上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與IgA腎病臨床病理的相關(guān)性分析

張 均，袁發(fā)煥，甘 華△

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科 400016；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶400037）

腎病是一組具有相同腎小球免疫病理特征的臨床癥候群，即腎組織活檢腎小球系膜區(qū)以IgA或IgA沉積為主要特征，也是引起終末期腎病的常見原因?；颊哐獕骸l(fā)病時血肌酐水平和尿蛋白定量作為判斷IgA腎病預(yù)后的臨床指標(biāo)已得到公認(rèn)[1]。近年隨著對上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）研究的逐漸深入，其在IgA腎病的發(fā)展過程中的作用越來越受到關(guān)注。有研究指出血管生成是影響IgA腎病預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究分析了168例IgA腎病患者腎組織轉(zhuǎn)錄因子（Snail）和平滑肌肌動蛋白-a（a-SMA）表達(dá)水平與常見臨床指標(biāo)的相關(guān)性，以期為IgA腎病患者臨床病情進(jìn)展尋找可靠的病理指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年1月至2013年12月在新橋醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢診斷的原發(fā)性IgA腎病患者168例。其診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1995年WHO制定的原發(fā)性腎小球疾病病理診斷分類標(biāo)準(zhǔn)，并排除過敏性紫癜、乙型肝炎病毒感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝硬化、腫瘤等疾病引起的繼發(fā)性IgA腎病；急性腎小管間質(zhì)病變、動脈病變及壞死病變。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色分為Snail、a-SMA 高表達(dá)組（A 組，117例），Snail、a-SMA 低表達(dá)組（B組，51例），并對兩組患者年齡、性別、病程、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、生化指標(biāo)（肌酐、尿素氮、三酰甘油、24h尿蛋白定量、總膽固醇、血清清蛋白、血清總蛋白、血糖）及病理情況（Lee氏分級）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2 方法

1.2.1 病理組織取樣 采用Tru Cut活檢針在B超引導(dǎo)下經(jīng)皮快速腎穿刺，每例標(biāo)本在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個高倍鏡視野，均行光鏡及免疫熒光檢查，病理科醫(yī)生專人負(fù)責(zé)閱片并遵循盲法。

1.2.2 主要試劑 免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Snail兔抗人多克隆抗體（1∶200）及a-SMA兔抗人多克隆抗體（稀釋濃度1∶100）購自美國Abcam公司；羊抗兔IgG二抗（稀釋濃度1∶200）購自美國Rockland公司；

1.2.3 組織病理分級 按照Lee氏分級標(biāo)準(zhǔn)分級。Ⅰ級：腎小管間質(zhì)基本正常，腎小管表現(xiàn)為輕度變形擴(kuò)張；Ⅱ級：腎小管萎縮程度、間質(zhì)纖維化的范圍小于20%，可見散在炎性細(xì)胞的浸潤；Ⅲ級：腎小管萎縮程度、間質(zhì)纖維化的范圍為30%～40%，散在和（或）彌漫性炎性細(xì)胞浸潤；Ⅳ級：腎小管萎縮程度、間質(zhì)纖維化的范圍大于50%，散在和（或）彌漫炎性細(xì)胞浸潤[2]。

1.2.4 免疫組織化學(xué) 采用二步法檢測腎臟組織Snail、a-SMA的表達(dá)，取腎臟組織石蠟切片進(jìn)行梯度脫蠟水化后，抗原采用微波修復(fù)、山羊血清室溫封閉20min，依次加入兔抗Snail（1∶200），兔抗a-SMA多克隆抗體（1∶100）4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)二抗37℃孵育30min，用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）法37℃水浴箱孵育20min，隨后加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）避光顯色1～5min，經(jīng)蘇木素復(fù)染胞核、乙醇梯度脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片。同時以PBS代替一抗作為陰性對照。光學(xué)顯微鏡觀察、拍照計(jì)數(shù)，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈棕褐色或棕黃色染色者為Snail、a-SMA陽性，不著色者為陰性。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為，低表達(dá)：無著色或局灶節(jié)段弱陽性；高表達(dá)：局灶階段強(qiáng)陽性或彌漫性強(qiáng)陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，其中計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料的比較 由表1可見，A組和B組在年齡和性別構(gòu)成比方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組病程、BMI比例與B組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組IgA腎病患者一般資料的比較

2.2 兩組間其他臨床指標(biāo)的比較 A組肌酐、尿素氮、三酰甘油、24h尿蛋白定量與B組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而總膽固醇、血清清蛋白、血清總蛋白、血糖等指標(biāo)與B組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 168例IgA腎病患者生化指標(biāo)的比較（±s）

表2 168例IgA腎病患者生化指標(biāo)的比較（±s）

a：P＜0.05，與B組比較。

項(xiàng)目 A組（n＝117） B組（n＝51）72.32±38.21尿素氮（mmol／L） 9.23±4.33a 4.52±2.21三酰甘油（mmol／L） 2.36±1.10a 1.22±0.92總膽固醇（mmol／L） 5.41±1.10 5.29±1.12血清總蛋白（g／L） 55.68±11.68 58.26±10.21血清清蛋白（g／L） 34.21±6.21 37.21±6.78血糖（mmol／L） 4.92±0.71 4.96±0.60 24h尿蛋白定量（mg／24h）3 207.56±607.32a肌酐（μmol／L） 162.78±120.23a 1 535.12±519.25

2.3 Lee氏分級與Snail、a-SMA表達(dá)的關(guān)系 168例IgA腎病患者中Lee氏分級以Ⅲ級最多，占51.8%，其中A組Ⅲ級有59例（50.4%），B組Ⅲ級有28例（54.9%）；B組病理分級多為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，共有41例，其中Ⅰ＋Ⅱ級占25.5%，Ⅳ＋Ⅴ級占19.6%，而A組病理分級多在Ⅳ、Ⅴ級，共有47例，病理分級Ⅳ和Ⅴ級IgA腎病患者Snail、a-SMA高表達(dá)的比例明顯高于Ⅰ、Ⅱ級（40.2%vs.9.4%），兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Lee氏分級及Snail、a-SMA免疫組織化學(xué)表達(dá)見圖1。

圖1 兩組IgA腎病患者Lee氏分級及Snail、a-SMA免疫組織化學(xué)表達(dá)比較（×200）

3 討 論

IgA腎病是我國常見的原發(fā)性腎小球疾病之一，也是引起終末期腎病的主要原因之一，近些年發(fā)病率呈明顯上升趨勢[3]。EMT是指成熟的上皮細(xì)胞失去其上皮樣表型，并獲得未成熟的間充質(zhì)表型的過程。發(fā)育生物學(xué)研究表明，哺乳動物的多種臟器在形成過程中都存在EMT的改變過程[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者Snail、a-SMA的表達(dá)存在明顯異常，提示EMT與IgA腎病的病理類型密切相關(guān)。Strutz首先提出成年動物的腎小管上皮細(xì)胞能轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)樣的成纖維細(xì)胞，由此推測成年動物的腎臟也存在EMT的過程，之后也被稱為EMT[6]。EMT過程的本質(zhì)上是細(xì)胞重塑的一種，EMT中細(xì)胞的標(biāo)記蛋白、表型及功能上都將發(fā)生改變，例如喪失上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志、上皮鈣黏附素（E-caherin）、橋黏斑蛋白及β-鈣環(huán)黏素等；獲得間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志：成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白等[6]。在腎臟，上皮系固有細(xì)胞包括腎小球臟層上皮細(xì)胞、腎小球壁層上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞。這3種上皮系細(xì)胞均可以發(fā)生EMT。隨著對腎小管上皮細(xì)胞在慢性腎臟疾病發(fā)生進(jìn)展作用認(rèn)識的不斷深入，目前已發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化對腎臟纖維化至關(guān)重要。而腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后可能存在如下結(jié)局：如果是短暫的損傷性刺激，細(xì)胞可恢復(fù)為正常腎小管上皮細(xì)胞；細(xì)胞增生并轉(zhuǎn)化為成纖維樣細(xì)胞；細(xì)胞發(fā)生凋亡；如果受到再生性信號刺激，細(xì)胞即可再分化為嶄新的上皮樣細(xì)胞[7]。研究表明，肌成纖維細(xì)胞是間充質(zhì)的主要組成細(xì)胞之一，而a-SMA是肌成纖維細(xì)胞表型的標(biāo)志蛋白[8]。慢性腎小球疾病的發(fā)展中，腎間質(zhì)內(nèi)表達(dá)a-SMA的肌成纖維細(xì)胞明顯增多，肌成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，因此其數(shù)量是判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。在對由單側(cè)輸尿管阻塞引起的阻塞性腎病時發(fā)現(xiàn)，在早期階段（1～3d），a-SMA表達(dá)呈升高趨勢，并且a-SMA陽性的細(xì)胞主要位于腎臟間質(zhì)，同時發(fā)現(xiàn)，a-SMA的高表達(dá)并不同時伴隨有上皮細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化；在7d后，腎小管上皮細(xì)胞大量高表達(dá)a-SMA，并伴隨E-cadherin表達(dá)的減少。而在14d后，E-cadherin表達(dá)明顯降低，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高表達(dá)a-SMA的成纖維樣細(xì)胞。Bai等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在5／6腎切除大鼠，a-SMA陽性細(xì)胞數(shù)目與腎小管間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度之間存在顯著正相關(guān)。研究表明，Snail作為一個重要的轉(zhuǎn)錄抑制子，其對EMT的調(diào)控作用已被證實(shí)，Snail被激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，對許多靶基因起作用，其中最重要的是下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin[10]。Snail進(jìn)入胞核后能與E-cadherin啟動子中特異性的DNA序列5′-CAC CTG-3′（又稱E-box元件）結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，使其蛋白表達(dá)減少，上皮細(xì)胞間的黏附性喪失，從而觸發(fā)EMT[11]。本研究結(jié)果表明，Snail、a-SMA在IgA腎病患者腎組織中的高表達(dá)與腎臟病理Lee氏分級密切相關(guān)，提示EMT參與IgA腎病的發(fā)生、發(fā)展。有文獻(xiàn)表明，EMT的調(diào)節(jié)因素包括生長因子、細(xì)胞因子、激素及細(xì)胞外信號。其中最為熟知的當(dāng)屬轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），它在多種慢性腎臟疾病模型中的表達(dá)增強(qiáng)，而腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1受體表達(dá)同時上調(diào)。除此之外還包括，表皮生長因子與成纖維生長因子-2能協(xié)同增強(qiáng)TGF-β1引起EMT的能力；基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-2）也可通過激活TGF-β1而引起EMT[12]。因此，TGF-β1直接需與轉(zhuǎn)化生長因子-β受體 TGF-βRⅡ結(jié)合成復(fù)合物，發(fā)生二聚化，隨后便與轉(zhuǎn)化生長因子-β受體TGF-βRⅠ再形成四聚體，此時的構(gòu)象發(fā)生了改變。在TGF-β1誘導(dǎo)上皮樣細(xì)胞發(fā)生EMT信號傳導(dǎo)主要是通過Smad分子依賴信號傳導(dǎo)途徑而起作用的。眾所周知，Smad蛋白是TGF-β1下游細(xì)胞內(nèi)信號的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，也是TGF-β1超家族胞內(nèi)信號通路中經(jīng)典的信號分子。Smad受體是通過激活錨定蛋白調(diào)節(jié)Smad2和／或Smad3復(fù)合物形成；激活的Ⅰ型受體使Smad2和／或Smad3蛋白發(fā)生絲氨酸殘基磷酸化，隨后與Smad4蛋白結(jié)合后即可轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，在核內(nèi)調(diào)控TGF-β1反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。因此，TGF-β1引起的EMT主要是依賴Smad信號通路的。

綜上所述，本課題選用公認(rèn)和具有良好重復(fù)性的Lee氏分級作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Snail、a-SMA在IgA腎病患者腎組織中的表達(dá)與腎臟病理lee氏分級密切相關(guān)，Snail、a-SMA高表達(dá)組患者中l(wèi)ee氏分級Ⅰ＋Ⅱ級占9.4%、Ⅲ級占50.4%、Ⅳ＋Ⅴ級占40.2%，而Snail、a-SMA低表達(dá)組患者中l(wèi)ee氏分級Ⅰ＋Ⅱ級占25.5%、Ⅲ級占54.9%、Ⅳ＋Ⅴ級占19.6%，提示Snail、a-SMA的高表達(dá)可作為IgA腎病預(yù)后不良的重要因素。但究竟是何種因素導(dǎo)致腎組織Snail、a-SMA的高表達(dá)，目前尚不清楚。在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中，Snail、a-SMA的表達(dá)次序及刺激因素，值得進(jìn)一步深入探討。

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