MSC復(fù)合生物材料促進(jìn)缺血性糖尿病潰瘍愈合的研究

柏　力，楊明璨，譚　菊，孫建森　(.昆明軍區(qū)總醫(yī)院急診科，云南 昆明 650000；.第三軍醫(yī)大學(xué)人體解剖學(xué)教研室,重慶 400038)

MSC復(fù)合生物材料促進(jìn)缺血性糖尿病潰瘍愈合的研究

柏力1，楊明璨2，譚菊2，孫建森2(1.昆明軍區(qū)總醫(yī)院急診科，云南 昆明 650000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)人體解剖學(xué)教研室,重慶 400038)

[摘要]目的觀察MSC復(fù)合生物材料對(duì)缺血性糖尿病潰瘍愈合的作用，探討干細(xì)胞復(fù)合生物材料的臨床應(yīng)用前景。方法制作電紡絲生物材料，培養(yǎng)MSC細(xì)胞，通過電鏡觀察、增殖實(shí)驗(yàn)及條件培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用研究MSC復(fù)合生物材料的離體效果。并使用5～8周齡雄性C57BL/6J小鼠制備成糖尿病小鼠，結(jié)扎股動(dòng)脈近端，在大腿背側(cè)皮膚造成直徑5 mm全層創(chuàng)面。觀察MSC復(fù)合生物材料治療糖尿病足缺血性潰瘍的效果。結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn)將MSC種植與生物電紡絲材料上，通過掃描電鏡觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞足伸展，細(xì)胞間連結(jié)建立。高糖刺激下，MSC在生物材料上具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力。利用MSC在生物材料上生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)基作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。將單獨(dú)的MSC和MSC復(fù)合生物材料覆蓋在糖尿病小鼠大腿皮膚損傷處，發(fā)現(xiàn)MSC復(fù)合生物材料能夠有效提高M(jìn)SC對(duì)糖尿病足潰瘍的治療效果，促進(jìn)傷口愈合,有利于血管生成。結(jié)論MSC復(fù)合生物材料能夠促進(jìn)糖尿病足缺血性潰瘍愈合。提示干細(xì)胞復(fù)合生物組織材料在加速糖尿病足等缺血性潰瘍愈合方面具有很大治療潛力和應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]間質(zhì)干細(xì)胞(MSC);生物材料;缺血性糖尿病潰瘍;血管生成

隨著糖尿病患者的急劇增多，難治性糖尿病足的發(fā)病率也逐年攀升[1-2]。糖尿病足傷口由于失去了正常傷口愈合的機(jī)制和過程，常導(dǎo)致傷口愈合障礙[3-4]。該發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前的研究認(rèn)為糖尿病性周圍血管、神經(jīng)病變導(dǎo)致局部缺血性潰瘍是其主要致病因素[5]。當(dāng)前利用干/祖細(xì)胞等進(jìn)行糖尿病足的細(xì)胞治療成為研究熱點(diǎn)[6-7]。但單純細(xì)胞治療存在細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境不易改善，細(xì)胞生長(zhǎng)困難等局限[8]，因此迫切期待新型促進(jìn)血管新生的有效方案治療糖尿病足等缺血性潰瘍。

間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，因其具有多向分化潛能在人類疾病中應(yīng)用非常廣闊[9]。在心血管系統(tǒng)，MSC可以通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用[10]，還可分泌促動(dòng)脈新生的多種細(xì)胞因子[11]。但單純間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病足效果不佳。隨著生物材料在醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展，依賴生物材料實(shí)現(xiàn)藥物或細(xì)胞的靶向輸送和附著成為研究的熱點(diǎn)。將間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物材料移植到糖尿病足創(chuàng)面治療是否能夠提高治療效果，目前尚不清楚。我們將MSC種植在新型生物組織材料上，治療小鼠糖尿病足，觀察其傷口愈合的效果，分析其作用機(jī)制,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)均購(gòu)自Cyagen Biosciences(Guangzhou，China)。使用α-MEM，L-谷氨酰胺(2 mM)(all purchased from Hyclone Laboratories,USA)，青霉素(100 U/mL)，鏈霉素(100 mg/mL)(all purchased from Sangon.Com,China)和10%FBS(Gibco，USA)作為MSC基本培養(yǎng)基。含25 mM葡萄糖分別為MSC高糖培養(yǎng)基。RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone Laboratories,USA)，10%FBS(Gibco,USA)作為HUVEC基本培養(yǎng)基，30 mM葡萄糖分別為HUVEC低糖或高糖培養(yǎng)基[6]。HUVEC實(shí)驗(yàn)按CM類型而分組。

1.2MSC在材料上的觀察

接種8×103個(gè)MSC于生物材料上，37 ℃，5%CO2孵育48 h，采用掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用MTT法檢測(cè)MSC或HUVEC增殖能力。MSC單獨(dú)培養(yǎng)或者在生物材料上培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl的5mg/mL MTT(Sigma)，孵育4 h，更換150 μl DMSO(Sigma)，使用Emax酶標(biāo)儀(Molecular Devices)，用492 nm波長(zhǎng)測(cè)定每個(gè)樣品吸光度。HUVEC傳代后，添加1∶5稀釋的條件培養(yǎng)基[6]，培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μl的5 mg/mL MTT(Sigma)，孵育4 h，更換150 μl DMSO(Sigma)，使用Emax酶標(biāo)儀(Molecular Devices)，用492 nm波長(zhǎng)測(cè)定每個(gè)樣品吸光度。

1.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

按第三軍醫(yī)大學(xué)(Chongqing，China)頒布的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條例進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并得到第三軍醫(yī)大學(xué)倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。使用5～8周齡雄性C57BL/6J小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ，Sigma)，連續(xù)5 d，空腹血糖大于16.7 mmol/L為糖尿病小鼠[12]。制作糖尿病足模型[13]。結(jié)扎股動(dòng)脈近端，電凝小分支止血，使下肢缺血，在大腿背側(cè)皮膚造成直徑5 mm全層創(chuàng)面。MSC復(fù)合生物組織材料覆蓋于傷口區(qū)或直接將MSC滴附在傷口處，30 min后均使用TegadermTM透明敷料(Minnesota Mining and Manufacturing,USA)包扎。手術(shù)后，給予小鼠充足的食物和飲水，在恒溫、恒濕的環(huán)境中單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.5傷口愈合效果和組織學(xué)觀察

手術(shù)7 d后使用Nikon D90數(shù)碼相機(jī)(JaPan)，拍攝傷口，用IPP軟件分析傷口面積。按觀察時(shí)間切取傷口區(qū)皮膚，4%多聚甲醛固定，9 μm冰凍切片，進(jìn)行伊紅-蘇木精(H-E)染色。使用OLYMPUS BX50顯微鏡，對(duì)HE染色的切片，隨機(jī)選取10個(gè)視野(200×)，采用VERSOI 4.6軟件拍攝圖像。對(duì)傷口處的毛細(xì)血管密度進(jìn)行組織學(xué)定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)

2結(jié)果

2.1MSC在生物電紡絲材料上生長(zhǎng)良好

將MSC種植于生物電紡絲材料上，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行掃描電鏡觀察?？梢婋娂徑z生物材料纖維規(guī)則，孔隙均勻。MSC呈集落分布，生長(zhǎng)良好，細(xì)胞附著于生物電紡絲材料的孔隙中，細(xì)胞足長(zhǎng)出，細(xì)胞間建立了細(xì)胞連結(jié)(圖1)。

a:電紡絲生物材料掃描電鏡;b:MSC種植與電紡絲生物材料上培養(yǎng)48 h

圖1MSC在生物電紡絲材料上生長(zhǎng)情況

2.2高糖培養(yǎng)下MSC在生物電紡絲材料上的增殖能力

使用MTT法探討MSC高糖培養(yǎng)基對(duì)MSC的增殖作用，發(fā)現(xiàn)MSC在生物材料上使用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，其OD值是對(duì)照組的1.4倍(圖2a)。這提示高糖環(huán)境下，間充質(zhì)干細(xì)胞在生物材料上能夠更好地實(shí)現(xiàn)復(fù)制與增殖。

a：MSCs增殖的OD值比較，*:P<0.05，N=5;b:HUVECs在MSCs條件培養(yǎng)基中的增殖的OD值比較,*:P<0.05，N=5

圖2MSCs與HUVECs在不同條件下的增殖情況

2.3條件培養(yǎng)基對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用

為了解MSC條件培養(yǎng)基對(duì)HUVEC的增殖影響，使用MTT法發(fā)現(xiàn)，在HUVEC高糖環(huán)境下，相對(duì)于MSC條件培養(yǎng)基組，MSC+生物材料條件培養(yǎng)基組HUVEC增殖的OD值是前者的1.5倍(圖2b)。結(jié)果提示，高糖環(huán)境下材料上生長(zhǎng)的MSC具有更好的旁分泌功能，其分泌的活性因子進(jìn)入條件培養(yǎng)基能夠提高血管內(nèi)皮細(xì)生存和增殖能力。

2.4MSC復(fù)合生物材料加速糖尿病足愈合

為明確MSC復(fù)合生物材料是否具有促糖尿病足愈合的作用，我們制作了糖尿病足小鼠模型，傷口處覆蓋含有2×104cell MSC復(fù)合生物材料(治療組)或2×104cell MSC(對(duì)照組)。從手術(shù)開始，分別在術(shù)后即時(shí)和第7 天測(cè)量傷口面積。發(fā)現(xiàn)MSC復(fù)合生物材料治療組糖尿病足的愈合速度明顯加快，而MSC對(duì)照組的愈合率相對(duì)緩慢(圖3)，治療效果具有顯著差異(P<0.01)。

a:MSC組手術(shù)后即時(shí)創(chuàng)面;b:MSC復(fù)合生物材料組手術(shù)后即時(shí)創(chuàng)面;c:MSC組手術(shù)后7 d創(chuàng)面;d:MSC復(fù)合生物材料組手術(shù)后即時(shí)創(chuàng)面

圖3MSC復(fù)合生物材料治療糖尿病足潰瘍情況

2.5MSC復(fù)合生物材料促血管再生作用

血管新生是傷口愈合的關(guān)鍵事件[3-4]，為確定MSC復(fù)合生物材料促進(jìn)糖尿病足血管新生的能力，我們對(duì)第7 d傷口周圍皮膚進(jìn)行H-E染色。結(jié)果顯示，與MSC組相比，MSC復(fù)合生物材料組血管密度明顯增高(圖4)。說明MSC復(fù)合生物材料能夠促進(jìn)血管生成。

a:MSC組手術(shù)后7 d皮膚切片HE染色;b:MSC復(fù)合生物材料組手術(shù)后7 d皮膚切片HE染色。

圖4皮膚修復(fù)的病理染色

3討論

全世界范圍內(nèi)，每年有1.0%～4.1%的糖尿病患者發(fā)生不同程度的足部潰瘍，截肢率達(dá)到0.21%～1.37%，糖尿病足導(dǎo)致的截肢已經(jīng)成為非外傷截肢的最主要原因[14]。目前的研究認(rèn)為糖尿病足的發(fā)生主要是神經(jīng)、血管病變、感染相互作用的結(jié)果。初始階段，周圍神經(jīng)和血管病變是導(dǎo)致糖尿病患者發(fā)生糖尿病足的主要原因，當(dāng)局部潰瘍形成之后，潰瘍局部組織的過度炎癥也成為糖尿病足進(jìn)行性加重的主要原因之一。由于糖尿病足潰瘍喪失了正常傷口愈合的過程和機(jī)制，因此，傷口愈合存在障礙。糖尿病足的傳統(tǒng)治療主要有營(yíng)養(yǎng)治療和內(nèi)科治療。但是，大量臨床結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，傳統(tǒng)的治療只能減緩糖尿病足的進(jìn)展，并且作用微乎其微。細(xì)胞反應(yīng)或炎癥介質(zhì)等互相作用，有效參與傷口愈合過程[15]，血管新生是傷口愈合的關(guān)鍵部分[3-4]。針對(duì)糖尿病足病變特點(diǎn)，有效促使血管新生是解決問題的有效辦法。

間質(zhì)干細(xì)胞既具有多分化性[16]，又可以分泌IGF-1、bFGF、VEGF、IL-6等多種促動(dòng)脈生長(zhǎng)因子[11]。但是面對(duì)高糖的微環(huán)境，間充質(zhì)干細(xì)胞的功能受到抑制。干細(xì)胞治療雖然具有一定的優(yōu)勢(shì)，但是，隨著時(shí)間的進(jìn)展，單因素治療糖尿病足的效果逐漸不盡人意。為了提高干細(xì)胞治療的療效，目前已經(jīng)開發(fā)出了各種新型生物材料作為干細(xì)胞的載體，雖然取得了一定的效果，但是依然不能達(dá)到我們的預(yù)期。我們利用組織工程技術(shù)，人間質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合生物電紡絲材料，發(fā)現(xiàn)MSC能夠在高糖環(huán)境下更好地生長(zhǎng)增殖。并且其條件培養(yǎng)基能夠更好地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，這為加速糖尿病足血管新生，促進(jìn)傷口愈合奠定了基礎(chǔ)。MSC在生物材料上良好生長(zhǎng)并相互連結(jié)，是否能夠抵御高糖的損傷值得深入研究，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

通過生物材料復(fù)合MSC移植到糖尿病足創(chuàng)面后，細(xì)胞能夠鎖定在生物材料中較好發(fā)揮其旁分泌功能和多向分化的潛能，較單獨(dú)細(xì)胞移植，提高了促進(jìn)傷口愈合的治療效果。本研究雖然觀察周期比較短，但是已經(jīng)出現(xiàn)促進(jìn)血管新生和傷口愈合的良好效果，提示應(yīng)用干細(xì)胞生物組織工程技術(shù)治療糖尿病足等缺血性潰瘍具有重大發(fā)展?jié)摿?。這給我們帶來了治療糖尿病足的希望，下一步擬研究其長(zhǎng)期作用效果及其機(jī)制。

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(編輯：周小林)

Research of MSC-seeded biomaterials promoting ischemic diabetic ulcers repair

BAI LI1,YANG Ming-can2,TAN Ju2,SUN Jian-sen2(1.Department of Emergency,General Hospital of Kunming Military District,Kunming Yunnan 650000,China;2.Department of Anatomy,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of mesenchymal stem cells (MSC) in treating ischemic diabetic ulcers, and to explore its clinical perspectives. MethodsPrepared electro-spinning biomaterials and cultured MSC to study effect of MSC composite biomaterials in vitro by scanning electron microscope,MTT array and influence of MSC conditioned medium on endothelial cells. The use of 5 to 8 week old male C57BL/6J mice were prepared into diabetic mice,femoral artery ligation in the proximal thigh,in dorsal skin full-thickness wounds caused by the diameter 5 mm. Then the effect of MSC composite biomaterials on ischemic diabetic ulcers was determined.ResultsThis study found that the MSC grow well on electro-spinning biomaterials. Cells foot extension and connections between cells were observed by scanning electron microscope. Stimulated by high glucose,growth and proliferation of MSC has a stronger ability on biomaterials. MSC conditioned medium on biomaterials increased human umbilical vein endothelial cells proliferation ability. ConclusionMSC composite biomaterials can effectively improve the treatment effect of MSC on ischemic diabetic ulcers. The study indicated stem cells composite biomaterials have great potential and application prospect in the treatment of ischemic diabetic ulcers healing.

Keywords:mesenchymal stem cells (MSC);biomaterials;ischemic diabetic ulcers;angiogenesis

[收稿日期]2015-03-21[修回日期] 2015-05-15

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31200731)

doi:10.11659/jjssx.01E015043

[中圖分類號(hào)]R587.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1672-5042(2015)04-0370-04