高遷移率族蛋白1在呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷大鼠中的表達(dá)變化

馬杰飛　何義舟　羅哲　屠國偉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上?！?00032)

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·論著·

高遷移率族蛋白1在呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷大鼠中的表達(dá)變化

馬杰飛何義舟羅哲屠國偉

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海200032)

摘要目的：探討呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury， VILI)大鼠肺組織中高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)的表達(dá)變化。方法： 將24只成年SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。對照組：自主呼吸；大潮氣量組：潮氣量(TV)=30 mL/kg；丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)干預(yù)組：尾靜脈注射EP(100 mg/kg)，機(jī)械通氣模式同大潮氣量組。采用Western blotting、RT-PCR、ELISA檢測大鼠血清、肺泡灌洗液、肺組織以及牽張24 h后肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中的HMGB1以及炎性因子的水平。結(jié)果：大潮氣量組大鼠血清、肺泡灌洗液及肺組織中HMGB1含量較對照組增加。體外肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中的HMGB1在機(jī)械牽張的作用下也呈現(xiàn)上升趨勢。EP干預(yù)后，VILI大鼠肺組織中HMGB1減少，且細(xì)胞凋亡信號通路相關(guān)蛋白Caspase3、 Caspase9和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)表達(dá)增加。結(jié)論：VILI大鼠模型中HMGB1的表達(dá)增加，可能與肺泡巨噬細(xì)胞受機(jī)械牽張有關(guān)；EP干預(yù)對VILI肺組織有一定保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷；高遷移率族蛋白1；丙酮酸乙酯

基本項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會基金項(xiàng)目(編號：201440333)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青年科學(xué)基金(編號：2013ZSQN/29)

呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)是機(jī)械通氣(mechanical ventilation, MV)的嚴(yán)重并發(fā)癥[1-2]。最近研究[3]顯示，炎性反應(yīng)在VILI發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)是一類參與DNA重組修復(fù)的DNA結(jié)合蛋白，它作為炎性反應(yīng)晚期介質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)其他炎性因子的分泌，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[4]。但是HMGB1參與VILI發(fā)病的機(jī)制目前仍不明確，也未見將HMGB1作為靶點(diǎn)干預(yù)VILI的相關(guān)研究。我們通過研究VILI模型中HMGB1的表達(dá)變化、可能的機(jī)制及丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)對其的干預(yù)效果，企盼為VILI的發(fā)病機(jī)制和治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料成年SD雄性大鼠24只，體質(zhì)量200~250 g(上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供)。HMGB1(貨號：ab77302)抗體購自英國Abcam公司，GAPDH(貨號：G8795)抗體購自美國Sigma Aldrich公司；Caspase 3(貨號：9665)、Caspase9(貨號：9509)與PARP(貨號：5625)購自德國CST公司；ELISA試劑盒購自美國Millipore公司。PCR引物由上海Sagon公司合成。

1.2分組及模型構(gòu)建將24只大鼠隨機(jī)分成3組，每組8只。對照組：保留自主呼吸；大潮氣量組：潮氣量(TV)=30 mL/kg，風(fēng)險(xiǎn)比(RR)=40次/min，吸呼比(I∶E)=1∶3，呼氣末正壓(PEEP)= 0，吸入氧濃度(FiO2)=21%；EP干預(yù)組：尾靜脈注射EP 100 mg/kg, 機(jī)械通氣模式同大潮氣量組。大潮氣量組和EP干預(yù)組大鼠在通氣期間每60 min將鼠臺向左或右傾斜，改變大鼠體位10~15 min，使肺各部位通氣均勻，整個(gè)過程中維持室溫26~28℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)按出血量和生理需要量維持補(bǔ)液(乳酸林格氏液，1 mL/kg)，定時(shí)加用麻醉藥和肌松藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)鼠，再提取其肺組織及細(xì)胞，經(jīng)HE染色檢測VILI模型是否構(gòu)建成功。

1.3細(xì)胞機(jī)械牽張大鼠肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)、1% 青霉素-鏈霉素的DMEM培液中，細(xì)胞置于37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至70%~80%融合后，進(jìn)行機(jī)械牽張。機(jī)械牽張的拉伸應(yīng)變率為20%，頻率為30次/min，牽拉/松弛力為1∶1，牽張24 h。隨后對細(xì)胞進(jìn)行檢測，以未施加牽張應(yīng)力的肺泡巨噬細(xì)胞為對照。

1.4標(biāo)本采集及檢測

1.4.1血標(biāo)本采集對照組于氣管切開30 min，自主通氣1、2、3、4 h，另兩組于機(jī)械通氣前、機(jī)械通氣1、2、3、4 h時(shí)，用肝素化的注射器經(jīng)股動脈導(dǎo)管抽取0.2 mL全血，在室溫下行動脈血?dú)夥治?。?shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)腹主動脈一次性抽取4 mL全血，于4℃、3000 r/min離心10 min后取上清液，置于-80℃凍存、待測。

1.4.2肺組織標(biāo)本采集及制備機(jī)械通氣4 h后(對照組氣管切開4 h)，經(jīng)動脈放血處死大鼠， 迅速打開胸腔并結(jié)扎右側(cè)主支氣管，取出右肺上葉置于4%中性甲醛中固定，然后取右肺下葉置于EP管中，-80℃凍存，用剩余右肺組織計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)。取凍存的肺組織標(biāo)本，用磷酸鹽溶液(PBS)沖洗3次，按照100 mg/mL的比例把肺組織置入PBS中，用電動勻漿機(jī)制成勻漿，以4℃、12000 r/min離心20 min后取上清液，置于-80℃凍存待測。

1.4.3蛋白及mRNA檢測采用Western blot ting法檢測肺組織和細(xì)胞中HMGB1等蛋白的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參；用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測肺組織和細(xì)胞中的mRNA含量，以GAPDH作為內(nèi)參；用ELISA試劑盒檢測血清和細(xì)胞灌洗液中HMGB1的濃度。

2結(jié)果

2.1大鼠VILI模型的構(gòu)建HE染色結(jié)果顯示，與對照組(圖1A)相比，大潮氣量組VILI大鼠模型肺部組織形態(tài)不規(guī)整，有較多破裂肺泡，并有的巨噬細(xì)胞浸潤(圖1B)。與對照組比較，大潮氣量組大鼠的肺泡灌洗液中的炎性因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、IL-6、IL-10、干擾素-γ(INF-γ)表達(dá)升高(圖1C)。上述結(jié)果表明，大鼠VILI模型構(gòu)建成功。

2.2HMGB1在VILI模型中的表達(dá)變化與對照組比較，大潮氣量組大鼠的血清和肺泡灌洗液中HMGB1的mRNA或蛋白含量增加(圖1D、E、F)。

2.3機(jī)械牽張對肺泡巨噬細(xì)胞中HMGB1表達(dá)的影響對肺泡巨噬細(xì)胞施加20%牽張強(qiáng)度后，與未受牽張細(xì)胞相比，受機(jī)械牽張肺泡巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)液中TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10增多(圖2A)，HMGB1蛋白表達(dá)增加(圖2B)。

2.4EP干預(yù)對VILI的影響肺組織HE與TUNEL染色顯示，EP干預(yù)后，肺泡形態(tài)較為規(guī)整，且細(xì)胞凋亡明顯增加(圖3A)；ELISA結(jié)果顯示，EP干預(yù)后，肺泡灌洗液中炎性因子表達(dá)減少(圖3B)。

2.5EP干預(yù)抑制HMGB1的表達(dá)并激活細(xì)胞凋亡信號通路EP干預(yù)后，肺組織HMGB1的表達(dá)減少(圖4A)，細(xì)胞凋亡信號通路的關(guān)鍵蛋白Caspase3、 Caspase9和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白的表達(dá)增加(圖4B)。

A：對照組肺組織HE染色結(jié)果；B：大潮氣量組肺組織HE染色結(jié)果；C、D：ELISA檢測結(jié)果；E：肺組織RT-PCR檢測結(jié)果；F：肺組織的Western blotting結(jié)果。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1HMGB1在VILI大鼠模型中的表達(dá)變化

A：ELISA檢測結(jié)果；B：Western blotting 結(jié)果，與未牽張細(xì)胞比較，**P<0.01

圖2機(jī)械牽張對肺泡巨噬細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響

圖3　EP干預(yù)對VILI的影響

圖4　EP干預(yù)抑制HMGB1的表達(dá)并

3討論

巨噬細(xì)胞及炎性因子在VILI發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究[5]發(fā)現(xiàn)，肺泡巨噬細(xì)胞在機(jī)械牽張?jiān)缙诩纯杀患せ畈⒊蔀檠仔砸蜃拥闹饕獊碓础６狙芯孔C實(shí)VILI模型大鼠血清和肺泡灌洗液中HMGB1含量增加，為了研究這種變化是否與由肺泡巨噬細(xì)胞受到機(jī)械牽張有關(guān)，我們構(gòu)建了肺泡巨噬細(xì)胞機(jī)械牽張模型，結(jié)果表明肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)的HMGB1、TNF-α、IL-4等炎性因子均增加，證實(shí)VILI中HMGB1的增加與肺泡巨噬細(xì)胞相關(guān)。

HMGB1是一種DNA結(jié)合蛋白，參與DNA的重組、修復(fù)等生命活動。1999年Wang等[6]首次報(bào)告，HMGB1作為一種晚期炎性介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，而后一系列的研究表明，HMGB1是嚴(yán)重感染所致多器官功能障礙綜合征(MODS)的重要炎性介質(zhì)。有研究[4]指出，巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、垂體細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等受脂多糖(LPS)、INF-γ、生物活性脂等誘導(dǎo)后，胞內(nèi)HMGB1可被主動分泌到細(xì)胞外。在機(jī)械通氣過程中，大潮氣量通氣、高氣道壓等損傷因素均可導(dǎo)致VILI的發(fā)生，而這些因素可直接損傷各種細(xì)胞或間接激活上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或炎性細(xì)胞的細(xì)胞信號通路，造成各種細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)的釋放，因而VILI其本質(zhì)上來說也是一種炎性過程，而HMGB1作為一種炎性介質(zhì)是否參與VILI的發(fā)生則需要進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，VILI大鼠模型的肺泡灌洗液、血清及肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中HMGB1含量均上升，證實(shí)了上述假設(shè)。

美國食品和藥物管理局(FDA)已將EP列為安全藥物，并已通過臨床I期試驗(yàn)，安全性和穩(wěn)定性得到了肯定，目前II 期試驗(yàn)正在進(jìn)行中。本研究中，EP干預(yù)后，VILI大鼠肺泡形態(tài)及肺泡灌洗液中TNFα、IL-4等炎性因子減少，表明EP干預(yù)對VILI對肺部的炎性反應(yīng)具有一定抑制效果。Ulloa等[7]發(fā)現(xiàn)EP可抑制BALB/c小鼠巨噬樣細(xì)胞RAW264.7株中TNFα和HMGB1的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，EP干預(yù)后，VILI大鼠肺組織中HMGB1的表達(dá)減少，并使一系列細(xì)胞凋亡信號通路中的關(guān)鍵蛋白升高，如Caspase3、Caspase9和PARP。因此，我們認(rèn)為，EP干預(yù)對VILI具有保護(hù)作用。

綜上所述，VILI大鼠肺組織及血清中HMGB1的含量增加，說明機(jī)械牽張會促使肺泡巨噬細(xì)胞HMGB1的高表達(dá)并向外周組織釋放。EP干預(yù)可以明顯抑制VILI大鼠肺組織HMGB1的表達(dá)，并激活細(xì)胞凋亡通路，從而對VILI肺組織具有一定保護(hù)作用。HMGB1與EP的深入研究將為VILI的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的方向。

參考文獻(xiàn)

[1]Edibam C,Ventilator-induced lung in jury and implications for clinical management[J].Crit Care Resusc, 2000, 2(4):269-277.

[2]Lee WL, Slutsky AS,Ventilator-induced lung in jury and recommendations for mechanicalventilation of patients with ARDS[J].Semin Respir Crit Care Med,2001, 22(3):269-280.

[3]Murphy DB, Cregg N, Tremblay L, et al. Adverseventilatory strategycauses pulmonary-to-systemictranslocationofendotoxin[J].Am J RespirCrit Care Med,2000, 162(1):27-33.

[4]Pugin J, Dunn I, Jolliet P, et al.Activationofhuman macrophagesby mechanicalventilationinvitro[J]. Am J Physiol, 1998, 275(6 Pt 1):L1040-1050.

[5]Frank JA, Wray CM, McAuley DF, et al.Alveolarmacrophagescontribute to alveolar barrierdysfunctioninventilator-inducedlunginjury[J]. Am J Physiol Lung CellMolPhysiol, 2006, 291(6):L1191-1198.

[6]Wang H, Bloom O, Zhang M,et al.HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science 1999, 285(5425):248-251.

[7]Ulloa L, Ochani M, Yang H, et al.Ethylpyruvate prevents lethality in mice with establishedlethalsepsis and systemic inflammation[J]. ProcNatlAcadSci US A, 2002, 99(19):12351-12356.

Study on the Expression of High Mobility Group Box-1 Protein in Rat Model of Ventilator-Induced Lung Injury

MAJiefeiHEYizhouLUOZheTUGuoweiDepartmentofCriticalCareMedicine,Zhongshanhospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective：To investigate the expression of high mobility group box-1 (HMGB1) in rat model of ventilator-induced lung injury (VILI). Methods: Twenty-four healthy adult SD rats were randomly divided into three groups, with 8 rats in each group.The control group: autonomous respiration.The large tidal volume group: tidal volume(TV)=30 mL/kg.The ethyl pyruvate(EP) intervention group:EP 100 mg/kg via the caudal vein and the same ventilation mode as the large tidal volume group.The levels of HMGB1 and inflammatory factors in serum and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and lung tissues, as well as in the culture medium of alveolar macrophages before and after mechanical stretching, were detected with Western blot-ting, RT-PCR and ELISA. Results: The levels of HMGB1 in serum, BALF and lung tissues of the large tidal volume group were higher than those of the control group. HMGB1 in the culture medium of alveolar macrophages was increased under mechanical stretching.The expression of HMGB1 decreased, and the proteins related to signal pathway of apoptosis as Caspase3, Caspase9 and PARP increased,in lung tissues of rat with VILI after EP intervention. Conclusions: The expression of HMGB1 increases in rat model of VILI, which may be related with the effect of mechanical stretching on alveolar macrophages. EP intervention had certain protective effect on lung tissues with VILI.

Key WordsVentilator-induced lung injury；High mobility group box-1 protein；Ethyl pyruvate

通訊作者屠國偉，E-mail: tu.guowei@zs-hospital.sh.cn

中圖分類號R363.15

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A