一株耐鎳寡養(yǎng)單胞菌的分離及鑒定

王　鶴，巫晶晶，張金麗，王　潔，賈成光，張亞平

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；

2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021)

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一株耐鎳寡養(yǎng)單胞菌的分離及鑒定

王鶴1,2，巫晶晶1,2，張金麗1,2，王潔1,2，賈成光1,2，張亞平1,2

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；

2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021)

[摘要]從福建某五金廠綜合污水中篩選到一株對Ni2+耐受性400 mg/L的菌株，對其形態(tài)學(xué)、16S rDNA序列及生理生化特征進行分析，并利用較佳生長條件對所得菌株進行Ni2+吸附驗證.結(jié)果表明：該菌為革蘭氏陰性桿菌，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成的菌落，表面較光滑，邊緣整齊；經(jīng)16S rDNA序列比對及生理生化特征的分析，將菌株 JMUZJ-1鑒定為寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas sp.)；菌株JMUZJ-1生長的較好條件是pH 7.0，溫度30 ℃，NaCl質(zhì)量分數(shù)0.5%，在該條件下，菌株對Ni2+表現(xiàn)出良好的吸附性能.

[關(guān)鍵詞]微生物；篩選；重金屬；耐受菌；鎳

0引言

20世紀以來，人類對重金屬的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造活動逐漸增多，重金屬對環(huán)境的污染和破壞越來越嚴重[1].鎳是常見的重金屬污染元素之一，它主要來源于鎳金屬加工、電鍍工藝中的鎳殘渣，以及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中由于人類不合理的污水灌溉、過量施用化肥等污染物被過量排放到環(huán)境中，造成重金屬鎳污染加劇[2-3].鎳可以致癌[4]，對動物或人具有明顯的發(fā)育毒性和生殖毒性[5].因此，含鎳廢水的治理已成為環(huán)保領(lǐng)域中一個亟待解決的問題.

自然環(huán)境中的一些細菌、真菌及其衍生物對一些重金屬離子具有良好的選擇吸附性[6]，如：Seker等采用盤狀螺旋藍細菌(Spirulina platensis)吸附鉛、鎘和鎳[7]；Sangeeta等用熒光假單胞菌Presudomonassp.在一定條件下Ni2+吸附量可達61.51 mg/g[8]；Nikhil等用解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica,NCIM 3590)對重金屬Ni2+進行吸附研究，得到的最大吸附量為85.45 mg/g[9].同時，重金屬吸附還具有處理效率高、投資小、運行費用低等優(yōu)點[10].從重金屬污染水體中分離出重金屬耐受細菌，具有重金屬耐受性的菌株可能成為重金屬污染環(huán)境中生物修復(fù)的工程菌[11]，以達到處理重金屬污染的目的.因此，分離和篩選具有重金屬耐受性細菌，研究它們對重金屬的抗性和去除作用，對促進微生物在環(huán)境治理中的應(yīng)用具有重要意義.本研究從福建某五金廠綜合污水中篩選對鎳具有高耐受能力的菌株，并對其進行形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，進而確定該菌株的分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育地位，為今后利用微生物強化治理廢水中的鎳污染提供菌種來源.

1材料與方法

1.1　實驗材料

1)水樣福建某五金廠綜合污水，其中Ni、Cr、Fe、化學(xué)需氧量(CODcr)的質(zhì)量濃度分別為125、20、13、335 mg/L.

2)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2~7.4，配制固體培養(yǎng)基時向其中加入15~20 g/L的瓊脂.

重金屬培養(yǎng)基：準確配制含Ni2+10 g·L-1的重金屬溶液，用純水稀釋至所需濃度，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，無菌操作加入已滅菌的培養(yǎng)基中.

1.2　試劑與儀器

1)主要試劑細菌基因組DNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA少量抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；pMD?18-T載體(大連寶生物工程有限公司)；Ni(NO3)2(優(yōu)級純)，其他試劑均為分析純.

2)主要儀器HS-1300μ型水平層流雙人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；DPH-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)；ZHWY-2112B型恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；Tgradient 96型PCR儀(德國Biometra公司)；UV 5200型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；YXQ-LS-30SII 型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；H1650臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司).

1.3　實驗方法

1.3.1耐鎳菌株的篩選

取10 mL污水水樣于90 mL無菌水中，即為10-1，依次梯度稀釋到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9.吸取稀釋后的水樣0.1 mL涂布于含30 mg/L Ni2+的固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取長勢較好的菌落在含鎳遞增的培養(yǎng)基上多次劃線分離.

1.3.2菌株的鑒定

1)菌株形態(tài)特征觀察在固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上接種分離到的菌株，30 ℃培養(yǎng)48 h，將菌株經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察記錄菌株的形態(tài)特征.

2)菌株的16S rDNA的鑒定利用基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物擴增16S rDNA片段，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min.將擴增出的16S rDNA片段純化，與pMD?18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜.挑取平板上的白色菌落接入含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12~16 h，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，然后通過質(zhì)粒PCR進行陽性克隆驗證；將所得到的陽性克隆大腸桿菌送至上海立菲生物技術(shù)有限公司測序.將測得的16S rDNA序列通過NCBI(美國國立生物技術(shù)信息中心)的Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的16S rDNA核酸序列進行相似性分析.獲取同源性較高的16S rDNA序列，利用MEGA 4.0軟件Neighbor Joining方法進行系統(tǒng)發(fā)育分析.

3)生理生化試驗參照《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《伯杰細菌鑒定手冊(第八版)》[13]對菌株JMUZJ-1分別進行了15項生理生化特征鑒定：過氧化氫酶試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、脲酶試驗、酯酶試驗、吲哚試驗、糖類(葡萄糖；果糖；蔗糖；麥芽糖；木糖)發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗和檸檬酸鹽利用試驗.

1.3.3菌株生長特性試驗

1)種子液的制備挑取活化的JMUZJ-1菌體1~2環(huán)接入裝有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在30 ℃，120 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)18 h，得到的培養(yǎng)液即為種子液.

2)生長曲線的測定按體積分數(shù)2%接種量向液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中接入種子液，30 ℃、120 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)，定時取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，測定其OD600值；同時以不接菌的液體培養(yǎng)基作空白對照，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以O(shè)D600為縱坐標，繪制菌株JMUZJ-1的生長曲線.

3)pH值、溫度、鹽度對菌株生長的影響在一定初始pH值、溫度、鹽度下，將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按體積分數(shù)2%的接種量接種，30 ℃、120 r·min-1搖床培養(yǎng)，18 h后取樣，經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定其OD600值.

4)最小抑菌濃度(MIC)為了考察菌株JMUZJ-1對Zn2+、Cu2+、Cd2+、Cr6+等重金屬離子的耐受性，每種金屬配制一系列濃度遞增的固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，用劃線法將菌株JMUZJ-1接種到平板上.30 ℃培養(yǎng)3~5 d，觀察菌落的生長情況，確定各金屬離子的最低抑菌濃度.

1.3.4Ni2+吸附實驗

在一定的pH值和溫度下，將濕菌體投加到已知濃度的Ni2+溶液中，120 r/min恒溫振蕩一定時間后，取樣，8000 r/min離心10 min，用原子吸收分光光度計測定上清液中剩余Ni2+的濃度，計算去除率和吸附量.

2結(jié)果與分析

2.1　耐鎳菌的分離純化

采用濃度梯度篩選法，經(jīng)過反復(fù)劃線分離、多次傳代培養(yǎng)，分離純化到一株對Ni2+具有高耐受性的菌株，其抗性達到400 mg·L-1，命名為JMUZJ-1.該菌株在含重金屬的培養(yǎng)基中生長周期短，具有優(yōu)良的抗鎳性狀，其在生物治理鎳污染領(lǐng)域存在著很大的開發(fā)應(yīng)用潛力.

2.2　耐鎳菌鑒定

2.2.1菌株形態(tài)特征

菌株JMUZJ-1在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長迅速，30 ℃培養(yǎng)24 h后即可形成較大的菌落，JMUZJ-1的菌落，表面光滑，有光澤，中央突起，邊緣整齊.菌體的光鏡照片(如圖1)可見，個體呈桿狀，兩端鈍圓，不規(guī)則分散排列.此外，菌體長短不一，推測可能是菌株處于不同的生長周期所致.

2.2.2菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳檢測與序列分析

提取菌株JMUZJ-1的基因組DNA，以27F和1492R為引物PCR擴增該菌株的16S rDNA基因，得到一段長度在1000~2000 bp之間的目的片段(見圖2).將該片段與pMD?18-T載體連接轉(zhuǎn)化后得到的陽性克隆進行測序，得到菌株JMUZJ-1的16S rDNA序列長度為1507 bp.并將其提交至GenBank，獲得登錄號為KF286281.

2.2.3基于16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用BLAST程序?qū)⑺没蛐蛄信cGenBank 數(shù)據(jù)庫的序列進行同源性分析，結(jié)果顯示,菌株JMUZJ-1的16S rDNA序列與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonassp.)的序列相似性達99%.獲取與菌株JMUZJ-1同源性較高的序列，進行多序列比對，并利用軟件MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3).結(jié)果顯示，菌株JMUZJ-1與Stenotrophomonas maltophiliaJN39的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最為接近，處于同一個進化分支，因此，可初步判斷該菌株屬于寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)

2.2.4菌株的生理生化特性

對菌株JMUZJ-1進行系列生理生化試驗，結(jié)果表明：該菌株為革蘭氏陰性菌，過氧化氫酶陽性，具有強解脂性，能液化明膠，但不能水解淀粉，V-P試驗、甲基紅試驗、脲酶試驗、吲哚試驗、硝酸鹽還原試驗和檸檬酸鹽利用試驗均呈陰性反應(yīng).在糖類發(fā)酵中，產(chǎn)酸緩慢或產(chǎn)酸不明顯，但能分解麥芽糖，產(chǎn)酸明顯.以上這些特征與Stenotrophomonassp.的特征基本符合，結(jié)合形態(tài)學(xué)和16S rDNA的鑒定結(jié)果，將菌株JMUZJ-1鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)的一種.

2.3　菌株的生長特性試驗

2.3.1菌株JMUZJ-1的生長曲線

微生物的生長實際上是其自身對周圍環(huán)境中各種因素的綜合反應(yīng)，微生物的生長規(guī)律一般通過生長曲線來反映，以表示其在不同培養(yǎng)條件下的生長情況及生長過程[14].細菌的生長周期可分為延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段.由菌株JMUZJ-1的生長曲線(如圖4)可以看出，菌體在0~2h之間是生長的延滯期，菌株進入到新的生長環(huán)境之后，由于缺乏足夠的能量或某些必需的生長因子，導(dǎo)致菌體的生長受到限制，細胞的數(shù)目基本不變，但在此階段細胞的代謝活動并不是處于停滯狀態(tài)，細胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量均有所增加，因此，延滯期也可以看作是菌株對新環(huán)境的適應(yīng)期.2~14h為對數(shù)生長期，此階段細菌的代謝活動最為旺盛，菌體量呈指數(shù)遞增，菌株的生長繁殖速度達到最大值.從14h開始進入穩(wěn)定期，持續(xù)到26h，整個階段細菌的生長繁殖速度等于其死亡的速度，菌體細胞的數(shù)目保持穩(wěn)定，26h以后菌體的生長量開始減少，進入到衰亡期.在衰亡期，由于營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗以及部分菌體自溶等因素，使菌體表現(xiàn)出“負增長”現(xiàn)象.因此，選擇14~26h的培養(yǎng)時間不僅可以在較短的周期內(nèi)獲得較大的菌量，而且菌體活力也較高.

2.3.2pH值對菌株生長的影響

每種微生物一般都要在一個合適的pH值范圍內(nèi)才能生長繁殖.由不同pH值條件下菌株的生長量(如圖5)可知，在pH值為 5.0~7.0的范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，菌體的生長量也增加，在pH=7.0時，菌體的生長量達到最大值,OD600值為3.283，此后隨著pH值的增加，菌體的生長量有所下降.但總體來看，菌株JMUZJ-1具有寬泛的pH值生長范圍，在pH=5.0~11.0范圍內(nèi)均能較好地生長，其OD600值都在2.5以上，推測可能是菌株通過自身的生理代謝活動來調(diào)節(jié)周圍環(huán)境的pH值，使pH值維持在一個合適的生長范圍.

2.3.3溫度對菌株生長的影響

在20~40 ℃范圍內(nèi)考察了菌株JMUZJ-1的生長情況.由圖6可知，菌株在20~30 ℃范圍內(nèi)隨溫度升高生物量增加，30 ℃時菌株生長較好，OD600為3.252，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，OD600值有所下降.溫度主要基于細胞質(zhì)膜的流動性、生物大分子的活性以及物質(zhì)的溶解性等方面對微生物的生長代謝產(chǎn)生影響，溫度過低導(dǎo)致細胞質(zhì)膜的流動性、生物大分子的活性和物質(zhì)的溶解性均降低，從而使微生物細胞的生理代謝活動受到抑制，而溫度過高，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸及酶類等生物大分子發(fā)生變性或凝固，使其活性消失，微生物細胞的生長受到抑制，甚至死亡.

2.3.4鹽度對菌株生長的影響

實驗考察了培養(yǎng)基中不同鹽度對菌體生長的影響，結(jié)果如圖7所示.由圖7可以看出，菌株在無NaCl的培養(yǎng)基中能夠正常生長，說明Na+不是菌株JMUZJ-1生長的必需元素.菌株在質(zhì)量分數(shù)0.5%NaCl的培養(yǎng)基中長勢最好，OD600達到3.301，此后，隨著NaCl濃度的增加，菌體的生長受到抑制，當(dāng)培養(yǎng)基中的NaCl質(zhì)量分數(shù)大于6%時，菌株幾乎不生長.溶液中的Na+與維持微生物細胞的滲透壓有關(guān)，加入適量的鈉鹽有利于保持細胞的形態(tài)，但過高的鈉鹽會導(dǎo)致菌體細胞嚴重脫水，進而抑制細胞的生理代謝活動，甚至引起菌體細胞死亡.因此，為了獲得最大的菌體生長量，可以在培養(yǎng)基中加入適量的鈉鹽，對于菌株JMUZJ-1而言，培養(yǎng)基中的最適NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%.

2.3.5最小抑菌濃度(MIC)

最低抑菌濃度(MIC)可以反映細菌對金屬的耐受性，MIC值越大，菌株的耐受性越強，反之，耐受性越弱.結(jié)果表明，Ni2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Cr6+等幾種重金屬離子MIC值分別為400、200、270、70、190mg·L-1.可以看出，菌株JMUZJ-1對這幾種金屬離子表現(xiàn)出較高的抗性，其中對Ni2+的抗性最高，對Cd2+的抗性最低.菌株對重金屬的耐受性順序為：Ni>Cu>Zn>Cr>Cd，這可能是由菌株長期生長的特定環(huán)境所決定的.

2.4　菌株吸附Ni2+驗證試驗

在10mg/LNi2+溶液中投加一定量的菌體，于30℃下120r·min-1振蕩吸附，分別在1、3、5、10、20、30、40、50、60、90、120、180、240min后取樣測定Ni2+含量，考察菌株對Ni2+去除的影響，結(jié)果見圖8.從圖8可以看出，菌株在前10min對Ni2+的吸附速率很快，去除效率和單位吸附量分別為83.42%和5.56mg·g-1，達到平衡吸附量的94%，此后，隨著時間的延長，去除率和單位吸附量的增加速率顯著降低，在90min吸附趨于平衡.

3結(jié)論

1)本實驗分離篩選到一株對Ni2+的耐受性高的菌株JMUZJ-1.經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗結(jié)果及16SrDNA序列同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的菌株.

2)菌株JMUZJ-1在pH=7.0、溫度30 ℃、NaCl質(zhì)量分數(shù)0.5%、培養(yǎng)時間為20h時生長較好.

3)該菌對Ni2+有良好的吸附效果，質(zhì)量濃度為1.5g·L-1菌體吸附10mg·L-1的Ni2+120min后，去除率均達90%以上.

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(責(zé)任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Isolation and Characterization of a Nickel-resistantStenotrophomonasStrain

WANG He1,2,WU Jing-jing1,2,ZHANG Jin-li1,2,WANG Jie1,2，JIA Cheng-guang1,2,ZHANG Ya-ping1,2

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China；

2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China)

Abstract:A nickel resistant strain was obtained from a hardware factory in Fujian province by selection of spontaneous mutants in wastewater containing Ni2+.Morphological tests,molecular identifications of 16S rDNA and biochemical characterization to this strain have been performed.The efficiency of the strain in absorbing Ni2+under optimal growing conditions has been analyzed.The results showed that the nickel-resistant strain was Gram-negative.The strain produces yellow pigmented colonies on medium including beef extract and peptone,with smooth surface and neat edge.Sequence analysis of 16S rDNA and biochemical characteristics identified the strain JMUI-1 as Stenotrophomonas sp.The optimal growth condition for the nickel resistant strain is at pH 7.0,30 ℃,containing 0.5% NaCl solution,which allows JMUI-1 a good absorption performance of Ni2+.

Key words:microbial;screening；heavy metal;tolerant bacteria；Ni2+

[文獻標志碼]A

[中圖分類號]Q 939.97

[文章編號]1007-7405(2015)03-0186-07

[作者簡介]王鶴(1990—)，男，碩士生，從事環(huán)境微生物方向研究.通信作者：張亞平(1978—)，男，副教授，碩導(dǎo)，從事水污染控制理論與工程技術(shù)研究，E-mail:ypzhang@jmu.edu.cn.

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(51004053)；福建省高校杰出青年科研人才計劃項目(JA11146)；集美大學(xué)優(yōu)秀骨干教師第二層次項目(2011B003)；中國科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點實驗室開放基金項目(KLUEH201302)

[收稿日期]2014-06-17[修回日期]2014-07-10