pcDNA3.1-Pax6載體的構(gòu)建及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

黃　濤，彭志宏，黃柏勝

(1.湖南師范大學(xué)附屬中學(xué)， 湖南 長沙 410006； 2.長沙市雅禮中學(xué)， 湖南 長沙 410007；

3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系， 湖南 長沙 410013)

pcDNA3.1-Pax6載體的構(gòu)建及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

黃濤1，彭志宏2，黃柏勝3*

(1.湖南師范大學(xué)附屬中學(xué)， 湖南 長沙 410006； 2.長沙市雅禮中學(xué)， 湖南 長沙 410007；

3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系， 湖南 長沙 410013)

摘要：目的：構(gòu)建pcDNA3.1-Pax6過表達(dá)質(zhì)粒并觀察其對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響。方法:以K562細(xì)胞cDNA為模版，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增Pax6基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切回收后與同樣酶切回收的真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒，再經(jīng)菌落PCR、酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒至U251細(xì)胞。Real-time PCR檢測Pax6 mRNA的表達(dá)水平，Western blot檢測PAX6蛋白的表達(dá)，MTT法檢測U251細(xì)胞增殖。結(jié)果：PCR擴(kuò)增獲得長度為1 131 bp的陽性產(chǎn)物，經(jīng)pcDNA3.1真核表達(dá)載體克隆、酶切鑒定及序列分析后，證實(shí)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Pax6構(gòu)建成功；Real-time PCR結(jié)果顯示，Pax6過表達(dá)后的U251細(xì)胞Pax6 mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組；Western blot結(jié)果顯示，PAX6蛋白表達(dá)亦明顯高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MTT結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pax6組的細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力明顯降低，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：成功構(gòu)建人Pax6基因的pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒，過表達(dá)Pax6基因抑制U251細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞：Pax6基因； pcDNA3.1真核表達(dá)載體； 膠質(zhì)瘤細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

膠質(zhì)瘤是臨床上常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，因它具有高侵襲性，與鄰近正常腦組織無明顯分界，導(dǎo)致手術(shù)治療難以根除，常易復(fù)發(fā)、死亡率高。目前膠質(zhì)瘤的常規(guī)治療手段如手術(shù)切除、放療、化療效果并不滿意[1]，經(jīng)治療后的患者的中位生存期僅有14個(gè)月左右[2-6]，因此尋找膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中Pax6的表達(dá)水平明顯低于正常腦組織[4,7]，提示探索膠質(zhì)瘤中Pax6表達(dá)降低的確切機(jī)制，有望為明確膠質(zhì)瘤的侵襲性指明新思路。本研究通過構(gòu)建Pax6基因的過表達(dá)pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體lipofectamine 2000將pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，分別檢測Pax6基因mRNA和PAX6蛋白表達(dá)情況，并初步探討Pax6基因過表達(dá)后對U251細(xì)胞增殖的影響。

1材料與方法

1.1材料

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，Trizol(Invitrogen公司)，PCR TaqMix(廣州東盛生物公司)，瓊脂糖(Spanish公司)，凝膠回收試劑盒(OMEGA公司)，pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen 公司)，脂質(zhì)體lipofectamine2000(Invitrogen公司)，核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa公司)，酵母浸出粉、精解蛋白胨(Oxoid公司)，質(zhì)粒提取試劑盒(北京博大泰克公司)，BamHI、EcoRI、T4連接酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，一抗和二抗購自Santa Cruz，K562細(xì)胞和U251細(xì)胞(上海細(xì)胞所)，大腸桿菌DH5α菌株為本室保存。

1.2方法

1.2.1PCR擴(kuò)增目的基因Pax6

提取培養(yǎng)的K562細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模版，擴(kuò)增Pax6基因。擴(kuò)增引物由華大基因公司合成，序列如下：Pax6-ORF-F：GGATCCATGCAGAACAGTCACAGC(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))，Pax6-ORF-R：GAATTCTTACTGTAATCTTGGCCAGT(下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn))，預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 311 bp。產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照。

1.2.2PCR產(chǎn)物的回收純化、酶切與連接、轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物在紫外透射儀下切膠純化，產(chǎn)物回收純化按瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行；將回收純化后的產(chǎn)物及pcDNA3.1載體分別通過BamHI、EcoRI酶切，然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。

1.2.3陽性克隆的鑒定

采用菌落PCR法、酶切法及測序比對鑒定陽性克隆。挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB培養(yǎng)液中，從中取1 μL做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定；另外取經(jīng)菌落PCR鑒定的陽性克隆進(jìn)行抽提質(zhì)粒，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，具體操作方法按照試劑盒說明書進(jìn)行；測序比對鑒定則將酶切驗(yàn)證的陽性克隆菌液送武漢華大基因進(jìn)行雙向測序，以此進(jìn)一步證實(shí)插入片段Pax6-CDS序列的正確與否。

1.2.4Pax6表達(dá)的檢測

1.2.4.1Real-Time PCR檢測Pax6 mRNA的表達(dá)

將已經(jīng)構(gòu)建的pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒及pcDNA3.1空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染72 h后分別收集各組細(xì)胞。Real-Time PCR引物，Pax6正義鏈AGACACAGCCCTCACAAAC，反義鏈ATCATAACTCCGCCCATTC，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為157 bp；內(nèi)參β-actin正義鏈AGGGGCCGGACTCGTCATACT，反義鏈GGCGGCACCACCATGTACCCT，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為202 bp。

1.2.4.2Western Blot檢測PAX6蛋白的表達(dá)

在轉(zhuǎn)染72 h后用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，1 500 r/min離心去培養(yǎng)基；再分別用PBS重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心去上清，細(xì)胞沉淀用于提取蛋白。取一定量總蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST室溫封閉1 h，分別用稀釋的PAX6或內(nèi)參β-actin一抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST 漂洗3 次，用ECL Western blot 試劑盒檢測。

1.2.5MTT檢測細(xì)胞活力

分別在轉(zhuǎn)染后0 h、24 h、48 h、72 h處理各組細(xì)胞，96孔板每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL(終濃度為0.5 mg/mL)，孵育4 h，棄上清，每孔加入200 μL DMSO，震蕩20 min，置酶標(biāo)儀570 nm處測定光密度(OD)值。以正常對照組細(xì)胞活力為100%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力按以下公式計(jì)算：細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS16.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間兩兩單因素方差分析(one-way) 比較采用ANOVA檢驗(yàn)。Real-Time PCR數(shù)值分析采用2-ΔΔCt分析法計(jì)算基因表達(dá)的相對比值，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增目的基因Pax6

以K562細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Pax6，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為1 131 bp，與預(yù)期大小一致(圖1)。

2.2菌落PCR鑒定

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，5-8號孔有陽性條帶，即為陽性轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增條帶大小與預(yù)計(jì)產(chǎn)物1 131 bp一致；1-4號孔為陰性，N孔為空白對照(圖2)。

2.3pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒的酶切鑒定

陽性克隆經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見有兩條條帶，一條與pcDNA3.1空載體大小一致，另一條與目的片段1 131 bp大小一致，說明pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。

2.4pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒的測序鑒定

將酶切驗(yàn)證正確的陽性克隆菌液送武漢華大基因公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果(圖4)證實(shí)插入片段是Pax6 CDS序列，且與模板序列比對無點(diǎn)突變，Pax6基因CDS序列成功插入pcDNA3.1(+)載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M：DS2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: Pax6基因的擴(kuò)增產(chǎn)物M: DS2000 DNA ladder; 1: The amplified product of Pax6圖1 　Pax6的PCR擴(kuò)增Fig.1　PCR amplification of Pax6

M：DS2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；5,6,7和8為陽性轉(zhuǎn)化子M：DS2000 DNA ladder；5,6,7 and 8 holes are positive transformants圖2　pcDNA3.1-Pax6的菌落PCR鑒定Fig.2　Identifying pcDNA3.1-Pax6 by colony PCR

M：1 kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒酶切條帶M：1 kb DNA ladder; 1：Digested pcDNA3.1-Pax6圖3　 pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3　Double-enzyme digestion of pcDNA3.1-Pax6 recombinant plasmid

圖4　pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒的序列測定Fig.4　The sequencing map of pcDNA3.1-Pax6 recombinant plasmid

2.5Pax6 mRNA的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pax6過表達(dá)質(zhì)粒，Pax6表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，說明用脂質(zhì)體lipofectamine 2000能將外源性的Pax6轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染模型構(gòu)建成功(圖5)。

2.6PAX6 蛋白的表達(dá)

pcDNA3.1-Pax6過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，通過Western Blot檢測PAX6蛋白的表達(dá)，結(jié)果可見Pax6過表達(dá)后，PAX6蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，說明Pax6過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖6)。

2.7Pax6對U251細(xì)胞增殖的影響

在U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pax6過表達(dá)質(zhì)粒48 h后，MTT結(jié)果可見U251細(xì)胞的增殖能力較對照組開始降低，以72 h時(shí)增殖能力降低較顯著(P<0.05)。

Normal:對照組；pcDNA3.1：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體組；pcDNA3.1-Pax6：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒組；與對照組比較＊P<0.05Normal: Normal group; pcDNA3.1: transfected with pcDNA3.1 empty vector; pcDNA3.1-Pax6: transfected with pcDNA3.1-Pax6 recombinant plasmid; ＊P<0.05， vs Normal group圖5　Pax6 mRNA在U251細(xì)胞的表達(dá)Fig.5　The expression of Pax6 mRNA in U251 cells

(a)Western Blot檢測PAX6蛋白的表達(dá) 1：對照組；2：pcDNA3.1空載體組；3：pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒組； (b)PAX6蛋白的灰度掃描結(jié)果 Normal:對照組；pcDNA3.1：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體組；pcDNA3.1-Pax6：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒組；與對照組比較＊P<0.05(a)The expression of PAX6 protein by Western Blot.1:Normal group; 2:pcDNA3.1 vector group; 3:pcDNA3.1-Pax6 recombinant plasmid group；(b)The gray density results of PAX6 protein. Normal: Normal group; pcDNA3.1:transfected with pcDNA3.1 empty vector; pcDNA3.1-Pax6: transfected with pcDNA3.1-Pax6 recombinant plasmid; ＊P<0.05, vs Normal group圖6　PAX6蛋白在U251細(xì)胞的表達(dá)Fig.6　 The expression of PAX6 protein in U251 cells

＊P<0.05, vs Normal group圖7　Pax6對U251細(xì)胞增殖的影響Fig.7　Effects of Pax6 on the proliferation of U251 cells

3討論

膠質(zhì)瘤起源于膠質(zhì)細(xì)胞或其前體細(xì)胞，是臨床上常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，大約占顱內(nèi)腫瘤的40%-50%，病人確診后5年存活率少于3%[8,9]。膠質(zhì)瘤具有高侵襲性，與鄰近正常腦組織無明顯分界，使得手術(shù)治療難以根除，常易復(fù)發(fā)、死亡率高。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到惡性腫瘤實(shí)質(zhì)上是一種基因疾病，其發(fā)生、發(fā)展涉及多種基因水平的改變，導(dǎo)致正常細(xì)胞原癌基因和抑癌基因功能改變、細(xì)胞信號傳導(dǎo)受阻，細(xì)胞周期紊亂、細(xì)胞凋亡受到抑制等，結(jié)果出現(xiàn)細(xì)胞的異常增殖、自主侵襲、血管增生等惡性表型。因此，探索膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制、有效治療方法，積極開展膠質(zhì)瘤的基因治療成為目前神經(jīng)科學(xué)研究熱點(diǎn)之一。

Pax6是進(jìn)化上高度保守的Pax家族成員之一，定位于11p13染色體，該基因的正常表達(dá)在多種器官發(fā)生中起著決定性作用，與眼、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、鼻、胰腺和內(nèi)分泌腺等組織器官的發(fā)育有關(guān)，在腦中持久表達(dá)[10]，它廣泛地參與細(xì)胞增殖、遷移、分化和黏附等生命活動，在不同的組織和細(xì)胞中發(fā)揮不同的功能。如Pax6在多種內(nèi)分泌細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)，對維持血糖濃度穩(wěn)定和內(nèi)分泌的功能穩(wěn)定起著重要作用[11]。但Pax6在不同類型癌癥的生長、侵襲和血管生成中亦發(fā)揮不同的作用[12-15]。研究報(bào)道，Pax6促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞[16]和乳腺癌細(xì)胞[17]的增殖。抑制Pax6的表達(dá)，可通過增加Bcl-2、CDK1和PCNA的表達(dá)，降低BAX和p21的表達(dá)而促進(jìn)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡[18]；但在非小細(xì)胞肺癌A549、H1299細(xì)胞，抑制Pax6的表達(dá)，則通過抑制MAPK信號通路從而抑制癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程[19]。然而Pax6在膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平明顯低于鄰近正常腦組織[4,7]，過表達(dá)Pax6能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和侵襲[13,15]，Pax6可能是通過抑制G1期向S期轉(zhuǎn)化而抑制細(xì)胞生長[15]，或通過抑制VEGFA的表達(dá)而抑制腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移[20,21]。最近的研究顯示，Pax6作為microRNA-7的靶基因促進(jìn)結(jié)腸直腸癌Caco-2細(xì)胞、SW480細(xì)胞的增殖[22]，但Pax6作為microRNA-335的靶基因則抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞、U87細(xì)胞的增殖[23]以及抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖[24]。

本研究中我們成功構(gòu)建了Pax6基因的過表達(dá)pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體lipofectamine 2000將pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，Real-Time PCR及Western Blot結(jié)果顯示Pax6 mRNA及PAX6蛋白的表達(dá)均高于未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，我們的研究結(jié)果顯示過表達(dá)Pax6降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，提示Pax6基因在膠質(zhì)瘤中的低表達(dá)可能是膠質(zhì)瘤異常增殖、生長的原因之一。由于Pax6調(diào)控的基因眾多，而且Pax6本身又是多種microRNA的靶基因，對其調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，究竟Pax6基因是如何影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、生長的，還需要作深入研究，我們構(gòu)建的pcDNA3.1-Pax6重組質(zhì)粒將為進(jìn)一步研究Pax6基因的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction of Recombination Vector of pcDNA3.1-Pax6 and the Effect ofPax6 on Proliferation of Glioma Cells

HUANGTao1,PENGZhihong2,HUANGBaisheng3*

(1.The High School Attached to Hunan Normal University, Changsha 410006, Hunan， China; 2.Changsha Yali Middle School, Changsha 410007, Hunan, China; 3.Department of Physiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan, China)

Abstract：Objective：To construct over-expression plasmid of pcDNA3.1-Pax6 and investigate its impact on proliferation of glioma U251 cells. Methods：Pax6 gene was amplified from cDNA of K562 cells using RT-PCR. The Pax6 gene was restrictively digested and recycled, and then inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1.The recombinant plasmid pcDNA3.1-Pax6 was confirmed by colony PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing. The recombinant plasmid was transfected into U251 cells through lipofectamine 2000. The expression of Pax6 at mRNA and protein levels after transfection was identified by Real-time PCR and Western blotting, respectivly. The U251 cell proliferation was measured by MTT. Results：The purpose gene gained from PCR amplification had length of 1131 bp. Eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-Pax6 was identificated by colony PCR, enzyme digestion and sequencing analysis. Real-time PCR showed that the expression of Pax6 mRNA was increased in U251 cells transfected with Pax6 gene compared to the normal group. Western blotting results showed that PAX6 protein levels in U251 cells transfected with Pax6 gene was also over-expressed compared with the normal group (P<0.05). MTT results showed that transfection of pcDNA3.1-Pax6 inhibited the proliferation of the U251 cells compared to normal group (P<0.05). Conclusion: We successfully constructd the pcDNA3.1-Pax6 recombinant plasmid. Over-expression of Pax6 gene could inhibit the proliferation of the U251 cells.

Key words：Pax6 gene； eukaryotic expression vector pcDNA3.1； glioma cells； proliferation

文章編號：1007-7146(2015)06-0533-06

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號：R739.4

*通訊作者：黃柏勝(1966-)，男，湖南永州人，博士，主要從事腦神經(jīng)保護(hù)方向的研究。(手機(jī))13975182078； (電子郵箱)huangbs2078@163.com

作者簡介：黃濤，男，湖南長沙人，湖南師范大學(xué)附屬中學(xué)。(電子郵箱)huangt20130432@163.com

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ2157)

收稿日期：2015-08-28;修回日期:2015-09-30

doi:10.3969/j.issn.1007-7146.2015.06.008