Omi/HtrA2 在無鎂外液致癇海馬神經(jīng)元凋亡中的作用機制及其特異性抑制劑UCF-101 的神經(jīng)元保護作用

金 迪，連亞軍，張海峰，謝南昌，高延倫

癲癇是多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征［1］，其發(fā)作形式復(fù)雜，反復(fù)發(fā)作給患者的生活帶來了極大的痛苦，因此明確癲癇的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點尤為重要。近年來，癲癇導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的相關(guān)分子機制受到人們的很大關(guān)注，外來因素致癇神經(jīng)元后，壞死的、凋亡的以及抗凋亡的信號途徑均被激活，它們之間的平衡被破壞，促凋亡蛋白表達相對更高，進而促進神經(jīng)元凋亡的發(fā)生［2］。如何精確調(diào)控神經(jīng)元凋亡，有望成為抗癲癇治療的新靶點。Omi/HtrA2 是一種定位于線粒體膜間隙的絲氨酸蛋白酶，是細胞內(nèi)線粒體凋亡途徑中重要的信號分子。既往有研究證明，Omi/HtrA2 在腦缺血/再灌注損傷［3］、腎臟缺血再灌注損傷以及高氧誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞凋亡等疾病中，均發(fā)揮重要作用。但其是否參與體外癲癇模型中神經(jīng)元的凋亡過程，目前國內(nèi)外尚缺乏這方面的研究。本研究通過Sombati 法建立海馬神經(jīng)元自發(fā)性癲癇樣放電的細胞模型，該模型與臨床顳葉癲癇較為貼近，旨在觀察Omi/HtrA2 在體外癲癇模型神經(jīng)元凋亡中的作用機制，以及應(yīng)用其特異性抑制劑UCF-101 后，對神經(jīng)元凋亡以及XIAP、caspase3等蛋白表達的影響，探討UCF-101 的神經(jīng)保護作用，為臨床上癲癇的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物和主要試劑 新生24 h 以內(nèi)SD 大鼠，SPF 級［鄭州大學動物實驗中心提供，許可證號SCxK(豫)2010-0002］;DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)基、PBS 液(HyClone);轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛胰島素、L-多聚賴氨酸、胰蛋白酶(Sigma);特級胎牛血清、B27 及Glutamax-I 谷氨酰胺(Gibco);青鏈霉素混合液(北京索萊寶);NSE 多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);山羊抗兔IgG/Cy3 熒光二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);基礎(chǔ)培養(yǎng)基:DMEM+0.2%轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.4%NaHCO3+1%青鏈霉素混合液;種植液:90%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%FBS+1%Glutamax-I+2%牛胰島素;維持液:93%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2%B27 +0.25% Glutamax-I+5% FBS;無鎂細胞外液(pH 7.4):145 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L 葡 萄 糖，0.002 mmol/L甘氨酸;正常細胞外液:無鎂外液各成分+1 mmol/L MgCl2;Anti-active caspase-3 抗體(abcam);Anti-HtrA2/Omi 抗體(abcam);Anti-XIAP 抗體(santa cruz);Anti-HAX-1 抗體(santa cruz)。線粒體和胞漿蛋白分離提取試劑盒(上海生工)。

1.2 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 新生24 h 內(nèi)的SD 大鼠，常規(guī)消毒，斷頭取腦，置于加有預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，分離雙側(cè)海馬，剔除表面血管，并剪成約1 mm×1 mm×1 mm 的組織塊，轉(zhuǎn)移至15 ml 的離心管中，加入0.125%的胰酶后，置于37 ℃恒溫箱中消化15 min，期間每隔數(shù)分鐘輕微振蕩，消化完畢后1500 r/min 離心5 min，加入PBS 洗滌并終止消化，棄上清，加入種植液，吹打均勻制成細胞懸液。取少量細胞懸液用于臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5 × 105/ml，接種于6 孔培養(yǎng)板中(預(yù)先以0.01%L-多聚賴氨包被)，每孔約2 ml。置于37.5 ℃恒溫，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，等量換成含有B27 的維持液，以后每周2～3 次進行半量換液，并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，培養(yǎng)至7～10 d 用于后續(xù)實驗［4］。

1.3 NSE 染色鑒定海馬神經(jīng)元 海馬神經(jīng)元在放置有爬片的24 孔板中生長至7 d 后，進行NSE鑒定。吸棄培養(yǎng)基，PBS 漂洗1 遍，然后用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 漂洗3 遍，每次5 min;0.25%Triton 穿孔15 min，吸棄Triton，PBS 漂洗3 次，每次5 min;1%BSA 室溫下封閉30 min，加入兔抗大鼠NSE 多克隆抗體(稀釋200 倍)4℃過夜，TBST 漂洗3 次，每次5 min，加入山羊抗兔IgG/Cy3 熒光二抗，以下操作步驟均需避光進行，37 ℃作用1 h;TBST漂洗3 次，每次5 min，5 μg/ml DAPI 染色2 min，吸棄DAPI，TBST 漂洗，抗熒光猝滅封片劑封片，放入濕盒避光保存，擇期在熒光顯微鏡下觀察。

400 倍熒光顯微鏡下隨機選擇10 個視野，以視野中陽性神經(jīng)元數(shù)目占觀察細胞總數(shù)的百分率為神經(jīng)元純度。

1.4 造模分組

1.4.1 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至10 d，隨機分為對照組和模型組 對照組用正常細胞外液培養(yǎng)3 h 后，更換為正常維持液繼續(xù)培養(yǎng)。模型組以無鎂細胞外液作用3 h 后，更換為正常維持液，并分別于造模后3 h、8 h、24 h 終止細胞培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.4.2 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至10 d，隨機分為對照組、致癇24 h 組、UCF-101 干預(yù)組、DMSO 組 其中UCF-101 干預(yù)組，在無鎂細胞外液作用前，加入10 μmol/L UCF-101(溶于DMSO 中)事先作用24 h，再行無鎂細胞外液誘導(dǎo)，造模后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，終止培養(yǎng)。DMSO 組致癇前給予相同濃度的DMSO 作用24 h，再行無鎂外液誘導(dǎo)，造模后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，終止培養(yǎng)。

1.5 western blot 法檢測Omi/HtrA2、caspase3、XIAP、HAX-1 蛋白表達變化 分別提取各組海馬神經(jīng)元線粒體蛋白、胞漿蛋白及細胞總蛋白。BCA 法測蛋白濃度，調(diào)整上樣量，每個泳道保證總蛋白量相等。SDS-PAGE 凝膠電泳(上層膠80 V 30 min;下層膠120 V 60 min)，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上(半干轉(zhuǎn))，5%脫脂奶粉封閉3 h。一抗孵育，兔抗大鼠Omi/HtrA2(1∶ 1000);兔抗大鼠caspase3(1 ∶ 200);兔抗大鼠XIAP(1 ∶200);兔抗大鼠HAX-1(1 ∶ 200)，4 ℃冰箱過夜。TBST 洗膜每次10 min，共3 次，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶ 8000)，室溫搖床緩慢孵育1 h，ECL 顯影成像重復(fù)3 次。采用Image J測定條帶光密度，以目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參條帶光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 TUNEL 法檢測神經(jīng)元凋亡 采用TUNEL法原位標記DNA 片段來檢測凋亡細胞數(shù)量，具體步驟按試劑盒提供的說明書進行操作，熒光素染色，熒光顯微鏡下進行觀察，每片選取10 個高倍視野，分別計數(shù)陽性細胞數(shù)，重復(fù)3 次，取其均數(shù)作為該例凋亡細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元形態(tài)學特征 海馬神經(jīng)元剛接種時形態(tài)基本呈圓形，體積較小，單個分布。培養(yǎng)3 h 后逐漸開始貼壁，24 h 后絕大部分細胞貼壁，而且部分神經(jīng)元長出短小突起，少數(shù)未能貼壁的細胞死亡。隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)元突起逐漸增多并延長，粗細不等，有的突起在遠端形成分支，3 d后明顯增長的突起開始相互連接成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元生長至7 d，細胞間連接更為緊密，立體感較強，神經(jīng)元胞體大多呈橢圓形或三角形，此時細胞較為豐滿，突起清晰，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)密集(見圖1)。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)不同時間新生大鼠海馬神經(jīng)元(A:24 h;B:3 d:C:5 d;D:7 d)

2.2 海馬神經(jīng)元純度測定 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至7 d，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶NSE 染色鑒定，純度為90%以上(見圖2)。

圖2 培養(yǎng)至7 d 的海馬神經(jīng)元NSE 免疫熒光染色

2.3 Western Blot 檢測各組海馬神經(jīng)元中Omi/HtrA2、caspase3、XIAP、HAX-1 蛋白表達的變化

2.3.1 Omi/HtrA2 在海馬神經(jīng)元中的表達以及致癇后其位置的改變 Western Blot 結(jié)果顯示，正常對照組中Omi/HtrA2 主要位于線粒體中，即線粒體中的蛋白表達量較高，隨著造模后時間的延長，Omi/HtrA2 逐漸釋放入胞漿內(nèi)，這種移動尤其在致癇后8 h、24 h 較為明顯，與正常對照組比較有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。而致癇后3 h 線粒體中的Omi/HtrA2 表達量較正常組線粒體中表達量有所上升，存在統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。由此說明，海馬神經(jīng)元致癇后，Omi/HtrA2 在線粒體中的含量短時間內(nèi)有所上升，隨后發(fā)生了顯著的移位，即由線粒體移位到了胞漿中(見圖3)。

2.3.2 UCF-101 對各組海馬神經(jīng)元中XIAP、active-caspase3、HAX-1 蛋白表達的影響 正常對照組中HAX-1 表達相對較高，致癇24 h 后，HAX-1 蛋白表達量顯著下降，與正常對照組相比有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。預(yù)先使用UCF-101 作用后，HAX-1表達量有所上升，與模型組有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。DMSO 組與模型組相比，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)(見圖4)。XIAP 表達量在模型組或DMSO組中均有所升高，但與正常組比較均無統(tǒng)計學差異，使用UCF-101 預(yù)處理后，XIAP 表達量較另外3 組有明顯的升高，存在統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。正常對照組海馬神經(jīng)元中active-caspase3 的蛋白表達量很低，模型組中此蛋白表達量明顯上調(diào)，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。UCF-101 處理組中此蛋白表達量明顯低于模型組(P ＜0.05)，DMSO組與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)(見圖5)。

圖3 WB 檢測各組Omi/HtrA2 在線粒體和胞漿中的相對含量

圖4 WB 檢測各組海馬神經(jīng)元中HAX-1 蛋白相對含量

圖5 WB 檢測各組海馬神經(jīng)元中XIAP 蛋白以及activecaspase3 蛋白相對含量

2.4 UCF-101 對體外癲癇模型中神經(jīng)元凋亡的影響 正常對照組熒光顯微鏡下觀察偶見少量TUNEL 染色陽性的細胞，模型組(致癇24 h 組)鏡下可見大量凋亡細胞，與正常對照組相比有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。UCF-101 組凋亡細胞數(shù)較模型組顯著減少，與模型組相比有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。DMSO 組凋亡細胞數(shù)與模型組相比無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)(見圖6)。

圖6 TUNEL 染色檢測神經(jīng)元凋亡:A 正常組B 致癇24 h 組C UCF-101 處理組D DMSO 組

3 討論

癲癇是僅次于腦卒中的最常見的神經(jīng)退行性疾?。?］，近年來，線粒體在后天獲得性癲癇例如顳葉癲癇中的作用日益受到人們重視。線粒體中某些蛋白在癲癇發(fā)作過程中從線粒體釋放入胞漿，從而對促凋亡、抗凋亡、壞死途徑的激活產(chǎn)生一定影響。因此，癲癇發(fā)作過程中發(fā)生亞細胞移位的蛋白，有望成為癲癇治療的新靶點。

IAPs 是細胞內(nèi)可以調(diào)控caspase 活性的凋亡抑制因子，這些因子包括XIAP、c-IAP1、c-IAP2 等。據(jù)報道這些凋亡抑制因子通過直接抑制起始caspase和效應(yīng)caspase 來阻斷凋亡途徑［6］。IAPs 包含一個或多個保守區(qū)域，即BIRs，這些BIR 區(qū)域在抑制caspase 活性方面發(fā)揮重要作用。BIR 區(qū)域和它們之間的連接部分直接與caspase 結(jié)合，并抑制其活性，但IAPs 的抗凋亡活性又可以被一些蛋白所調(diào)控，這些蛋白連接在BIR 區(qū)域上，通過破壞caspase-IAPs 復(fù)合體或促使IAPs 泛素化降解來激活caspase活性，其中就包括Omi/HtrA2。Omi/HtrA2 是一種位于線粒體膜間隙的促凋亡的絲氨酸蛋白酶，據(jù)報道它主要通過兩種途徑促進細胞發(fā)生凋亡，即caspase 依賴性途徑和caspase 非依賴性途徑。和AIF、細胞色素C 一樣，Omi/HtrA2 在凋亡過程中，從線粒體膜間隙釋放到胞漿中，通過與IAPs 結(jié)合而激活caspase，發(fā)揮其促凋亡作用，此即caspase 依賴性促凋亡途徑［7］。但也有文獻報道，Omi/HtrA2 可以單獨依賴其蛋白酶活性發(fā)揮caspase 非依賴性促凋亡作用。

HAX-1 是一個分子量為35Kd 的抗凋亡蛋白，與BCL-2 家族的BH1 區(qū)和BH2 區(qū)有同源性。其可以在體內(nèi)或體外條件下通過Omi/HtrA2 的蛋白酶活性被裂解，而且其降解在凋亡過程中發(fā)生較早，Cilenti 等［8］早在2004 年就研究得出在Omi/HtrA2尚位于線粒體時，線粒體中的HAX-1 就已經(jīng)被其降解了。此項研究表明Omi/HtrA2 在線粒體中就可以通過裂解HAX-1 發(fā)揮其促凋亡作用，而這種作用與其在胞漿中通過裂解XIAP，激活caspase 發(fā)揮促凋亡作用，顯然是不同的。據(jù)相關(guān)文獻報道［9］，來自mnd2 鼠的細胞系攜帶有突變的Omi/HtrA2 基因，從而影響其蛋白酶活性，當給這種細胞系誘導(dǎo)凋亡時，HAX-1 幾乎不發(fā)生降解。而當功能性的Omi/HtrA2 基因?qū)氪朔N細胞系后，HAX-1 發(fā)生了降解。而用Omi/HtrA2 的特異性抑制劑UCF-101 預(yù)先作用于細胞后，HAX-1 的降解明顯減少，這些結(jié)論在Cilenti 等的研究中也都有提到。除此之外，既往有學者以出生14 d 的Wistar 大鼠為研究對象，以氯化鋰-匹魯卡品制造癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，研究Omi/Htra2 在癲癇發(fā)生過程中的作用機制，免疫熒光雙標顯示幾乎所有caspase3 陽性的細胞胞漿中都高表達Omi/HtrA2，但并不是所有高表達Omi/HtrA2 的細胞都是caspase3 陽性［10］，由此也提示Omi/HtrA2 可以通過caspase 非依賴性的方式促進細胞發(fā)生凋亡。

神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)模型是研究神經(jīng)元發(fā)育、分化、神經(jīng)再生、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生機制等眾多領(lǐng)域的重要模型，近年來在癲癇的研究中越來越受到重視。本次研究創(chuàng)新性的以體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，利用Sombati 法制造體外癲癇模型。進一步探索了Omi/HtrA2 在癲癇過程中的亞細胞移位，以及其對caspase3、XIAP、HAX-1 蛋白表達的影響。

研究結(jié)果得出，Omi/HtrA2 于細胞致癇后3h 在線粒體中的表達升高，隨后于致癇后8 h、24 h 發(fā)生了顯著的移位，胞漿中的Omi/HtrA2 含量在細胞致癇后3 h、8 h、24 h 均有提高，其中以8 h、24 h 最為顯著。其移位于胞漿中后，通過裂解XIAP 發(fā)揮其caspase 依賴性的致凋亡作用。但本次研究得出XIAP 表達在正常組與致癇24 h 組并無統(tǒng)計學差異，初步考慮可能是由于細胞遭遇應(yīng)激反應(yīng)后，為了維持細胞功能和結(jié)構(gòu)的完整性，海馬神經(jīng)元內(nèi)的XIAP保護性的增多，但隨著時間的延長，Omi/HtrA2 逐漸從線粒體釋放入胞漿內(nèi)，裂解并中和XIAP，又使其表達量下降，兩種作用綜合起來導(dǎo)致XIAP 表達量與正常組相比無明顯差異。但使用UCF-101 預(yù)處理后，其特異性的抑制Omi/HtrA2 的活性，而減弱了Omi/HtrA2 對XIAP 的降解作用，導(dǎo)致XIAP 表達量有明顯的提升。XIAP 被裂解后，解除了其對caspase3 的抑制作用，導(dǎo)致active-caspase3 蛋白的表達明顯上升。而HAX-1 在Omi/HtrA2 的作用下顯著減少，使用UCF-101 后HAX-1 表達量上升，差異有統(tǒng)計學意義，這與Lucia Cilenti 等人的研究結(jié)果是一致的。致癇24 h 后，TUNEL 染色結(jié)果顯示神經(jīng)元凋亡數(shù)目顯著增多，而使用UCF-101 后凋亡細胞有所減少，就是由于UCF-101 特異性的抑制了Omi/HtrA2 的促凋亡活性，從而抑制了神經(jīng)元的凋亡。

本次研究得出在無鎂外液誘導(dǎo)的神經(jīng)元癇性放電過程中，Omi/HtrA2 發(fā)生了明顯移位，并且通過降解XIAP、HAX-1 發(fā)揮其caspase 依賴性和caspase 非依賴性的兩種促凋亡方式，使用其特異性抑制劑UCF-101 后，上述兩種蛋白降解明顯減弱，抑制了caspase 的激活及神經(jīng)元的凋亡，對致癇海馬神經(jīng)元發(fā)揮一定的保護作用。但更需要進一步的研究，明確HAX-1、XIAP 被其裂解的具體時相，且UCF-101作為其特異性抑制劑，還有沒有別的不為人知的作用與抗凋亡相關(guān)，尚待進一步研究。

［1］Ferriero DM.Protecting neurons［J］.Epilepsia，2005，46(Suppl 7):45-51.

［2］Althaus J，Siegelin MD，Dehghani F et al.The serine protease Omi/HtrA2 is involved in XIAP cleavage and in neuronal cell death following focal cerebral ischemia/reperfusion［J］.Neurochem Intern，2007，50(1):172-180.

［3］張 偉，崔艷艷，姜寰宇，等.UCF-lOl 對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用［J］.解剖科學進展，2010，16(4):335-337.

［4］徐祖才，徐 平，張 駿，等.新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)及膜片鉗全細胞記錄［J］.重慶醫(yī)學，2012，41(31):3241-3242.

［5］Sloviter RS.The neurobiology of temporal lobe epilepsy:too much information，not enough knowledge［J］.Comptes Rendus Biol，2005，328(2):143-153.

［6］Deveraux QL，Leo E，Stennicke HR，et al.Cleavage of human inhibitor of apoptosis protein XIAP results in fragments with distinct specificities for caspases［J］.EMBO J，1999，18(19):5242-5251.

［7］Verhagen AM，Silke J，Ekert PG，et al.Omi/HtrA2 promotes cell death through its serine protease activity and its ability to antagonize inhibitor of apoptosis proteins［J］.J Biol Chem，2002，277(1):445-454

［8］Cilenti.L，Soundarapandian MM，Zervos AS.Regulation of HAX-1 anti-apoptotic protein by Omi/HtrA2 protease during cell death［J］.J Biol Chem，2004，279(48):50295-50301.

［9］Jones JM，Datta P，Srinivasula SM，et al.Loss of Omi mitochondrial protease activity causes the neuromuscular disorder of mnd2 mutant mice［J］.Nature，2003，425(6959):721-727.

［10］Rami A，Kim M.Translocation of the Serine Protease Omi/HtrA2 from Mitochondria into the Cytosol Upon Seizure-Induced Hippocampal Injury in the Neonatal Rat Brain［J］.Neurochem Res，2010，35(12):2199-2207.