Rho激酶和PKC在環(huán)孢素A改善休克血管反應(yīng)性中的作用及與MPTP的關(guān)系

雷　艷，楊新征，董昭君　(.第三軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)勤訓(xùn)練基地醫(yī)學(xué)綜合教研室，重慶 40008；.解放軍第醫(yī)院病理科，吉林 吉林 0；.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所，重慶 40008)

·論著·

Rho激酶和PKC在環(huán)孢素A改善休克血管反應(yīng)性中的作用及與MPTP的關(guān)系

雷艷1，楊新征2，董昭君3(1.第三軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)勤訓(xùn)練基地醫(yī)學(xué)綜合教研室，重慶 400038；2.解放軍第222醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132011；3.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所，重慶 400038)

[摘要]目的觀察Rho激酶和PKC在環(huán)孢素A(CsA)改善創(chuàng)傷失血性休克大鼠血管反應(yīng)性中的作用及與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放的關(guān)系。方法采用創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型和缺氧培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(VMSC)，觀察了Rho激酶和PKC在CsA調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性中的作用，以及對血管平滑肌細(xì)胞線粒體MPTP開放的影響，同時(shí)觀察CsA對休克動(dòng)物炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響。結(jié)果CsA明顯改善了休克血管反應(yīng)性，Rho激酶抑制劑Y27632可顯著拮抗CsA恢復(fù)休克血管反應(yīng)性的作用，但是PKC抑制劑staurosporine對CsA的作用無明顯影響。CsA和Rho激酶激動(dòng)劑U46619都可抑制缺氧后線粒體MPTP的開放程度。休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的濃度均顯著增加，但CsA處理僅使其輕微減少。結(jié)論CsA可以通過抑制線粒體MPTP開放改善休克后血管的低反應(yīng)性，發(fā)揮對創(chuàng)傷休克的治療作用。Rho激酶參與了這其中的調(diào)節(jié)過程。

[關(guān)鍵詞]線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔；環(huán)孢素A；血管反應(yīng)性；創(chuàng)傷失血性休克；Rho激酶

環(huán)孢素A(CsA)是一種臨床常見的強(qiáng)效免疫抑制劑。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)CsA對休克有一定的治療作用，其作用主要通過改善休克后血管反應(yīng)性和器官血流灌注來實(shí)現(xiàn)[1]。但是，CsA調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性的具體機(jī)制尚不清楚。Rho激酶(Rho associated serine/threonine kinase)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是重要的血管平滑肌細(xì)胞舒縮功能調(diào)節(jié)分子，在休克后血管反應(yīng)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究證實(shí)，CsA可以通過抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放，改善心、腦等器官的缺血再灌注損傷[2-3]。那么，CsA調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性是否與Rho激酶或PKC有關(guān)，其作用是通過免疫抑制或是抑制MPTP開放而發(fā)揮，目前尚不明確。本文采用了創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，觀察CsA對休克后炎癥介質(zhì)水平的影響及Rho激酶和PKC在CsA調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性中的作用，并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察其與MPTP開放的關(guān)系，進(jìn)一步探討CsA發(fā)揮抗休克作用的具體機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。U46619 (Rho激酶激動(dòng)劑)、Y27632 (Rho激酶抑制劑)、PMA(PKC激動(dòng)劑)、Staurosporine(PKC抑制劑)購自美國Sigma公司，Calcein-AM、MitoTracker deep red購自美國Invitrogen公司，TNF-α、IL-1β和IL-6檢測試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.2炎癥介質(zhì)水平檢測

32只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為：①正常對照組(sham-operated)；②休克組(shock)；③乳酸林格氏液(LR)組；④CsA組(CsA 5 mg/kg)。采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，將大鼠單側(cè)股骨折斷，經(jīng)股動(dòng)脈插管放血，使血壓維持在40 mmHg，持續(xù)3 h，建立創(chuàng)傷失血性休克模型。休克3 h后，LR組經(jīng)股靜脈輸注2倍失血量的LR，CsA組將5 mg/kg的CsA加入LR中輸注。復(fù)蘇2 h后取2 mL血液，采用檢測試劑盒測定TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.3血管反應(yīng)性測定

SD大鼠64只，隨機(jī)分為8組，每組8只。實(shí)驗(yàn)分組為：①Sham組(正常對照組)；②Shock組(休克處理組)；③LR組(休克+LR)；④CsA組(休克+LR+CsA 5 mg/kg)；⑤CsA+U46619組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+Rho激酶激動(dòng)劑U46619 10-8mol/L)；⑥CsA+Y27632組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+Rho激酶抑制劑Y27632 10-6mol/L)；⑦CsA+PMA組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+PKC激動(dòng)劑PMA 10-7mol/L)；⑧CsA+Staurosporine組(休克+LR+CsA 5 mg/kg+PKC抑制劑Staurosporine 10-7mol/L)。

以相同方法建立休克模型，休克處理3 h后給予CsA 5 mg/kg復(fù)蘇，隨后取大鼠腸系膜上動(dòng)脈，制備血管環(huán)。CsA組在CsA 5 mg/kg復(fù)蘇后，直接取血管環(huán)測定反應(yīng)性；CsA+U46619組、CsA+Y27632組、CsA+PMA組、CsA+Staurosporine組在CsA 5 mg/kg復(fù)蘇后，取血管環(huán)平衡后，分別用U46619、Y27632、PMA和Staurosporine孵育30 min，再觀察血管環(huán)的反應(yīng)性。將血管環(huán)置于K-H液中平衡2 h，待張力曲線平穩(wěn)后，測定血管環(huán)對去甲腎上腺素(NE)的收縮反應(yīng)性。

1.4線粒體MPTP開放情況檢測

取SD大鼠的腸系膜上動(dòng)脈進(jìn)行血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)原代及傳代培養(yǎng)，以缺氧處理的VSMC模擬休克后缺血缺氧狀態(tài)[4]。實(shí)驗(yàn)分為4組：①正常對照組(Normal)；②缺氧組(Hypoxia)；③缺氧+CsA組(缺氧+CsA 1 μmol/L)；④缺氧+Rho激酶激動(dòng)劑組(缺氧+U46619 10-8mol/L)。

將大鼠腸系膜上動(dòng)脈的VSMC接種于共聚焦顯微鏡專用的培養(yǎng)皿中，移入缺氧培養(yǎng)罐內(nèi)，充入缺氧氣體(95%N2和5%的CO2)，達(dá)到完全缺氧后開始計(jì)時(shí)，缺氧處理3 h。缺氧+CsA組在缺氧處理后以1 μmol/L的CsA孵育2 h，Rho激酶激動(dòng)劑組以U46619(10-8mol/L)孵育30 min。采用calcein-CoCl2法，以MitoTracker deep red定位細(xì)胞線粒體，通過激光共聚焦顯微鏡(Calcein 488 nm，MitoTracker 644 nm)檢測線粒體MPTP開放情況。以線粒體中綠色熒光的強(qiáng)度變化反映MPTP的開放程度，熒光強(qiáng)度高反映MPTP開放水平低，熒光強(qiáng)度低反映MPTP開放增加。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1CsA對休克后TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

休克后大鼠血液中TNF-α和IL-1β的濃度均明顯增加，顯著高于正常對照組(P<0.01)，輸注LR可使TNF-α和IL-1β濃度進(jìn)一步增加。給予CsA(5 mg/kg)僅輕微降低了TNF-α和IL-1β濃度，與LR組之間沒有顯著差異。各組的IL-6濃度在休克處理和復(fù)蘇治療前后均未出現(xiàn)明顯變化(圖1)。

*：與Sham組比較，P<0.01

2.2CsA調(diào)節(jié)休克血管反應(yīng)性與Rho激酶及PKC的關(guān)系

休克后大鼠的血管反應(yīng)性顯著降低，CsA(5 mg/kg)可明顯恢復(fù)休克后血管反應(yīng)性，效果明顯優(yōu)于單純LR液復(fù)蘇(P<0.01)。Rho激酶抑制劑Y27632(10-6mol/L)可顯著抑制CsA升高休克血管收縮反應(yīng)的作用，最大收縮張力較CsA組顯著降低(P<0.01)；Rho激酶激動(dòng)劑U46619(10-8mol/L)可使CsA升高休克血管收縮功能的作用進(jìn)一步增加(圖2)。PKC激動(dòng)劑PMA(10-7mol/L)和抑制劑Staurosporine(10-7mol/L)對CsA調(diào)節(jié)休克血管的反應(yīng)性無顯著影響。

2.3CsA和Rho激酶對缺氧VSMC線粒體的影響

缺氧處理后，VSMC的熒光強(qiáng)度較正常對照組明顯減弱(P<0.01)，提示缺氧后線粒體MPTP開放顯著增加。CsA(1 μmol/L)和Rho激酶激動(dòng)劑U46619(10-8mol/L)可抑制缺氧后線粒體MPTP的開放程度，其熒光強(qiáng)度明顯高于缺氧組(P<0.01)，見圖3。

3討論

CsA是一種有效的免疫抑制劑，在臨床上常用于器官移植術(shù)后和許多自身免疫疾病的治療。相關(guān)研究結(jié)果提示，CsA可以通過改善休克后血管反應(yīng)性和器官血流灌注，對創(chuàng)傷失血性休克的治療起到一定的積極作用[5-6]，但是其具體機(jī)制尚不清楚。有研究報(bào)道，創(chuàng)傷失血性休克可以引起炎癥應(yīng)答反應(yīng)，炎癥因子水平升高，導(dǎo)致組織器官損傷。那么，CsA在創(chuàng)傷失血性休克治療中的作用是否也與抑制這種免疫應(yīng)答相關(guān)，目前尚無明確報(bào)道。為此，我們在實(shí)驗(yàn)中觀察了CsA治療前后炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β水平在休克后顯著增高，輸注CsA后僅能使其輕微降低，而IL-6水平在CsA治療前后沒有明顯改變。這一結(jié)果說明，在抗休克治療中，短時(shí)間給予適宜劑量的CsA不會對免疫因子產(chǎn)生明顯的抑制作用。CsA在抗休克治療中的有益作用主要通過調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性而實(shí)現(xiàn)，而并非通過免疫抑制。

血管低反應(yīng)性是影響休克治療效果的重要因素之一[7-8]。血管低反應(yīng)性導(dǎo)致微循環(huán)障礙，組織缺血缺氧狀態(tài)得不到很好地緩解，組織損傷將進(jìn)一步加劇。所以，改善血管低反應(yīng)性是休克復(fù)蘇治療的重要措施之一[9-11]。蛋白激酶C(PKC)和Rho激酶是G蛋白偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物。PKC既可以通過激活細(xì)胞質(zhì)中的靶酶參與生化反應(yīng)的調(diào)控，也能作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達(dá)的調(diào)控[12-13]。PKCα和PKCε可以通過調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，影響肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，對血管的反應(yīng)性和鈣敏感性起到調(diào)節(jié)作用[14]。Rho激酶是Rho蛋白主要的下游效應(yīng)靶分子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的重要激酶之一[15]。Rho激酶激活后可以通過激活下游的肌球蛋白輕鏈激酶，或抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶活性，增加肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平，調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞收縮[16]。通過前期研究[17]我們發(fā)現(xiàn)PKC和Rho激酶在休克后血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)中具有重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了CsA對休克血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用及其與Rho激酶及PKC的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CsA可以明顯恢復(fù)休克后的血管功能，Rho激酶的抑制劑可顯著抑制CsA升高休克血管收縮反應(yīng)的作用，Rho激酶激動(dòng)劑可進(jìn)一步增加CsA升高休克血管收縮反應(yīng)的作用。提示Rho激酶可能參與了CsA調(diào)節(jié)休克后血管功能的過程。

*：與Sham組比較，P<0.01；#：與LR組比較，P<0.01；△：與CsA組比較，P<0.01

圖2各組對去甲腎上腺素的收縮反應(yīng)性變化

*：與Normal組比較，P<0.01；#：與Hypoxia組比較，P<0.01

圖3各組的熒光強(qiáng)度比較

有研究[18-20]發(fā)現(xiàn)，CsA可以通過與Cyp D相結(jié)合，抑制線粒體MPTP的開放，發(fā)揮對MPTP開放所造成的組織細(xì)胞缺血性損害等的保護(hù)和治療作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們以缺氧處理的VSMC模擬休克后血管的缺血缺氧狀態(tài)，探討CsA調(diào)節(jié)休克血管的反應(yīng)性是否與抑制MPTP開放有關(guān)。我們觀察到，缺氧處理使VSMC的MPTP開放顯著增加，CsA和Rho激酶激動(dòng)劑可以抑制缺氧后MPTP的開放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CsA可以通過抑制線粒體MPTP開放來改善休克后血管反應(yīng)性，從而發(fā)揮抗休克作用，Rho激酶可能參與了這一過程的調(diào)節(jié)。

綜上所述，在創(chuàng)傷失血性休克的治療中，CsA可通過抑制線粒體MPTP開放，改善休克后血管的低反應(yīng)性，改善組織血液灌注和器官功能而發(fā)揮有益作用，并非通過免疫抑制途徑。Rho激酶可能參與了這其中的調(diào)節(jié)過程。但是，Rho激酶在這一過程中的具體作用及其與線粒體MPTP開放的關(guān)系如何，還需要更深入的研究來證實(shí)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 雷艷，董兆君.環(huán)孢素A改善創(chuàng)傷失血性休克大鼠血管及器官功能[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34(9)：1171-1174.

[2] Gill RS,Bigam DL,Cheung PY.The role of cyclosporine in the treatment of myocardial reperfusion injury[J].Shock,2012,37(4):341-347.

[3] Leone TA,Finer NN.Shock:a common consequence of neonatal asphyxia[J].J Pediatr,2011,158(2):e9-e12.

[4] Li T,Fang YQ,Yang GM,et al.Effects of the balance in activity of RhoA and Rac1 on the shock-induced biphasic change of vascular reactivity in rats [J].Ann Surg,2011,253(1):185-93.

[5] 楊光明，彭小勇，李濤，等.環(huán)孢素A對嚴(yán)重創(chuàng)傷失血性休克大鼠的治療作用[J].局解手術(shù)學(xué)雜志，2014，23(3)：250-252.

[6] 朱娛，田昆侖，吳躍，等.不同復(fù)蘇壓力對顱腦創(chuàng)傷合并非控制性失血性休克大鼠血流動(dòng)力學(xué)及存活率的影響[J].局解手術(shù)學(xué)雜志，2014，23(4)：372-375.

[7] Jerez S,Scacchi F,Sierra L,et al.Vascular hyporeactivity to angiotensin Ⅱ and noradrenaline in a rabbit model of obesity[J].J Cardiovasc Pharmacol,2012,59(1):49-57.

[8] Tunctan B,Korkmaz B,Sari AN,et al.A novel treatment strategy for sepsis and septic shock based on the interactions between prostanoids,nitric oxide,and 20-hydroxyeicosatetraenoic acid[J].Antiinflamm Antiallergy Agents Med Chem,2012,11(2):121-150.

[9] Steppan J,Nyhan SM,Sikka G,et al.Vasopressin-mediated enhancement of adrenergic vasoconstriction involves both the tyrosine kinase and the protein kinase C pathways[J].Anesth Analg,2012,115(6):1290-1295.

[10] 胡弋，李濤，徐競，等.缺血預(yù)處理對失血性休克大鼠血管反應(yīng)性及鈣敏感性的影響[J].中國病理生理雜志,2011,27(3):437-442.

[11] Mishra N,Nugent WH,Mahavadi S,et al.Mechanisms of enhanced vascular reactivity in preeclampsia[J].Hypertension,2011,11(2):867-873.

[12] Chaplin NL,Amberg GC.Stimulation of arterial smooth muscle L-type calcium channels by hydrogen peroxide requires protein kinase C[J].Channels (Austin),2012,6(5):385-389.

[13] Scruggs SB,Solaro RJ.The significance of regulatory light chain phosphorylation in cardiac physiology[J].Arch Biochem Biophys,2011,510(2):129-134.

[14] Dumont O, Mylroie H,Bauer A,et al.Protein kinase Cε activity induces anti-inflammatory and anti-apoptotic genes via an ERK1/2- and NF-κB-dependent pathway to enhance vascular protection[J].Biochem J,2012,447(2):193-204.

[15] Tsai YR,Huang LJ,Lin HY,et al.Inhibition of formyl peptide-stimulated phospholipase D activation by Fal-002-2 via blockade of the Arf6,RhoA and protein kinase C signaling pathways in rat neutrophils[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2013,386(6):507-519.

[16] Tan HB,Zhong YS,Cheng Y,et al.Rho/ROCK pathway and neural regeneration:a potential therapeutic target for central nervous system and optic nerve damage[J].Int J Ophthalmol,2011,4(6):652-657.

[17] Satoh K,Fukumoto Y,Shimokawa H.Rho-kinase:important new therapeutic target in cardiovascular diseases[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301(2):H287-296.

[18] Liu L,Zhu J,Brink PR,et al.Age-associated differences in the inhibition of mitochondrial permeability transition pore opening by cyclosporine A[J].Acta Anaesthesiol Scand,2011,55(5):622-630.

[19] Muthuraman A,Ramesh M,Chauhan A.Mitochondrial dependent apoptosis:ameliorative effect of flunarizine on ischemia-reperfusion of celiac artery-induced gastric lesions in the rat[J].Dig Dis Sci,2011,56(8):2244-2251.

[20] Shi Y,Rehman H,Ramshesh VK,et al.Sphingosine kinase-2 inhibition improves mitochondrial function and survival after hepatic ischemia-reperfusion[J].J Hepatol, 2012, 56(1):137-145.

(編輯：周小林)

Role of Rho-kinase and PKC in cyclosporine A regulating vascular reactivity and it relationship to MPTP after traumatic hemorrhagic shock

LEI Yan1,YANG Xin-zheng2,DONG Zhao-jun3(1.Department of General Medicine,Medical Service Training Base, Third Military Medical University,Chongqing 400038,China;2.Department of Pathology,the 222th Hospital of PLA,Jilin Jilin 132011,China;3.Institute of Toxicology,College of Military Preventive Medicine,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship of the beneficial effect of CsA on vascular reactivity to Rho-kinase,protein kinase C (PKC) and mitochondrial permeability transition pore (MPTP) in traumatic hemorrhagic shock rats. MethodsWith traumatic hemorrhagic shock rats and hypoxia-treated vascular smooth muscle cells (VSMCs),the role of Rho-kinase and PKC in CsA-regulating vascular reactivity following shock and their relationship to MPTP was observed.Meanwhile,the effects of CsA on inflammatory mediators including TNF-α,IL-1β and IL-6 were also studied. ResultsCsA significantly improved the vascular reactivity of superior mesenteric artery following hemorrhagic shock.Rho-kinase inhibitor Y27632 significantly antagonized CsA-induced increase of vascular reactivity,while PKC inhibitor staurosporine had no significant influences on the effects of CsA.Further studies showed that CsA and Rho-kinase agonist U46619 inhibited the opening of MPTP in hypoxia-treated VSMCs.In addition,shock induced a significant increase of TNF-α and IL-1β,but CsA did not show a significant inhibitory effect on their level. ConclusionCsA-induced restoration of vascular reactivity following traumatic hemorrhagic shock via inhibiting MPTP opening,and Rho-kinase participate in this process.

Keywords：mitochondrial permeability transition pore;cyclosporine A;vascular hyporeactivity;traumatic hemorrhagic shock;Rho associated serine/threonine kinase

[收稿日期]2015-03-10[修回日期] 2015-04-16

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金(81270400)

doi:10.11659/jjssx.03E015007

[中圖分類號]R605.971

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)04-0355-04