人羊膜上皮細(xì)胞移植治療帕金森病模型大鼠的療效評(píng)價(jià)

陳 勇，方 寧，陳代雄，趙春華

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種常見于中老年人群的第二大中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。PD 的發(fā)生與蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、Parkin 基因等多種因素有關(guān)，其病理表現(xiàn)為大腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性、缺失，導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)減少［1，2］。PD的治療手段以藥物治療和手術(shù)治療為主，但均只能緩解癥狀，且有發(fā)生不良反應(yīng)和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)［3］。目前，細(xì)胞治療PD 患者或動(dòng)物模型已取得很大成功，可望成為治療PD 的新手段和趨勢［4～6］。人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)源于胎盤羊膜組織，研究顯示，hAECs 具有明顯的可塑性和多向分化潛能，在不同體外誘導(dǎo)條件下，可分化成來源于3 個(gè)胚層的不同組織細(xì)胞類型，同時(shí)其還具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用［7～10］。此外，hAECs獲取無侵入性傷害、易于制備、無倫理限制等優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)態(tài)行為學(xué)觀察，評(píng)價(jià)原位移植hAECs 對(duì)PD 模型大鼠的療效及其在腦組織中的存活、分化。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級(jí)雌性Wistar 大鼠30 只，體重220～250 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0005］。LGDMEM 培養(yǎng)基和FBS(GIBCO，烏拉圭);GlutaMax(GIBCO 公司，美國);小鼠抗人細(xì)胞核抗體(MAB1281;Chemcion，美國);兔抗人神經(jīng)元微管結(jié)合蛋白(microtubule associated protein-2，MAP-2)抗體(SANTA CRUZ，美國);阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)、6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)和小鼠抗人角蛋白(CK19)抗體(Sigma，美國);流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體CD29-PE，CD34-PE，CD45-FITC，CD44-FITC，CD73-PE，CD71-PE，CD80-FITC 和CD86-PE(BD，美國);兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAECs 的分離、培養(yǎng)及表型分析 經(jīng)產(chǎn)婦知情同意采集足月剖宮產(chǎn)羊膜，采用胰蛋白酶消化法分離hAECs，將分離的hAECs 懸浮于含10%FBS、1% GlutaMAX、55 μmol/Lβ-巰基乙醇和1%NEAA 的L-DMEM 培養(yǎng)基中，按5 ×105/cm2接種于培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞生長面積達(dá)80%以上即進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第3 代細(xì)胞用于細(xì)胞移植，并采用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur.BD)檢測其表型。取第3 代hAECs，按組合方案加入熒光素標(biāo)記的CD29-PE，CD34-PE，CD44-FITC，CD73-PE，CD80-FITC 和CD86-PE 的抗體振蕩混勻，每份樣品的采集細(xì)胞數(shù)≥104個(gè)，Cell Quest 軟件進(jìn)行表型分析。同型對(duì)照抗體為相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的小鼠IgG。制備第3 代hAECs 爬片，進(jìn)行免疫組化染色檢測CK19。

1.2.2 模型制備 大鼠用7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，固定于腦立體定位儀上，按Leaver 等［11］方法，參照大鼠腦立體定向圖譜確定右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(medial forebrain bundle，MFB)，坐標(biāo):前囟后4.6 mm，矢狀縫左側(cè)1.2 mm，顱骨骨膜下8.2 mm。用微量注射器3 μl 6-OHDA(0.1% Vit C 臨用前配制，濃度4 μg/μl)注入MFB，注射速度1 μl/min，留針15 min，退針?biāo)俣葹? mm/min。建模后1 w，腹腔注射多巴胺受體激動(dòng)劑APO 0.5 mg/kg 誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)，每周1 次連續(xù)4 w。若每次大鼠均以損毀側(cè)下肢為支撐點(diǎn)向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)，而且30 min 內(nèi)平均旋轉(zhuǎn)次數(shù)超過7 轉(zhuǎn)/min，視為造模成功［12］。假手術(shù)組以生理鹽水代替6-OHDA，其余操作同模型組。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與細(xì)胞移植 PD 模型大鼠隨機(jī)分為模型組、hAECs 原位移植組和假手術(shù)組，每組10 只。取第3 代hAECs 用不含血清的L-DMEM 培養(yǎng)基懸浮。原位移植組于造模注射位點(diǎn)注射8 μl hAECs 懸液(含3 ×105個(gè)細(xì)胞)，模型組同步注射等體積L-DMEM 培養(yǎng)基。

1.2.4 行為學(xué)觀察 細(xì)胞移植后各組PD 大鼠每周定時(shí)腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘導(dǎo)PD 樣癥狀，待大鼠旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定后，攝像記錄5 min 內(nèi)大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)(連續(xù)觀察10 w)。

1.2.5 hAECs 存活及分化檢測 分別于hAECs 移植后2 w 和12 w 每組取5 只大鼠，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，經(jīng)心插管依次用生理鹽水和4%多聚甲醛后，取腦組織置于4%多聚甲醛4 ℃固定，梯度蔗糖脫水，原位移植區(qū)連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。切片經(jīng)通透、封閉，滴加MAB1281 和MAP-2 抗體混合液4 ℃孵育過夜，用PBS 替代一抗作為對(duì)照。滴加 PE 標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG (針對(duì)MAB1281)與FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG(針對(duì)MAP-2)混合液，DAPI 復(fù)染，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 酪氨酸羥化酶免疫組化染色 冰凍切片3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS 漂洗，滴加TH 抗體(1∶ 300 稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗，DAB 顯色，沖洗，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以()表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAECs 形態(tài)及表型特征 hAECs 呈典型的貼壁生長特性，形態(tài)呈鋪路石樣，鵝卵石狀(見圖1A)。第3 代hAECs 表達(dá)CK19(見圖1B)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，第3 代hAECs 不表達(dá)CD 34、CD 80 和CD 86，高表達(dá)CD 73、CD 44 和CD 29(見圖2)。

圖1 hAECs 形態(tài)

圖2 hAECs 流式細(xì)胞術(shù)表型分析

2.2 hAECs 移植后PD 大鼠行為學(xué)變化 假手術(shù)組無1 例出現(xiàn)旋轉(zhuǎn)行為。hAECs 原位移植組大鼠于移植后2 w 開始旋轉(zhuǎn)次數(shù)均明顯減少(均P ＜0.05);至10 w，原位移植組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)仍明顯低于模型組(均P ＜0.05)(見圖3)。

圖3 hAECs 移植后PD 大鼠行為學(xué)變化

2.3 hAECs 在腦內(nèi)存活與分化 hAECs 移植后2 w 和12 w，原位移植組原位移植區(qū)腦組織均可見人細(xì)胞核特異性抗原陽性細(xì)胞(呈紅色熒光)，其中部分陽性細(xì)胞表達(dá)MAP-2(呈綠色熒光)(見圖4)。

圖4 hAECs 原位移植后表達(dá)MAP-2(免疫熒光染色，×400)

2.4 酪氨酸羥化酶的表達(dá) hAECs 移植后2 w，原位移植組大鼠黑質(zhì)紋狀體TH 表達(dá)較對(duì)照組(control)明顯上調(diào)，假手術(shù)組(sham lesioned)TH 表達(dá)最高(見圖5)。

圖5 移植后2 w 各組大鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶的表達(dá)

3 討論

PD 動(dòng)物模型是研究PD 發(fā)病學(xué)和治療學(xué)重要的生物模式。目前建立PD 模型主要用藥物1-甲基-4-苯基-四氫吡啶(MPTP)或6-羥基多巴胺(6-OHDA)損毀DA 能神經(jīng)元從而模擬PD 的病癥［13］。6-OHDA 建模致細(xì)胞損傷嚴(yán)重，模型穩(wěn)定且持久，行為學(xué)表現(xiàn)典型［14］，MPTP 建模方法簡便，成功率較高但行為學(xué)不典型，但停藥后病理癥狀可逆。MFB 是通過下丘腦外側(cè)區(qū)的一束神經(jīng)纖維，連接隔區(qū)、下丘腦和中腦的被蓋部位，黑質(zhì)致密部的DA 神經(jīng)元的軸突可以通過MFB 投射到紋狀體。本實(shí)驗(yàn)借助立體定位儀單點(diǎn)注射6-OHDA 定向損毀MFB，成功建立了PD 大鼠模型。行為學(xué)動(dòng)態(tài)觀察顯示，hAECs原位移植組大鼠于移植后2 w 開始，旋轉(zhuǎn)次數(shù)均明顯減少，且在觀察滿10 w 時(shí)未見反彈。

hAECs 在異基因宿體體內(nèi)的存活及分化是學(xué)科界關(guān)注的重要問題。體外誘導(dǎo)培養(yǎng)研究證明，hAECs 在特定的誘導(dǎo)條件下可分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞［15］。楊新新［16］報(bào)道hAECs 植入大鼠側(cè)腦室后表達(dá)TH，提示hAECs 可在病損腦組織分化成DA 能神經(jīng)元。MAP-2 主要表達(dá)于成熟神經(jīng)元的胞漿和樹突，TH 既是多巴胺合成的限速酶，也是DA 能神經(jīng)元特異性標(biāo)志之一，黑質(zhì)TH 含量和活性降低及由此導(dǎo)致的DA 匱乏是PD 發(fā)病的主要環(huán)節(jié)［17］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光和免疫組化染色觀察到hAECs 原位移植后12 w，大鼠腦損毀原位可見MAB1281 陽性細(xì)胞，說明移植的hAECs 至少可在模型動(dòng)物腦組織內(nèi)存活12 w 而未被排斥，這種免疫豁免特性與其不表達(dá)共刺激分子CD80(B7-1)和CD86 (B7-2)有關(guān)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)部分MAB1281 陽性細(xì)胞表達(dá)MAP-2，腦損毀區(qū)TH 呈陽性，提示移植的hAECs 可在移植區(qū)分化成為多巴胺神經(jīng)元樣細(xì)胞，hAECs 改善PD 模型大鼠運(yùn)動(dòng)行為可能與其促進(jìn)黑質(zhì)TH 表達(dá)有關(guān)。

hAECs 移植治療神經(jīng)損傷的機(jī)制尚不明確。Palmatir 等［18］發(fā)現(xiàn)人、猴和鼠的羊膜組織中存在可溶性的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長的物質(zhì)，能促進(jìn)培養(yǎng)的脊髓后跟神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生長。進(jìn)一步的研究證明羊膜細(xì)胞含有胰島素樣生長因子、轉(zhuǎn)移生長因子、前列腺素、和表皮生長因子樣物質(zhì)等因子，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞起到營養(yǎng)作用［19～21］。hAECs 可通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophic factors，NTFs)，NTFs 和可溶性炎癥抑制因子可緩解黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的進(jìn)行性退化和凋亡［22，23］，使病程得以緩解。至于由hAECs 分化而來的具有某些多巴胺能神經(jīng)元特征的細(xì)胞是否起到了對(duì)PD 大鼠多巴胺能神經(jīng)元的補(bǔ)償，并起到神經(jīng)功能重建的作用，目前尚不清楚，除非能證明由供體細(xì)胞分化而來的神經(jīng)元樣細(xì)胞之間及與宿主神經(jīng)元之間確建立了新的神經(jīng)元環(huán)路。這是值得深入研究的重要內(nèi)容，對(duì)揭示細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生物學(xué)機(jī)制具有重要意義。

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