長牡蠣(Crassostrea gigas)貝殼與外套膜中黑色素的提取和鑒定*

于文超 何 成 武長路 王 嬌 李 壯 郭 婷 李永川 王曉通

(魯東大學農(nóng)學院 煙臺 264025)

黑色素(melanin)是一種生物多聚體,是生物色素中分布范圍最廣的色素之一(Kollosaet al,1991),一般呈黑色或棕褐色,廣泛存在于動植物中,是一種難溶于水、酸及有機溶劑的生物大分子(Bassamet al,2002)。隨著對天然黑色素的深入研究,人們發(fā)現(xiàn),黑色素有廣泛的生物活性,包括延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫力、保護光照損傷、抗氧化,清除自由基、保護心血管功能等,在食品加工、化妝品開發(fā)、疾病預防治療等方面都具有廣闊的應用前景,天然黑色素資源開發(fā)是當前研究的一大熱點。目前人們對細菌(Aghajanyanet al,2005; Yuanet al,2007)、海綿(Araujoet al,2012)、烏雞(Gallus gallus)肉(Chenet al,2008; Tuet al,2009)、鳥類羽毛中(Swan,1974)的黑色素都有一定程度的研究與開發(fā)。酪氨酸酶是一種75kDa含銅酶,廣泛存在于微生物、動植物及人體中,是黑色素合成的關鍵酶(Chang,2009),作者曾發(fā)現(xiàn)牡蠣基因組中的酪氨酸酶基因在外套膜的表達量遠遠高于其它器官,說明外套膜在黑色素形成的過程中發(fā)揮著重要作用(Zhanget al,2012),而根據(jù)作者觀察,發(fā)現(xiàn)牡蠣外套膜邊緣著色而皮質(zhì)部不著色,色素在軟體部的沉積主要集中在外套膜邊緣。

目前,國際上對貝類黑色素的研究尚未見報道,但對貝類其它色素的研究已有一定成果,如閉殼肌中高胡蘿卜素含量的扇貝新品種的培育(Liet al,2010; Zhenget al,2010)已有報道,黑色素具有與胡蘿卜素類似的抗氧化、抗衰老作用(Luet al,2014;Vrolijket al,2015),黑色素含量高的牡蠣新品種也是好的研究方向。牡蠣黑色素雖然沒有見到正式報道,但對牡蠣殼色的研究已經(jīng)有了一些進展。有學者發(fā)現(xiàn)長牡蠣左殼黑殼組、左殼白殼組和對照組在不同生長階段存活率的差異均不顯著,并推測左殼的白色對黑色具有顯性效應(王慶志,2011)。近來,韓國學者Kang等(2013)研究了長牡蠣貝殼顏色與外套膜顏色之間的關系,發(fā)現(xiàn)在F0代、F1代、F2代,貝殼顏色與外套膜邊緣顏色之間的相關系數(shù)分別為0.25、0.74、0.92,他們認為長牡蠣的貝殼和外套膜邊緣顏色是可以遺傳的,并且長牡蠣貝殼著色與外套膜邊緣著色可能是同一個生理學過程(Kanget al,2013)。殼色育種可以在提高貝類保健功能的同時兼顧美觀,從而增加經(jīng)濟貝類的附加值,產(chǎn)業(yè)需求迫切。黑殼牡蠣是本課題組經(jīng)過多年選育而得到的左右殼和左右外套膜顏色均是黑色的長牡蠣新品系,但在牡蠣研究領域,還沒有實驗來證明黑殼牡蠣貝殼和外套膜中的黑色物質(zhì)就是黑色素。本實驗計劃提取黑殼牡蠣貝殼和外套膜中的黑色物質(zhì)并進行鑒定,希望可以確定黑色素的存在與否,從而為黑殼牡蠣是否具有保健價值提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

本實驗所用長牡蠣,來源于本課題組自行選育的黑殼牡蠣群體,養(yǎng)殖于蓬萊宗哲養(yǎng)殖有限公司,殼高為10cm左右,總數(shù)60只。

1.2 實驗儀器與試劑

紫外分光光度計、電子密度天平、電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫鼓風干燥箱、索氏提取器、研缽、燒杯、三角燒瓶、玻璃棒等。所用實驗試劑包括鹽酸、氫氧化鈉、乙醚、蒸餾水等。

1.3 長牡蠣貝殼中黑色素的提取

1.3.1 原料的處理 用牡蠣刀將鮮活的牡蠣撬開,將牡蠣肉剝離下來作為其它實驗備用。將牡蠣殼上的雜質(zhì)以及牡蠣肉清理干凈,貝類清洗干凈后烘干,以方便研磨和提取。

1.3.2 粉碎 先用錘子將牡蠣殼敲成為碎片,再用研缽研磨成精細的粉狀,減小與鹽酸混合時的損失和方便提取。

1.3.3 溶解 稱量牡蠣殼粉末50 g置于1000 mL的三角燒瓶中,將200 mL的鹽酸(6 mol/L)緩慢倒入燒瓶中,邊倒邊用玻璃棒攪拌,以防鹽酸與碳酸鈣發(fā)生反應后溶液溢出,減小損失。

1.3.4 水浴 將浸泡過殼粉200 mL鹽酸溶液棄去,將殘渣放入500 mL圓底燒瓶中再加6 mol/L鹽酸溶液400 mL,裝上冷凝管于100°C的水浴中加熱1 h。水浴的作用是使反應受熱均勻,防止溶液沸騰。鹽酸屬于易揮發(fā)的液體,因此使用冷凝管可以避免反應物損耗和充分利用原料。

1.3.5 抽濾 加熱完畢后,待冷卻后,將圓底燒瓶內(nèi)的牡蠣殼用布氏漏斗抽濾,棄去濾液,保留濾渣,得到黑色素的粗制品。

1.3.6 脫脂 將濾渣用濾紙包好,置于索氏脂肪提取器中,用乙醚在 42°C 左右的水浴中脫脂,待索氏管中乙醚呈現(xiàn)出澄清狀態(tài)后,脫脂結束,再將濾紙包取出,在抽濾裝置上用蒸餾水反復洗滌多次。

1.3.7 干燥 最后在 80°C恒溫干燥箱中烘干,取出黑色固體物質(zhì)。

1.4 牡蠣外套膜中黑色素的提取

1.4.1 組織勻漿的制備 用牡蠣刀將牡蠣撬開,用剪刀剪取外套膜邊緣顏色較深的部分,然后放在碾缽中搗碎。

1.4.2 水解 稱量處理好的牡蠣外套膜大約 10 g置于三角燒瓶中,用6 mol/L鹽酸溶液200 mL浸泡12 h。

1.4.3 水浴 將浸泡過牡蠣外套膜的200 mL鹽酸溶液棄去,將殘渣放入 500 mL圓底燒瓶中再加 6 mol/L鹽酸溶液400 mL,裝上冷凝管于100°C的水浴中加熱1h。

1.4.4 抽濾 加熱完畢后,將圓底燒瓶內(nèi)的牡蠣外套膜用布氏漏斗抽濾,棄去濾液,保留濾渣。

1.4.5 去脂 將濾渣用濾紙包好,置于索氏脂肪提取器中,用乙醚在 42°C 左右的水浴中脫脂,待索氏管中乙醚呈現(xiàn)出澄清狀態(tài)后,脫脂結束,再將濾紙包取出,在抽濾裝置上用蒸餾水反復洗滌多次。

1.4.6 干燥 最后在 80°C恒溫干燥箱中烘干,取出黑色固體物質(zhì)。

1.5 長牡蠣黑色素的鑒定

將貝殼和外套膜中提取的 6份黑色固體物質(zhì)各取0.1 g,溶解在1 mL的0.01 mL/L氫氧化鈉水溶液中,并用同樣的氫氧化鈉水溶液作為對照,在 150—500 nm 的范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描,吸收曲線使用Origin軟件制作。

2 結果

2.1 長牡蠣貝殼中和外套膜中黑色物質(zhì)的外部形態(tài)

從貝殼和外套膜中提取的黑色固體物質(zhì)均為褐黑色,呈粉末狀,偶有顆粒狀,外部形態(tài)十分相似,但可以看出從外套膜中提取到的黑色固體物質(zhì)的顏色要比從貝殼中提取到的深一些(圖1)。

2.2 長牡蠣貝殼中黑色物質(zhì)的紫外光譜特征

如圖2中所示,s1、s2、s3分別表示3份貝殼中提取的黑色物質(zhì)樣品,經(jīng)過150—500 nm的紫外光譜掃描,這3份樣品最大的吸收峰分別在212 nm、211 nm、211 nm 處(吸光值分別為 0.625,0.774,0.839),與報道的不同來源的黑色素的最大吸收波長在 210 nm左右一致(付湘晉,2005),從最大吸收波長開始,隨著波長逐漸增加,吸光度呈逐漸下降的趨勢,是典型的黑色素紫外吸收圖譜(Selvakumaret al,2008)。

圖1 從牡蠣貝殼和外套膜中提取的黑色素Fig.1 The melanin samples extracted from the shell and mantle of Pacific oyster左邊是從貝殼中提取的黑色素,右邊是從外套膜中提取的黑色素

2.3 牡蠣外套膜中黑色物質(zhì)的紫外光譜特征

如圖3中所示,m1、m2、m3分別表示3份外套膜中提取的黑色物質(zhì)樣品,經(jīng)過150—500 nm的紫外光譜掃描,這3份樣品最大的吸收峰均在210 nm處(吸光值分別為1.586、0.74、1.867),與報道的不同來源的黑色素最大吸收波長在210 nm左右一致(付湘晉,2005),從最大吸收波長開始,隨著波長逐漸增加,吸光度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,是典型的黑色素紫外吸收圖譜(Selvakumaret al,2008)。

圖2 牡蠣貝殼中黑色素的紫外掃描圖Fig.2 UV absorption spectra: black pigment in the shell of oystersAbs表示紫外吸收值,Wav表示波長,s1、s2、s3分別表示3份貝殼中提取的黑色物質(zhì)樣品

2.4 牡蠣貝殼中和外套膜中黑色物質(zhì)的紫外光譜特征

從圖4可以看出,貝殼中(s1,s2,s3)與外套膜中(m1,m2,m3)黑色物質(zhì)的紫外吸收光譜非常相似,最大紫外吸收波長都位于210 nm左右,最大吸收波長之前和之后的紫外吸收值的變化趨勢也基本一致,均具有黑色素紫外吸收光譜的特征。值得注意的是,貝殼中黑色物質(zhì)的紫外吸收值普遍小于外套膜中黑色物質(zhì)的紫外吸收值。

3 討論

天然黑色素在貝殼內(nèi)或外套膜內(nèi)會與蛋白質(zhì)、多糖緊密結合,不易分離,同時黑色素不溶于酸性溶液,牡蠣殼中含有大量的碳酸鈣和少量的有機物質(zhì)。鹽酸可以與貝殼中的碳酸鈣發(fā)生化學反應生成氯化鈣、水和大量氣體二氧化碳,鹽酸的水解作用也可以去除與黑色素結合的蛋白質(zhì)、碳水化合物以及脂類物質(zhì),效果優(yōu)于其它種類的酸(Kimuraet al,2014),所以本實驗利用鹽酸既可以溶解貝殼又可以水解其它有機物質(zhì),將黑色素從貝殼或者外套膜中分離出來,實驗結果也證明這樣做的效果良好。由于黑色素不溶于水、酸溶液、鹽溶液和大部分有機溶劑(Bassamet al,2002; de Cássiaet al,2005; Selvakumaret al,2008),故將黑色素溶解在0.01mL/L氫氧化鈉溶液中進行紫外光譜掃描,發(fā)現(xiàn) 0.01mL/L氫氧化鈉溶液可以很好地溶解牡蠣黑色素固體。

圖3 牡蠣外套膜中黑色素的紫外掃描圖Fig.3 UV absorption spectra: black pigment in the coat film of oystersAbs表示紫外吸收值,Wav表示波長,m1、m2、m3分別表示3份外套膜中提取的黑色物質(zhì)樣品

圖4 牡蠣貝殼和外套膜中黑色素的紫外掃描圖Fig.4 UV absorption spectra: black pigment in the shell and the coat film of oystersAbs表示紫外吸收值,Wav表示波長,s1、s2、s3分別表示3份貝殼中提取的黑色物質(zhì)樣品,m1、m2、m3分別表示3份外套膜中提取的黑色物質(zhì)樣品

雖然未見到對貝類黑色素提取和鑒定的報道,但貝類其它色素的提取和利用已有一定的研究成果,如扇貝貝殼和閉殼肌中類胡蘿卜素的提取和鑒定已有報道(Liet al,2010; Zhenget al,2010,2014),并且育成了貝殼、外套膜、閉殼肌色澤金黃的蝦夷扇貝和華貴櫛孔扇貝新品(種)系。黑色素具有抗氧化、抗衰老的作用(Luet al,2014),與胡蘿卜素的生理作用(Vrolijket al,2015)相似,本研究對牡蠣黑色素成功的進行了提取、鑒定,為貝類色素的研究和具保健價值貝類新品種的選育開拓了新的思路。通過對長牡蠣中黑色素的研究,拓寬了黑色素研究的物種范圍,也可以為不同物種黑色素形成機制比較(Sharmaet al,2002; Dubeyet al,2014; Mustaphaet al,2015)等理論研究提供資料。

貝殼與外套膜中黑色物質(zhì)紫外光譜的變化趨勢基本相同并都符合黑色素紫外吸收光譜特征,說明貝殼與外套膜中的黑色物質(zhì)均為黑色素。此外,作者發(fā)現(xiàn)貝殼中的吸收值普遍小于外套膜中的吸收值,說明外套膜中提取的黑色素純度比牡蠣貝殼中的黑色素純度要高,提示貝殼中黑色素提取的工藝有待進一步改進。另外,黑色素可分為真黑素和褐黑素,而真黑素又可分為黑真黑素和棕真黑素(李華等,2002; 李文等,2007),本研究暫未鑒定出長牡蠣中的黑色素屬于哪種黑色素,這是本實驗的不足之處,有待深入研究。雖然牡蠣黑色素形成的機制尚未研究清楚,但已經(jīng)確定為黑色素,因此目前可以按照邊研究邊開發(fā)的策略,針對海外市場特別是韓國市場對黑色外套膜牡蠣的青睞,結合單體牡蠣生產(chǎn)技術,生產(chǎn)出殼形規(guī)整、外套膜邊緣深黑的高端牡蠣以供出口,提高我國海洋貝類的國際競爭力。

4 結論

本研究成功提取并鑒定了長牡蠣貝殼和外套膜中的黑色素,是牡蠣黑色素提取方法的首次報道和牡蠣中存在黑色素的第一次確定,為高黑素含量長牡蠣新品種的選育奠定了基礎,同時也為黑色素相關領域的研究提供了參考。

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