（P＜0.05），但在12～36h 階段的差異卻不顯著（P＞0.05）。②在配方12中添加了安鈉加，試驗(yàn)數(shù)據(jù)并未反映出其活化價(jià)值。

2.2 以乙二醇（EG）為冷凍保護(hù)劑時(shí)的精子凍存效果

2.2.1 配方組合 乙二醇系列配方與甘油的相似，將甘油替換為乙二醇。配方詳見表4。

2.2.2 不同濃度EG 細(xì)管凍精解凍效果 細(xì)管凍精的凍存和解凍及測定方法同GL 組。解凍效果詳見表5。

表4 以乙二醇（EG）為冷凍保護(hù)劑的配方組合

表5 以乙二醇（EG）為冷凍保護(hù)劑時(shí)凍存凍精的解凍效果統(tǒng)計(jì)

測定結(jié)果表明：①不同濃度EG 組的凍精解凍活力不同。0h活力EG0.7、EG1.0組高于其他組（P＞0.05）；6h 活 力EG0.7 高 于 其 他 組（P ＜0.05）；48h活力EG1.2最高，高于EG0.4、EG0.6、EG0.7、EG0.8（p＜0.05）和EG1.0（p＞0.05）。②活力衰減速率不一致。各組在0～6h期間的活力比較高，6～12h期間活力迅速下降，而在12～48h期間的活力又趨于穩(wěn)定并緩慢下降?；盍_(dá)到0.1以上的只有EG1.2和EG1.0組，其他各組的活力已經(jīng)明顯下降?；盍ο陆底羁斓氖荅G0.7組。該組配方中將卵黃用Tris替代，表明Tris的作用不如卵黃。③12h后的活力下降比較緩慢，這與GL各組的試驗(yàn)結(jié)果接近，原因也一致。

2.2.3 相同濃度EG 細(xì)管凍精解凍效果 本項(xiàng)試驗(yàn)中，在測定不同濃度GL的同時(shí)，在平行配方中還添加了葡萄糖（Glucose）或Tris。其中1、3、5、7、9、11號(hào)添加了葡萄糖，5、6號(hào)添加了Tris。測定結(jié)果見表6。

表6 同濃度EG 組其他組分變化與活力測定統(tǒng)計(jì)

測定結(jié)果表明：

①在0～18h階段，添加葡萄糖的1、3組合的活力顯著低于未添加組（P＜0.05），在18～48h階段的差異卻不顯著（P＞0.05）。

②在0～18h階段，添加葡萄糖的7、9、11組合的活力高于未添加組（P＞0.05），在18～48h階段的差異不明顯（P＞0.05），但活力均高于1、3組，說明EG 的用量以1.0、1.2時(shí)比較合適。③在配方5、6中添加了Tris，試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示其活力衰減非?？?。其配方中缺少卵黃，緩沖能力有限。

2.3 EG 和GL細(xì)管凍精解凍效果比較

對(duì)不同比例的EG 和GL與凍精解凍活力的關(guān)系測定后，進(jìn)一步對(duì)比分析EG 組和GL 組之間的比較效果。對(duì)2組解凍活力的統(tǒng)計(jì)詳見表7，其趨勢示意圖見圖3。

對(duì)每組36 份樣本的統(tǒng)計(jì)資料表明，EG 組和GL組在解凍活力方面還是存在差異，GL 組的活力高于EG 組，其中在0h、30h階段的差異不顯著（P＞0.05），其它階段的差異極顯著（P＜0.01）。

表7 同濃度EG 組其他組分變化與活力測定統(tǒng)計(jì)

3 討論

通過本次對(duì)EG 和GL組及其對(duì)比試驗(yàn)表明：

3.1 EG 和GL 對(duì)牛精子均有良好的冷凍保護(hù)能力。以解凍后6h階段測定的活力為例，GL組中以GL1.2（換算濃度為12%，下同）和GL1.4的活力最高，均為0.50；EG 組中以EG0.7（換算濃度為7%，下同）時(shí)的活力最高，達(dá)到0.53。高于國標(biāo)人工授精時(shí)精子活力應(yīng)該達(dá)到0.35以上的標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)易康樂報(bào)道，在不同濃度的乙二醇對(duì)水牛精子活力的影響進(jìn)行比較中，2%組要低于4%（P＜0.01）和6%組（P＜0.05），而4%濃度的乙二醇要高于6%組（P＜0.05）；4%濃度的乙二醇與7%濃度的甘油進(jìn)行比較試驗(yàn)，兩組在精子解凍后的活力、分裂率、囊胚率和囊胚孵化率等方面無顯著差異（P＞0.05）。蔡虹為了比較甘油（GL）、乙二醇（EG）和二甲基酰胺（DA）三種抗凍保護(hù)劑聯(lián)合應(yīng)用于肉牛精液的冷凍保護(hù)效果，分別設(shè)置了1%、3%、5%三個(gè)濃度進(jìn)行正交組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1%GL＋3%EG＋3%DA 組合冷凍效果最好（凍后活力達(dá)0.40），高于對(duì)照組（P＞0.05）。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果趨于一致，表明不僅GL，而且EG 也對(duì)牛精液有良好的冷凍保護(hù)作用，可以用作精子冷凍保護(hù)劑用于制作牛細(xì)管凍精。

3.2 其他營養(yǎng)成分的變化對(duì)EG 和GL 保護(hù)精子的效果有一定影響，特別是卵黃的作用在營養(yǎng)組份中的作用比較明顯。卵黃的成分比較復(fù)雜，其中的卵磷脂對(duì)精子的保護(hù)作用比較明顯。本試驗(yàn)中，添加卵黃的試驗(yàn)組活力均高于未添加組，高劑量卵黃組高于低劑量卵黃組，這在表3和表6統(tǒng)計(jì)資料中均有明顯反映。同時(shí)，添加葡萄糖、Tris、安鈉加等均不利于精子冷凍保存。據(jù)楊俊濤等報(bào)道，用1.50%的大豆卵磷脂取代卵黃進(jìn)行精子的冷凍保存，解凍精子的活力可以達(dá)到0.35以上，但無大豆卵磷脂時(shí)的活力較低，也表明卵黃或其他類型的卵磷脂對(duì)精子的冷凍保存非常重要，可顯著提高精子的活力。

3.3 在同等條件下，GL 對(duì)精子的冷凍保護(hù)效果優(yōu)于EG，EG 組的活力衰竭快于GL組。

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