動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸總動(dòng)脈糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體配體的表達(dá)及意義

汪強(qiáng)　谷惠敏　王楷文

(江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，*中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇昆山　215300)

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·論著·

動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸總動(dòng)脈糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體配體的表達(dá)及意義

汪強(qiáng)谷惠敏王楷文*

(江蘇省昆山市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，*中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇昆山215300)

摘要目的： 通過(guò)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸總動(dòng)脈中糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體配體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand， GITRL)的表達(dá)，探討GITRL在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的變化及意義。方法：建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，取其頸總動(dòng)脈，觀察粥樣硬化病變，采用免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)GITRL的表達(dá)。結(jié)果：動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸總動(dòng)脈的血管壁脂質(zhì)沉積明顯增多；彈性纖維不完整，連續(xù)性破壞、中斷。動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸總動(dòng)脈血管內(nèi)GITRL的表達(dá)水平明顯高于非動(dòng)脈粥樣硬化大鼠。結(jié)論：GITRL作為高脂飲食后表達(dá)上調(diào)的一種血管炎性分子，有望作為預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

關(guān)鍵詞動(dòng)脈粥樣硬化；糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體配體；炎性反應(yīng)

當(dāng)前，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)已成為威脅人類(lèi)健康的主要“殺手”。冠心病患者如果動(dòng)脈壁上的斑塊形成潰瘍或破裂，則會(huì)形成血栓，重者使整個(gè)血管血流完全中斷，而發(fā)生急性心肌梗死，甚至猝死[1]。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體配體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand，GITRL)是屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的Ⅱ型跨膜蛋白，其胞外區(qū)與其他TNF家族成員有20%的同源性。GITRL主要是組成性地高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞或一過(guò)性在抗原提呈細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)和一些腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)[2]。GITRL是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)的天然配體，能夠跨膜將膜外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到膜內(nèi)。直接刺激GITRL可以像刺激GITR一樣增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的功能，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集，以劑量依賴(lài)的方式上調(diào)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein，MCP-1)、IL-1和TNF-α的表達(dá)。GITRL在細(xì)胞的免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)等一系列生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷后，GITRL/GITR作為T(mén)細(xì)胞活化的共刺激分子，通過(guò)激發(fā)胞內(nèi)信號(hào)來(lái)調(diào)控T細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)一系列的炎性因子、趨化因子的產(chǎn)生[3]。

本研究通過(guò)高脂飲食建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，觀察頸總動(dòng)脈的血管病變及管腔的炎性反應(yīng)程度，檢測(cè)頸總動(dòng)脈中GITRL的表達(dá)，探索GITRL可能的炎性反應(yīng)機(jī)制。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量150～250 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將60只大鼠隨機(jī)分為正常飲食組和高脂飲食組，每組30只。

1.2動(dòng)脈粥樣硬化模型建立正常飲食組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組以高脂飼料喂養(yǎng)。高脂飼料配方：4%膽固醇，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86%基礎(chǔ)飼料(購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。喂養(yǎng)時(shí)間為6個(gè)月。

1.3標(biāo)本采集用10%水合氯醛溶液麻醉(0.1 g/100 g)大鼠，取頸部正中切口，暴露氣管，用血管鉗鈍性分離頸總動(dòng)脈、頸靜脈及迷走神經(jīng)，游離出一段長(zhǎng)約2 cm的頸總動(dòng)脈，在近心端和遠(yuǎn)心端分別結(jié)扎，剪斷血管。將部分標(biāo)本浸泡于10%甲醛溶液，用于病理分析，其余新鮮標(biāo)本于液氮冰凍后用于分子生物學(xué)檢測(cè)。

1.4病理組織學(xué)染色將標(biāo)本用石蠟包埋后切片，片厚2 μm。漂片水溫50℃，烘片溫度90℃。將石蠟切片裝上片架，置于60℃烘箱干烤1 h至石蠟融化，趁熱依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無(wú)水乙醇Ⅰ、無(wú)水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、70%乙醇、雙蒸水中，各5 min。將脫水后的石蠟切片置于pH 6.0的0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液槽中，水浴加熱至100℃，維持30 min。隨后進(jìn)行HE、油紅“O”及彈力纖維(EVG)染色。

1.5病理診斷動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠動(dòng)脈管壁增厚，平滑肌細(xì)胞增生，細(xì)胞排列紊亂，彈性纖維層結(jié)構(gòu)不清，局部管壁向管腔突出，形成纖維增生性斑塊(由平滑肌細(xì)胞及脂類(lèi)堆積形成)。部分斑塊表面出現(xiàn)纖維帽，纖維帽下由增生的平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞組成[6]。

1.6GITRL表達(dá)的檢測(cè)

1.6.1蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法取冰凍的頸總動(dòng)脈組織，加入預(yù)冷并預(yù)混有蛋白酶抑制劑cocktail的放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液100 μL，勻漿震蕩混勻，置冰浴裂解20 min，12 000 r/min 離心10 min后收集上清液，用BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度。將蛋白樣品與等體積2×上樣緩沖液混勻，置于100 ℃水浴，煮沸5 min。配制120 g/L聚丙烯酰胺凝膠，按照每泳道蛋白總量相等的原則計(jì)算上樣量并上樣，80 V電壓下電泳20 min，待蛋白樣品條帶壓縮后以100 V電壓電泳90 min。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜3 h。取出PVDF膜，用30 g/L牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)封閉1 h；以1∶200稀釋的鼠抗GITRL抗體(美國(guó)Biolegend公司)在室溫孵育3 h，TBST洗滌5 min，洗3次；以 1∶10 000 稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育1 h，TBST洗滌5 min，洗3次；以 ECL-plus 為底物反應(yīng)1 min后，用美國(guó)GE公司Typhoon分子成像系統(tǒng)掃描并記錄結(jié)果。

1.6.2免疫組織化學(xué)法將經(jīng)過(guò)抗原熱修復(fù)的石蠟切片平鋪在濕盒內(nèi)，滴加甲醇稀釋的3%過(guò)氧化氫溶液，室溫放置30 min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌5 min，重復(fù)3次；滴加3% BSA，封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)，室溫放置30 min；去除多余的BSA溶液，滴加以3% BSA溶液1∶200稀釋的GITRL抗體，4℃過(guò)夜，次日晨取出；倒去多余的抗體溶液，用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，滴加3% BSA溶液 1∶200 稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，滴加以PBS 1∶100稀釋的ABC溶液，37℃孵育1 h；用PBS洗滌5 min，重復(fù)3次，滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色劑，室溫顯色，隨時(shí)觀察，適時(shí)終止顯色反應(yīng)。

2結(jié)果

2.1大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及驗(yàn)證2組大鼠喂養(yǎng)前體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；喂養(yǎng)6個(gè)月后，高脂飲食組體質(zhì)量高于正常飲食組(P<0.01)。在喂養(yǎng)的過(guò)程中，正常飲食組死亡4只，出現(xiàn)頸總動(dòng)脈粥樣硬化2只；高脂飲食組死亡6只，出現(xiàn)頸總動(dòng)脈粥樣硬化22只。與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1正常飲食組與高脂飲食組大鼠一般情況比較(n,%)

項(xiàng)目正常飲食組(n=30)高脂飲食組(n=30)喂養(yǎng)前體質(zhì)量/g196.3±10.1189.9±9.5喂養(yǎng)后體質(zhì)量/g213.1±4.9572.3±8.7*死亡4(13.3)6(20)動(dòng)脈粥樣硬化2(7.7)22(91.7)*

注：與正常飲食組比較，*P<0.01

正常飲食組大鼠頸總動(dòng)脈血管壁各層結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜光滑，內(nèi)襯單層內(nèi)皮細(xì)胞，中膜由3～5層彈力膜和平滑肌細(xì)胞相間組成，細(xì)胞排列有序，外膜由結(jié)締組織組成，EVG染色顯示血管內(nèi)壁彈性纖維完整、無(wú)中斷；高脂飲食組大鼠血管內(nèi)壁彈性纖維不完整，連續(xù)性破壞、中斷；見(jiàn)圖1。正常飲食組大鼠可見(jiàn)頸總動(dòng)脈內(nèi)膜完整、排列整齊，中膜平滑肌細(xì)胞體積、排列正常，內(nèi)膜及中膜均未見(jiàn)泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉堆積，高脂飲食組大鼠內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、變性，部分缺失，內(nèi)膜明顯增厚，含大量的泡沫細(xì)胞，中膜平滑肌細(xì)胞增生，內(nèi)膜及中膜均可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)堆積。見(jiàn)圖2。高脂飲食組大鼠血管壁脂質(zhì)物質(zhì)明顯增多，見(jiàn)圖3。

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

2.2血管組織中GITRL的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，高脂飲食組頸總動(dòng)脈血管組織表達(dá)的GITRL量明顯增加，見(jiàn)圖4。Western blotting結(jié)果也顯示，高脂飲食組大鼠頸總動(dòng)脈中GITRL蛋白表達(dá)水平較正常飲食組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

A：正常飲食組；B：高脂飲食組

圖5　Western blotting法檢測(cè)正常飲食組和高脂飲食組

3討論

動(dòng)脈粥樣硬化是全身性疾病，頸總動(dòng)脈與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化之間有一定相關(guān)性，故頸總動(dòng)脈粥樣硬化可作為預(yù)測(cè)冠心病的獨(dú)立因素[4-5]。動(dòng)脈粥樣硬化多發(fā)生在大、中動(dòng)脈的血管壁，是由多種慢性炎性刺激引起的一系列病理改變，與低密度脂蛋白膽固醇水平增高、脂質(zhì)堆積、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞聚集、局部血管平滑肌細(xì)胞遷移性增殖等因素密切相關(guān)[6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有控制凝血和纖溶、調(diào)節(jié)血管張力和血管生長(zhǎng)的功能。血管損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞黏附、遷移并產(chǎn)生多種細(xì)胞炎性因子、趨化因子、細(xì)胞黏附分子和蛋白水解酶，引起白細(xì)胞黏附、血小板激活和血栓形成，并引起血管平滑肌細(xì)胞的增生、遷移和凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)的增生和重構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞不僅分泌縮血管物質(zhì)(如內(nèi)皮素1和血管緊張素Ⅱ)，還能分泌舒血管物質(zhì)(如NO)。動(dòng)脈粥樣硬化即內(nèi)皮細(xì)胞功能受損致使內(nèi)皮素/NO平衡失調(diào)并由此導(dǎo)致血管收縮和平滑肌細(xì)胞增生的一種病理狀態(tài)。

雖然，目前GITR/GITRL的作用機(jī)制還不明確，但許多動(dòng)物模型的研究已經(jīng)證實(shí)，體內(nèi)GITR與其配體GITRL結(jié)合能夠促進(jìn)免疫系統(tǒng)過(guò)度活化，從而誘發(fā)或增加一系列炎性因子的表達(dá)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化組大鼠頸總動(dòng)脈組織中GITRL的表達(dá)水平較正常飲食組大鼠明顯升高，提示GITRL可以作為診斷動(dòng)脈粥樣硬化的相對(duì)特異的生物標(biāo)志物及血管炎性反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。今后可通過(guò)進(jìn)一步研究血漿中GITRL與其他相關(guān)因素的關(guān)系以及在冠心病人群中開(kāi)展研究確定GITRL在冠心病診斷治療中的價(jià)值。

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基本項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：31400131；81401677)

Expression and Significance of Glucocorticoid-Induced Tumor Necrosis Factor Receptor Ligand in Carotid Artery of Rats with Atherosclerosis

WANGQiangGUHuiminWANGKaiwen*DepartmentofCardiovascularMedicine,*TheCentralLaboratory,TheFirstPeople′sHospitalofKunshan,Kunshan215300,China

AbstractObjective： To explore the change in the expression of glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand(GITRL) in atherosclerotic process and its significance, by detecting the expression of GITRL in carotid artery of rats with atherosclerosis.Methods： Rat model of atherosclerosis was established and the atherosclerotic lesions were observed. The expression of GITRL in carotid artery was analyzed by immunohistochemical method and Western blotting. Results： The lipid deposition increased significantly in carotid artery of rats with atherosclerosis. The elastic fibers were incomplete and discontinuous. The endovascular expression level of GITRL was significantly higher in the carotid artery of atherosclerosis rats than that in the carotid artery of non-atherosclerosis rats.Conclusions： As a vascular inflammatory molecule, produced after high-fat diet, GITRL may become an independent risk factor for predicting the occurrence of atherosclerosis.

Key WordsAtherosclerosis；Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand；Inflammatory reaction

中圖分類(lèi)號(hào)R

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A