CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)及其意義

謝建偉， 黃昌明， 鄭朝輝， 李　平， 王家鑌， 林建賢

CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)及其意義

謝建偉， 黃昌明， 鄭朝輝， 李平， 王家鑌， 林建賢

摘要:目的探討腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)及其意義。方法免疫組織化學(xué)方法檢測50例胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織和相應(yīng)癌旁組織中CD44v6蛋白的表達(dá)情況，分析CD44v6與胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)率為52.0%，在癌旁組織中未見表達(dá)，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD44v6與浸潤深度、N分期、TNM分期和細(xì)胞類型相關(guān)。CD44v6表達(dá)陽性與表達(dá)陰性患者術(shù)后5年生存率分別為19.4%和54.2%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單因素分析提示，浸潤深度、N分期、TNM分期、CD44v6高表達(dá)是影響患者預(yù)后的相關(guān)因素；多因素分析提示，CD44v6高表達(dá)和N分期為胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論CD44v6參與胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，可能是治療胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌的潛在靶點(diǎn)之一。

關(guān)鍵詞:胃腫瘤； 癌,神經(jīng)內(nèi)分泌； 干細(xì)胞； 生物學(xué)標(biāo)記； 抗原，CD44； 預(yù)后

作者單位: 福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院胃外科，福州350001

胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌是胃癌中較為罕見的一種，具有強(qiáng)烈的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，預(yù)后差[1-4]。胃癌干細(xì)胞在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[5-6]。有研究表明，腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44v6可介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性識(shí)別、粘附作用，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的趨化行為，促進(jìn)腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移[7-8]。目前，CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的作用尚不十分清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)檢測胃癌組織中CD44v6蛋白的表達(dá)，探討CD44v6與胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料收集2006年1月-2010年6月行根治性手術(shù)切除的胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌標(biāo)本50例，男性30例，女性20例，年齡中位數(shù)60.64歲(38～82歲)；小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌20例，大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌30例；行根治性全胃切除34例，根治性遠(yuǎn)端胃大部切除16例。TNM分期[9]:Ⅰ期0例 ，Ⅱ期13例，Ⅲ期37例，Ⅳ期0例?；颊叩呐R床病理資料采用“胃癌外科臨床數(shù)據(jù)管理與分析系統(tǒng)”進(jìn)行收集[10]。確診主要依據(jù)H-E染色下細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)和免疫組織化學(xué)特異的神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記，包括嗜鉻顆粒蛋白A(chromogranin A，CGA)、突觸素(synaptophysin，SYN)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuro specific enoclase，NSE)和CD56?；颊咝g(shù)前均未行放、化療。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色常規(guī)石蠟包埋切片，H-E染色，每例癌組織旁均有鄰近非癌組織(距離腫瘤≥5 cm處)作為對(duì)照。免疫組織化學(xué)染色采用SP法。廣譜二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；鼠抗人CD44v6單克隆抗體(英國Abcam公司)。免疫組織化學(xué)染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行，主要包括10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片、常規(guī)脫蠟至水、抗原修復(fù)、3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉、滴加一抗后4 ℃過夜、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物、DAB顯色、對(duì)比染色封片。CD44v6的稀釋比為1∶2 000，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2結(jié)果判定CD44v6以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。根據(jù)染色程度和染色細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)定和分析：不著色為0分，淺粉色或黃色為1分，粉色或棕黃色為2分，紅色或黃褐色為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率低于5%記0分，5%～24%記1分，25%～50%記2分，>50%記3分。由2位資深病理科醫(yī)師雙盲下獨(dú)立進(jìn)行結(jié)果判定。在低倍鏡下(×40)每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，所得結(jié)果取平均數(shù)，將染色程度與染色細(xì)胞百分率得分相乘，其乘積為最后得分。0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性()，>6分為強(qiáng)陽性()，其中(-)和(+)定為陰性，()和()定為陽性[11]。

1.2.3隨訪情況術(shù)后隨訪由專人負(fù)責(zé)，采用門診、電話、信件、上門等方式進(jìn)行，隨訪頻率為患者術(shù)后2年內(nèi)，每3月隨訪1次，2年后每6～12月隨訪1次。記錄的生存時(shí)間為手術(shù)時(shí)間至末次隨訪時(shí)間，或死亡時(shí)間,或隨訪數(shù)據(jù)庫截止的時(shí)間(2015年5月)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。用Spearman方法對(duì)CD44v6與臨床病理特征相關(guān)性進(jìn)行分析；用Life-Table法進(jìn)行生存分析。Kaplan-Meier法制作生存曲線，生存率的比較采用Log-rank法檢驗(yàn)。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。

2結(jié)果

2.1CD44v6蛋白在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)CD44v6主要表達(dá)在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織的細(xì)胞質(zhì)，陽性表達(dá)率為52.0%(26/50)，癌旁組織不表達(dá)，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.58，P=0.005，圖1)。

A：CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織陽性表達(dá)；B：CD44v6在癌旁組織陰性表達(dá).圖1　CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌及癌旁組織中的表達(dá)(　×200)Fig 1　The expression of CD44v6 protein in gastric neuroendocrine cancer and non-cancerous tissues (　×200)

2.2CD44v6蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系CD44v6表達(dá)與浸潤深度、N分期、TNM分期及細(xì)胞類型相關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、手術(shù)方式無關(guān)(表1)。

2.3CD44v6蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系全組患者的中位生存時(shí)間為48月，術(shù)后5年生存率為38.7%(圖2A)。CD44v6蛋白表達(dá)陽性與表達(dá)陰性患者的中位生存時(shí)間分別為25和48月，術(shù)后5年生存率分別為19.4%和54.2%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2B)。單因素分析提示,CD44v6高表達(dá)、浸潤深度、N分期和TNM分期與預(yù)后密切相關(guān)。多因素分析提示,CD44v6高表達(dá)和N分期為胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌的獨(dú)立預(yù)后因素(表2)。

表1CD44v6蛋白表達(dá)與胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌臨床病理特征的關(guān)系

Tab 1Correlation between CD44v6 expression and clinical variables of gastric neuroendocrine cancer patients

臨床病理參數(shù)nCD44v6n陽性χ2P性別0.8550.355 男3014 女2012年齡/歲0.0870.768 ≤602613 >602413d腫瘤/cm1.2020.273 ≤63118 >6198腫瘤部位5.1290.077 胃上部2517 胃中部145 胃下部114細(xì)胞類型6.4640.020 小細(xì)胞206 大細(xì)胞3020浸潤深度5.9530.015 T1~T281 T3~T44225淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10.4220.001 N0163 N13423TNM分期4.2760.039 Ⅱ144 Ⅲ3622手術(shù)方式1.9820.159 TG3420 DG166

TG：根治性全胃切除；DG：根治性遠(yuǎn)端胃大部切除.腫瘤直徑平均值(6.0 cm)；根據(jù)NCCN臨床實(shí)踐指南(2014)將N分期分為N0和N1.

3討論

CD44是一種跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族，是透明質(zhì)酸主要的細(xì)胞表面受體。2009年首次被發(fā)現(xiàn)為胃癌干細(xì)胞表面標(biāo)記物并可用于識(shí)別胃癌干細(xì)胞，參與胃癌細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲[12]。近來研究發(fā)現(xiàn)，CD44與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，從而被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因[13]。變異型CD44由變異的外顯子v1~v10構(gòu)成，其中以含有外顯子v6的CD44變異體即CD44v6與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系最為密切。在一項(xiàng)關(guān)于黏膜下胃癌的研究中，Okayama等發(fā)現(xiàn)，CD44v6是顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的唯一指標(biāo)[7]。筆者前期在胃腺癌的研究也發(fā)現(xiàn)，CD44v6與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Lauren分型和TNM分期密切相關(guān)。CD44v6陽性的患者5年生存率較陰性患者差(38.8%vs73.6%)[14]。本研究發(fā)現(xiàn),CD44v6在胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌中的表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.05)。CD44v6與浸潤深度、N分期、TNM分期和細(xì)胞類型相關(guān)。這些結(jié)果再次證實(shí)，在不同病理類型的胃癌中，CD44v6都參與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和侵襲，推測對(duì)CD44v6的研究可能具有較好的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

表250例胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者Cox模型多因素預(yù)后分析

Tab 2Multiple stepwise regression analysis with the Cox proportional hazards model of gastric neuroendocrine cancer patients

臨床病理指標(biāo)回歸系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤WaldP相對(duì)危險(xiǎn)度95%CITNM分期0.3420.5020.4640.4961.4080.526~3.765浸潤深度0.7391.0530.4930.4832.0930.266~16.473N分期2.2891.0694.5850.0329.8701.214~80.252CD44v6表達(dá)1.2260.5435.0970.0243.4071.175~9.875

A：全組患者生存曲線；B：CD44v6表達(dá)陽性組和陰性組生存曲線的比較(P=0.000).圖2　50例胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者預(yù)后Fig 2　The prognosis of 50 gastric neuroendocrine cancer patients with lymph node metastasis and CD44v6 expression

胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌是一種少見的胃癌，絕大多數(shù)患者在診斷時(shí)已為進(jìn)展期或晚期。目前臨床上多采用以手術(shù)為主的綜合治療，其預(yù)后較一般胃腺癌更差[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6表達(dá)陽性患者預(yù)后明顯較表達(dá)陰性患者差(P<0.05)。單因素和多因素分析也提示，CD44v6高表達(dá)為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素之一，說明CD44v6表達(dá)陽性有助于早期判斷胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌的預(yù)后。

綜上所述，腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44v6與胃神經(jīng)內(nèi)分泌癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和侵襲能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究CD44v6的功能及作用機(jī)制提供理論依據(jù)，也為胃癌神經(jīng)內(nèi)分泌癌靶向治療提供思路。

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(編輯：何佳鳳)

《福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》

雙月刊CN 35-1192/R郵發(fā)代號(hào) 34-66

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The Expression and Clinical Value of CD44v6

in Gastric Neuroendocrine Carcinoma

XIE Jianwei, HUANG Changming, ZHENG Chaohui, LI Ping, WANG Jiabin, LIN Jianxian

Department of Gastric Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression and significance of tumor stem cell surface marker CD44v6 in gastric neuroendocrine carcinoma.MethodsWe identified the expression of CD44v6 protein in 50 cases of resected gastric neuroendocrine carcinoma tissues and corresponding peritumoral tissues by immunohistochemistry, to investigated the association between the expression and the clinicopathologic factors and prognosis.ResultsThe expression rate of CD44v6 was significantly greater in gastric neuroendocrine carcinoma than in peritumoral tissues (52.0% vs 0, P<0.05), The expression of CD44v6 was related to depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage and cell classification.The 5-year survival rates of patients with positive and negative expression were 19.4% and 54.2%(P<0.05), respectively.Univariate analysis showed that the prognosis was significantly correlated with depth of invasion, lymph node metastasis, TNM stage, tumor size, and high CD44v6 expression.But only high CD44v6 expression and lymph node metastasis were independent prognostic factors on multivariate analysis.ConclusionsCD44v6 plays an important role in invasion and lymph node metastasis, and may serve as one of the potential therapeutic target of gastric neuroendocrine carcinoma.

KEY WORDS:stomach neoplasms; carcinoma, neuroendocrine; stem cells; biological markers; antigens, CD44; prognosis

通訊作者:黃昌明. Email:hcmlr2002@163.com

作者簡介:謝建偉(1979-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(81441123)；中國臨床腫瘤學(xué)科學(xué)基金(Y-N2014-008)；福建省自然科學(xué)基金(2014J01322)

收稿日期:2015-06-16

中圖分類號(hào):R341.32； R392.11； R735.2； R977.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-4194(2015)05-0280-04