食蚊魚(Gambusia affinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用

歐瑞康, 武小燕, 庫培佳, 王蘭, 蘇甜, 梁惜梅, 聶湘平

暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院水生生物研究所 生態(tài)系，廣州510632

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食蚊魚(Gambusia affinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用

歐瑞康, 武小燕, 庫培佳, 王蘭, 蘇甜, 梁惜梅, 聶湘平*

暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院水生生物研究所 生態(tài)系，廣州510632

根據(jù)Ensembl、Genbank登錄的魚類cat、gapdh和gst基因的CDS序列設(shè)計普通PCR擴增引物，尋找食蚊魚的cat、gapdh和gst基因的cDNA片段，并根據(jù)定量引物設(shè)計要求設(shè)計出相應(yīng)的SYBR Green I熒光定量RT-qPCR引物，建立了食蚊魚cat、gapdh和gst基因的SYBR Green I熒光定量RT-qPCR方法。該方法在104～108數(shù)量級范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系(R=0.999～1.000)；熔解曲線顯示擴增產(chǎn)物特異性良好，均為單一峰值；質(zhì)粒標準品最高濃度與最低濃度的批內(nèi)試驗變異系數(shù)與批間試驗變異系數(shù)均低于2%。利用該方法監(jiān)測和評價環(huán)境污染物對水生生物的影響，選擇了水體中常見典型藥物污染物——雙氯芬酸，研究其對食蚊魚抗氧化基因表達的影響。結(jié)果表明，雌性食蚊魚暴露在不同濃度雙氯芬酸鈉(0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1)24 h后，其肝臟cat、gapdh和gst的mRNA呈現(xiàn)顯著變化，相對于對照組，在低濃度0.005 mg·L-1時，cat與gstmRNA的表達量均有極顯著上升(p<0.01)，而其它濃度均極顯著下降(p<0.01)。試驗表明該方法具有快速、精確、靈敏度高的優(yōu)點，可為利用該類小型魚類的原位污染物的生物監(jiān)測和生態(tài)毒理評價提供有力的技術(shù)支持。

食蚊魚； cat; gapdh; gst；實時熒光定量PCR；雙氯芬酸

常規(guī)的色譜、分光光度法等化學(xué)分析方法是檢測水體中污染物的最主要的手段之一，這些方法能夠檢測出水體污染物的類別和含量，但卻無法準確反映污染物對生物機體產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。生物機體曝露于環(huán)境污染物時，機體會產(chǎn)生一些生理、行為、生化等的變化，通過檢測這些變化可觀測和衡量環(huán)境污染物對生物的影響。因此利用生物監(jiān)測技術(shù)可以彌補常規(guī)化學(xué)分析技術(shù)手段的不足，也是環(huán)境污染監(jiān)測的常用技術(shù)手段之一。近年來，國內(nèi)許多研究者認識到利用活體動物開展毒性測試對保護環(huán)境、改善水處理工藝的重要性，相關(guān)的研究工作也逐年增加，而生物毒性測試方法包括魚類、溞類、發(fā)光菌等的急性或慢性毒性測試[1]。目前魚類已經(jīng)作為環(huán)境污染的指示生物之一用來評估水體系統(tǒng)的質(zhì)量[2]。而在眾多檢測方法當(dāng)中，分子技術(shù)檢測方法可以在生物體暴露于環(huán)境污染物的早期及時檢測污染物的毒性效應(yīng)。

環(huán)境污染物進入生物體內(nèi)后，通常會在P450酶系的參與下，進行氧化、還原、水解等代謝過程，使得外來污染物極性增加，導(dǎo)致污染物的毒性減弱。而在污染物分子被修飾的過程中往往會因此產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物和自由基。正常情況下，產(chǎn)生的自由基或活性中間產(chǎn)物會在抗氧化酶及Ⅱ相代謝相關(guān)酶的作用下被清除。檢測這些酶的響應(yīng)變化，可有效地反映各種外來物質(zhì)對生物產(chǎn)生的毒性影響[3]。本文涉及到的過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)正是生物體內(nèi)最常見的抗氧化酶和Ⅱ相代謝酶。其中CAT是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，GST其主要功能是催化某些內(nèi)源性或外來有害物質(zhì)的親電子基團與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加其疏水性使其易于穿越細胞膜，并在被分解后排出體外，從而達到解毒的目的。甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH)是生物體內(nèi)能量代謝中一個關(guān)鍵的限速酶，也是大多數(shù)生物體內(nèi)在一般情況下穩(wěn)定表達的管家基因，常被用作熒光定量PCR的內(nèi)參基因。

生態(tài)毒理學(xué)中常用作實驗的模式魚類有斑馬魚、青鱂、虹鱒和劍尾魚等，但這些魚類對生存環(huán)境有一定的要求，在我國自然水體中不易采集，難以反映自然環(huán)境中各類污染物真實暴露影響。而食蚊魚在我國多數(shù)淡水環(huán)境中能夠采集到，具有一定的代表性。早期為了控制瘧疾而大量人工投放食蚊魚到各種淡水水體中，由于其較強的繁殖能力和較強的適應(yīng)能力，已經(jīng)成為我國南方淡水河流常見優(yōu)勢的外來入侵種[4]，在池塘、水溝、低洼地等小水體中普遍分布，食蚊魚對溫度和鹽度的變化有較強的適應(yīng)能力，容易捕撈和實驗室馴養(yǎng)，目前已作為一種指示生物用于生態(tài)毒理試驗[5]。根據(jù)文獻檢索，有關(guān)食蚊魚的cat，gapdh和gst三種基因用于熒光定量PCR檢測尚未見報道。

大量研究顯示，越來越多被排放到環(huán)境中(特別是在水環(huán)境中)的微量殘留藥物已成為一類新的環(huán)境污染物。目前在水環(huán)境中至少可以檢出六十多種藥物，如鎮(zhèn)痛藥、抗生素、抗癲癇劑等。雙氯芬酸鈉是一種衍生于苯乙酸類的非甾體消炎藥(NSAID)，其療效好，副作用少，被廣泛用于消炎鎮(zhèn)痛治療。由于在水環(huán)境中的殘留藥物含量很低(通常在μg·L-1甚至ng·L-1水平)，對這類污染物有效監(jiān)測需要依賴于靈敏度高的檢測方法，如質(zhì)譜儀等[6]。但利用生物檢測仍不失為一種靈敏有效的補充手段之一。

本研究通過克隆食蚊魚cat、gapdh和gst基因的cDNA中間序列，依據(jù)序列設(shè)計特異性引物，建立cat、gapdh和gst基因mRNA水平的實時熒光定量PCR檢測方法；并檢測不同濃度雙氯芬酸鈉對食蚊魚mRNA表達量的影響，從而為利用食蚊魚作為一種快速、敏感的污染物監(jiān)測指示生物提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑及儀器

Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，上海)；PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa Taq、DL500和DL1000 DNA Marker、pMD 18-T質(zhì)粒載體、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)、SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)均為大連TaKaRa寶生物公司；膠回收試劑盒(OMEGA公司，美國)；DH5α質(zhì)粒(康為世紀生物科技有限公司，北京)；質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)；雙氯芬酸鈉(純度98.0%，日本東京化成TCI工業(yè)株式會社)；tBHQ(純度>98.0%，日本東京化成TCI工業(yè)株式會社)。

CFX Connect熒光定量PCR儀(BIORAD公司，美國)；Ingenius L凝膠成像儀(SYNGENE公司，英國)；ABI Veriti 96孔梯度PCR儀(Applied Biosystems公司，美國)；恒溫水浴鍋(XMT4302-C，上海)；恒溫搖床(ZHWY-200D，上海)；超凈工作臺(HD-650，蘇州)；移液槍(Eppendorf公司，德國)；Nanodrop 2000(Thermo公司，美國)。

1.2 食蚊魚cat、gapdh和gst基因mRNA中間序列引物設(shè)計

cat基因mRNA參考ENSEMBL、GenBank登陸的新月魚、青鳉、花斑溪鳉，登錄號分別為ENSXMAT00000019230、KC138555.1、EU116026.1保守區(qū)域CDS 序列，gapdh基因mRNA則參考ENSEMBL、GenBank登陸的新月魚、花斑溪鳉、條石鯛，登錄號分別為ENSXMAT00000011486、FJ438822.1、EU828449.1保守區(qū)域CDS序列，gst基因mRNA則參考ENSEMBL、GenBank登陸的新月魚、劍尾魚、條石鯛、鱖魚，登錄號分別為ENSXMAT00000006938、JN256943.1、GU938678.1、EU719618.1保守區(qū)域CDS序列，設(shè)計出如表1所示引物，引物交由北京中美泰和生物技術(shù)有限公司合成。引物用高壓蒸汽滅菌的超純水溶解至10 μmol·L-1，-20 ℃保存。

1.3 實驗動物暴露及組織樣品采集

實驗用食蚊魚來自廣州珠江水產(chǎn)研究所；誘導(dǎo)劑tBHQ (叔丁基對苯二酚，是一種油溶性抗氧化劑，廣泛應(yīng)用在食物添加劑中，常用作機體抗氧化反應(yīng)試驗的模式誘導(dǎo)物)用曝氣過的自來水配制成0.2 mg·L-1的暴露液。實驗在盛有7 L暴露液的10 L玻璃缸中進行，對食蚊魚(雌性個體)暴露12 h，解剖采集肝臟，立即提取RNA。

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

食蚊魚的肝臟RNA提取方法按Invitrogen公司TRIZOL Reagent說明書進行，剩余樣品-70 ℃保存。然后cDNA反轉(zhuǎn)錄按TaKaRa PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。

1.5 cat、gapdh和gst目的基因中間序列片段的擴增、克隆與鑒定

1.5.1 目的基因中間片段PCR擴增

將反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，進行普通PCR擴增。反應(yīng)體系為雙蒸水17.25μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，cDNA模板0.75 μL，上下游引物各1 μL，rTaq酶0.5 μL，反應(yīng)總體系為25 μL。PCR擴增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，進行32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃結(jié)束反應(yīng)并保存。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并用紫外凝膠成像儀檢測電泳結(jié)果。將有條帶的凝膠切下并用膠回收試劑盒回收。

1.5.2 目的基因中間片段的連接、轉(zhuǎn)化

將回收得到的產(chǎn)物與pMD 18-T質(zhì)粒載體連接，加入4 μL膠回收產(chǎn)物，1 μL pMD 18-T質(zhì)粒載體，5 μL Solutiong I，用移液槍輕輕吹打混勻，放冰箱4 ℃過夜連接。將10 μL連接過夜的質(zhì)粒加入到100 μL感受態(tài)中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)化方法按TaKaRaE. coli Competent Cells DH5α質(zhì)粒轉(zhuǎn)化說明書進行，加入預(yù)溫的液體LB培養(yǎng)基500 μL，37 ℃ 200 rpm恒溫搖床震蕩培養(yǎng)45 min。將管內(nèi)菌液混勻，吸取100 μL涂布于含有100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，放置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)20 min，待平板干燥后倒置平板，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。

表1 用于尋找食蚊魚cat、gapdh和gst cDNA中間片段引物序列

1.5.3 陽性克隆的PCR鑒定與測序

挑取平板上單一菌落，接種到100 μg·mL-1氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 rpm恒溫搖床震蕩培養(yǎng)7～12 h。從菌液中吸取2 μL作為模板進行PCR擴增，凝膠成像有條帶的樣品送去華大基因公司測序。

1.6 食蚊魚cat、gapdh和gst基因?qū)崟r熒光定量RT-qPCR方法的建立

1.6.1 實時熒光定量PCR引物設(shè)計與合成

根據(jù)上面得到的食蚊魚cat、gapdh和gst基因cDNA序列，參照熒光定量PCR引物設(shè)計要求設(shè)計出如表2所示的下熒光定量引物：

表2 用于檢測食蚊魚cat、gapdh和gst相對表達量的引物序列

引物交由北京中美泰和生物技術(shù)有限公司合成。引物用高壓蒸汽滅菌的超純水溶解至10 μmol·L-1，-20 ℃保存。

1.6.2 cDNA的合成

cDNA合成方法按1.4進行。

1.6.3 cat、gapdh和gst 基因cDNA目的片段的擴增、克隆及鑒定

1.6.3.1 目的片段的PCR擴增

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別以ctf與ctr、ghf與ghr、gtf與gtr為引物進行普通PCR擴增。反應(yīng)總體系與1.5.1一樣，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性10s，60 ℃退火40 s，72 ℃ 1 min，進行32個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)進行檢測并拍照。按OMEGA膠回收試劑盒按說明書回收PCR擴增產(chǎn)物。

1.6.3.2 轉(zhuǎn)化、克隆與鑒定、測序

目的片段的轉(zhuǎn)化、克隆與鑒定、測序方法與1.5.2和1.5.3相同。

1.6.4 質(zhì)粒標準品的制備

含目的片段重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)擴大培養(yǎng)及菌液測序鑒定后，按天根質(zhì)粒提取試劑盒說明書進行質(zhì)粒提取，用Thermo Nanodrop 2000核酸蛋白質(zhì)分光光度計檢測濃度，檢測出cat、gapdh和gst質(zhì)粒標準品的濃度分別為：73.5 ng·μL-1、81 ng·μL-1和63 ng·μL-1，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)分別為：2.43×1010、2.63×1010和2.07×1010。將重組質(zhì)粒標準品原液進行連續(xù)10遞增稀釋，制備的5個濃度重組質(zhì)粒標準品，分別為(2.43、2.63、2.07×)108、107、106、105、104拷貝數(shù)·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.5 標準曲線的建立

以重組質(zhì)粒為模板,并分別以與重組質(zhì)粒對應(yīng)的引物作為擴增引物，進行 SYBR Green I實時熒光定量PCR，反應(yīng)總體積為25 μL：SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 12.5 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1 μL，質(zhì)粒標準品2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。在60 ℃延伸時采集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，進行熔解曲線的測定,反應(yīng)條件為:95 ℃ 10 s，接著溫度以0.5 ℃/5 s的速率從60 ℃遞增到95 ℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度以得到熔解曲線。每個樣品做3個重復(fù)。

1.6.6 重復(fù)性試驗

在cat、gapdh和gst質(zhì)粒標準品中取最高與最低濃度進行熒光定量PCR反應(yīng)，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，計算Ct值的變異系數(shù)，檢驗批內(nèi)重復(fù)性；同時對上述樣品做3次測定(間隔1天)，計算Ct值的變異系數(shù)，檢驗批間重復(fù)性。

1.6.7 雙氯芬酸鈉暴露實驗

設(shè)置雙氯芬酸鈉暴露液濃度組：0.005、0.05、0.5和5 mg·L-1，每個濃度設(shè)3個平行，并加設(shè)一個自來水空白對照組，試驗在10 L的水族箱中進行，內(nèi)盛7 L暴露液，每個水族箱放3條雌性食蚊魚，實驗期間不充氧，不投喂餌料，實驗開始后，在24 h時從每個濃度三個平行的水族箱中分別取雌魚一條，解剖取肝臟進行總RNA的提取，并且反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

本次實驗使用是相對定量方法中的2-ΔΔCt法，利用公式F=2-[(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)](其中Ct1為處理樣品目的基因的臨界循環(huán)數(shù)，Ct2為處理樣品內(nèi)參基因的臨界循環(huán)數(shù)，Ct3為對照樣品目的基因的臨界循環(huán)數(shù)， Ct4為對照樣品內(nèi)參基因的臨界循環(huán)數(shù)，F(xiàn)為處理樣品目的基因經(jīng)過校正后的相對表達量)計算定量結(jié)果，內(nèi)參為gapdh，mRNA的相對表達水平使用單因素方差分析法來檢驗，統(tǒng)計檢驗使用SPSS 22。

2 結(jié)果(Results)

2.1 食蚊魚cat、gapdh和gst cDNA中間序列及同源性分析

圖1 cat, gapdh和gst中間序列片段電泳結(jié)果M: DL1000 Marker; 1,2: cat; 3,4: gapdh; 5,6: gstFig. 1 Performance of electrophoresis of cat, gapdh andgst intermediate fragments

圖2 食蚊魚cat, gapdh和gst cDNA中間片段a: cat; b: gapdh; c: gstFig. 2 cDNA sequences of cat, gapdh and gst from the Gambusia affinis

用1.2所述的引物進行普通PCR擴增，凝膠電泳結(jié)果如圖1顯示，在500～1 000 bp處都有條帶，且與預(yù)期的片段大小基本相符。

通過對食蚊魚cat、gapdh和gst基因cDNA中間片段克隆結(jié)果進行測序，結(jié)果如圖2所示，顯示克隆得到的cDNA中間片段的大小分別為962 bp、608 bp和836 bp，得到的序列長度和預(yù)期的基本吻合。將整理好的食蚊魚核酸測序結(jié)果通過BLAST進行比對，找到其它物種相應(yīng)的CDS序列，結(jié)果如表3所示，食蚊魚cat、gapdh和gst的核酸與氨基酸序列均與花斑劍尾魚的核酸與氨基酸序列同源性最高，cat、gapdh和gst核酸同源性分別為98%、98%和96%，氨基酸同源性分別為98%、99%、94%。利用clustal X和MEGA 5.0進行序列分析和與其它魚類進行比對，結(jié)果如圖3所示，分析結(jié)果與BLAST結(jié)果基本一致，食蚊魚的CAT、GAPDH和GST的氨基酸序列與花斑劍尾魚相對應(yīng)的氨基酸序列處于同一進化樹分支，初步確定該序列為目的基因中間片段序列。

表3 食蚊魚與其它物種cat、gapdh和gst的核酸序列與氨基酸序列的同源性比較

圖3 用鄰接法構(gòu)建的食蚊魚CAT, GAPDH和GST氨基酸序列系統(tǒng)樹a: CAT; b: GAPDH; c: GSTFig. 3 Phylogenic tree of Gambusia affinis based on CAT, GAPDH and GST amino acidsequences by neighbor-joining method

2.2 質(zhì)粒標準品的制備、標準曲線的建立和線性檢測范圍

將食蚊魚肝臟總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，加入熒光定量PCR引物再進行普通PCR擴增，得到cat、gst和gapdh的目的條帶長度分別為72 bp、78 bp和136 bp，電泳圖如圖4。目的條帶進行凝膠回收后，進行目的片段克隆、鑒定和測序。測序結(jié)果經(jīng)序列比對，證明擴增的片段是目的片段。說明成功構(gòu)建目的片段重組質(zhì)粒，可以作為SYBR Green I實時熒光定量PCR的陽性質(zhì)粒標準品。

不同濃度食蚊魚cat、gapdh和gst基因質(zhì)粒標準品的SYBR Green I實時熒光定量PCR擴增曲線和標準曲線(見圖5a與b)。由圖顯示，食蚊魚cat、gapdh和gst基因?qū)崟r熒光定量PCR標準曲線的線性范圍均達到5個數(shù)量級，重組質(zhì)粒濃度分別在(2.43、2.63、2.07×)108、107、106、105、104拷貝數(shù)·μL-1之間，其對數(shù)與相應(yīng)的Ct值均有良好相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(R2)分別為：0.999、1.000、0.999。由Bio-Rad CFX Manager 3.0軟件計算出標準曲線的擴增效率分別為：99.7%、94.3%、90.2%。三個基因的熔解曲線(見圖5c)均為單一峰，峰值熔解溫度分別為79.5 ℃、89.0 ℃、82.0 ℃,說明擴增產(chǎn)物無引物二聚體及非特異性擴增，引物設(shè)計合理性好和特異性高。

圖4 熒光定量引物PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果M: DL500 Marker; 1,2: gst; 3,4: gapdh; 5,6: catFig. 4 Performance of electrophoresis of the RT-qPCR primers amplification products

圖5 SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCRa: 擴增曲線(RFU:熒光值; Cycle:循環(huán)數(shù)); b: 標準曲線(Cq: Ct值; Log starting quantity: 起始模板的對數(shù)值); c: 溶解曲線Fig. 5 SYBR Green I RT-qPCR a: Amplification curve; b: Standard curve; c: Melt curve

2.3 可重復(fù)性評價結(jié)果

分別將食蚊魚cat、gapdh和gst基因質(zhì)粒標準品的最低與最高濃度進行批內(nèi)檢測和批間檢測，計算出批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

由表中可見，cat、gapdh和gst標準陽性質(zhì)粒批內(nèi)試驗CV分別為：0.35%與1.36%、0.54%與1.24%、0.90%與0.65%，組間試驗CV為0.37%與0.13%、0.52%與0.21%、0.49%與1.32%，批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于2%表明該方法具有良好的可重復(fù)性。

2.4 雙氯芬酸鈉暴露對食蚊魚cat和gst mRNA表達的影響

雌性食蚊魚暴露于雙氯芬酸鈉24 h之后，cat、gst mRNA表達量變化如圖6a和b所示，在最低濃度0.005 mg·L-1時表達量極顯著上升(p<0.01)，但是隨著雙氯芬酸鈉濃度的增加，表達量呈現(xiàn)總體下降趨勢，與對照組相比存在極顯著差異(p<0.01)。

3 討論(Discussion)

實時熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一種定量核酸分子的新技術(shù)。與普通PCR相比，實時熒光定量PCR最主要的優(yōu)點是可以對DNA及mRNA表達水平進行準確的定量分析[7]。實時熒光定量現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)、微生物學(xué)和診斷學(xué)上的定量分析，并成為mRNA定量的一種常規(guī)方法之一[8]。實時熒光定量PCR主要分為絕對定量和相對定量，前者主要應(yīng)用于檢測給定數(shù)量的樣品中核酸的量。相對定量的分析結(jié)果是試驗組和對照組中的一個靶基因的相對比率。相對定量主要用于mRNA的表達量分析，通過同時測定實驗組和對照組的目的基因和內(nèi)參基因表達量，用內(nèi)參基因歸一化來獲得目的基因相對于參照基因的表達指數(shù)，試驗組與對照組目的基因表達指數(shù)的比值就是目的基因的相對表達量，反映試驗組目的基因表達的變化[9]。

越來越多研究表明，不同的外源化學(xué)物質(zhì)進入生物體內(nèi)后可引起氧化應(yīng)激、基因毒性應(yīng)激和蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激等反應(yīng)，從而激活生物細胞內(nèi)解毒代謝系統(tǒng)，以維持生物體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定[10]。而檢測參與這些反應(yīng)的各種解毒代謝酶類的響應(yīng)變化可部分反映外源污染物對生物的影響。其中抗氧化酶是其中最常用的一類生物標記物。CAT和GST是抗氧化應(yīng)激和Ⅱ相代謝密切相關(guān)的兩種常見的酶。以往研究大多集中在檢測其酶活性來反映外源物質(zhì)對機體的損傷程度，但這種方法實驗結(jié)果數(shù)據(jù)有較大的差異，可重復(fù)性低，靈敏度低，效果不是很理想。而利用分子技術(shù)手段在基因水平上檢測這些解毒酶的響應(yīng)，靈敏度較高，也可獲得較好的重復(fù)性。

表4 標準品批內(nèi)批間重復(fù)性(n=3; x±SD)

圖6 不同濃度雙氯芬酸鈉對食蚊魚cat, gst mRNA表達的影響(a:cat相對表達水平; b:gst相對表達水平)Fig. 6 Effects of different concentrations of diclofenac sodium salt on the expression of cat andgst mRNA in female Gambusia affinis(a: cat relative expression level; b: gst relative expression level)

雙氯芬酸鈉能引起脊椎動物肝損傷，但其發(fā)病機制尚不清楚。有研究表明，氧化應(yīng)激、線粒體功能損傷、能量代謝障礙和細胞凋亡可能與雙氯芬酸鈉引起肝損傷有關(guān)。其中氧自由基的產(chǎn)生是雙氯芬酸鈉引起肝細胞功能損傷的主要原因，SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-Px(谷胱甘肽過氧化物酶)是機體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)，通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整，雙氯芬酸鈉能使GSH含量和SOD、GSH-Px活性水平明顯降低，表明雙氯芬酸鈉能導(dǎo)致肝損傷與氧化損傷機制有關(guān)[11]。而CAT和GST也是機體抗氧化系統(tǒng)中的重要的組成部分，且與SOD和GSH關(guān)系密切，本實驗結(jié)果顯示雙氯芬酸鈉在低濃度時(0.005 mg·L-1)對cat和gst的mRNA表達量有上調(diào)作用(p<0.01)，但隨著濃度的增加，兩種基因的表達量有下降趨勢。表明食蚊魚肝臟受到一定的損傷。GST具有消除體內(nèi)自由基和解毒雙重功能，是一種重要的解毒酶，能催化GSH與許多次級底物結(jié)合，包括脂質(zhì)過氧化的次級產(chǎn)物，從而解除外源性污染物的毒性[12]。gst mRNA表達量的升高與雙氯芬酸鈉導(dǎo)致的氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)，但隨著濃度的升高，氧自由基的含量逐漸增加，抑制了GST酶的活性，這種GST活性水平在低濃度污染物暴露呈現(xiàn)上升而高濃度暴露則下降的變化趨勢在水生生物對污染物的暴露中有報道[13]。而CAT同樣作為抗氧化酶，其變化與GST類似，表明cat和gst mRNA表達量均與雙氯芬酸鈉的濃度相關(guān)[14]。因此，cat和gst的mRNA響應(yīng)變化可以作為指標參數(shù)用于雙氯芬酸鈉的毒性監(jiān)測和評價。

致謝：感謝暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院聶湘平教授的幫助和支持。

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Cloning ofcat,gapdhandgstGenes ofGambusiaaffinisand Its Application in Ecotoxicology

Ou Ruikang, Wu Xiaoyan, Ku Peijia, Wang Lan, Su Tian, Liang Ximei, Nie Xiangping*

Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Department of Ecology, College of Life and Technique Science, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Received 13 April 2014 accepted 26 September 2014

According to the coding sequences of cat, gapdh and gst genes in fish species published in Ensembl and GenBank, three pairs of primers were designed to find the cDNA sequences of cat, gapdh and gst in mosquitofish (Gambusia affinis).The primers for SYBR Green I real-time quantitative PCR was employed based upon the design requirements of quantitative primer. A new method of SYBR Green I real-time quantitative PCR for determination of cat, gapdh and gst genes in G. affinis was successfully established. The results showed that a good linear relationship existed in the range from 104to 108copies·μL-1(R=0.999～1.000) and the melt curve exhibited good specificity of amplification products. The co-efficiencies of variation for both intra- and inter-experimental reproducibility were less than 2%. Furthermore, in order to validate and assess the utilization and feasibility of the new method in ecotoxicology, diclofenac, a typical pharmaceutical detected frequently in water, was employed to investigate its effects on the expression of antioxidant genes of G. affinis. Results showed that the cat and gst mRNA expressions were very significantly induced (P<0.01) in 0.005 mg·L-1when female individuals were exposed to diclofenac sodium salt (0.005～5 mg·L-1) for 24 h, but decreased very significantly (P<0.01) with the increasing concentrations. It indicates that this new method is feasible, accurate and highly sensitive, and may provide a methodological basis for the utilization of mosquitofish as a sentinel in molecular eco-toxicological assessment of environmental pollution.

Gambusia affinis; cat; gapdh; gst; real-time quantitative PCR; diclofenac

國家科技支撐計劃課題(2012BAC07B05, 20612033)； 暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金(21611609)

歐瑞康(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：環(huán)境生物學(xué)，E-mail: ouruikang@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: txpnie@jnu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140413003歐瑞康, 武小燕, 庫培佳, 等. 食蚊魚(Gambusia affinis)cat、gapdh和gst基因的克隆及其在生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報， 2015, 10(3): 83-92

2014-04-13 錄用日期：2014-09-26

1673-5897(2015)3-083-10

X171.5

A

聶湘平(1966-)，男，博士，教授，主要從事水環(huán)境生態(tài)毒理學(xué)研究。

Ou R K, Wu X Y, Ku P J, et al. Cloning of cat, gapdh and gst genes of Gambusia affinis and its application in ecotoxicology [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 83-92 (in Chinese)