甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析篩查大腸癌的性能評(píng)價(jià)＊

肖著軍，蕭著玲，陳金敏，鄧飛鴻，許岸高

（1.惠州市中山大學(xué)惠亞醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東惠州516081；2.湖南省永州市藍(lán)山縣中心醫(yī)院消化科 425800；3.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科，廣州510515；4.廣東省惠州市醫(yī)學(xué)研究所 516003）

目前，全球大腸癌（colorectal cancer，CRC）的發(fā)病率和病死率居第3位，而且有逐年上升的趨勢(shì)。在中國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，CRC發(fā)病率也逐年升高[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，診斷為CRC早期的患者中5年生存率可超過90%，而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，5年生存率大約只有60%，如果出現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則5年生存率不到10%[2]。因此，CRC早期篩查是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。而CRC篩查常用的糞便潛血（faecal occult blood testing，F(xiàn)OBT）、結(jié)腸鏡和CT結(jié)腸成像術(shù)等方法都難以完全達(dá)到安全簡(jiǎn)便、接受性好和成本效益好等大規(guī)模篩查的要求，尋求更理想的篩查方法是當(dāng)務(wù)之急。糞便DNA檢測(cè)作為一種非侵襲性、簡(jiǎn)便并具有很高敏感性和特異性的方法深受人們的歡迎[3]。但是，目前糞便DNA檢測(cè)費(fèi)用較高，還不能用于CRC的篩查[3-5]。自從2001年Worm等[6]首次運(yùn)用高分辨率熔解曲線分析（high-resolution melting，HRM）檢測(cè)CpG島甲基化以來，先后有人用此技術(shù)檢測(cè)大腸腫瘤患者血液和組織中基因甲基化，其檢出率分別為48.0%[7]和33.3%～63.0%[8]，都取得了理想的結(jié)果。大量研究證實(shí)甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（methylation-sensitive high-resolution melting，MS-HRM）作為一種PCR后閉管操作技術(shù)，檢測(cè)基因甲基化具有性能好、可靠、快捷、成本低等優(yōu)勢(shì)[9-10]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無評(píng)價(jià) MS-HRM檢測(cè)患者糞便中基因甲基化篩查大腸腫瘤性能的研究報(bào)道。因此，本研究采用MS-HRM技術(shù)檢測(cè)CRC患者、進(jìn)展期腺瘤（advanced adenomas，AA）患者和正常人糞便DNA中vimentin基因甲基化狀態(tài)來探討MS-HRM在CRC篩查中應(yīng)用的潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年9月至2013年1月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院內(nèi)鏡中心行全結(jié)腸鏡檢查并經(jīng)病理證實(shí)的CRC患者27例（CRC組）、AA患者25例（AA組）和30例結(jié)腸鏡陰性對(duì)照者（對(duì)照組）的糞便樣本。CRC組和AA組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡大于40歲、病理組織學(xué)檢查（均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的胃腸道病理學(xué)專家閱片判定）確診為結(jié)直腸AA（指直徑大于或等于1cm或組織學(xué)檢測(cè)為絨毛狀腺瘤或重度異型性增生的腺瘤）或CRC患者；（2）能收集合格糞便樣本的患者。CRC組和AA組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）家族性或遺傳性結(jié)直腸腺瘤或腫瘤；（2）伴有其他系統(tǒng)或器官腫瘤；（3）CRC或AA患者同時(shí)患有炎癥性腸?。唬?）術(shù)前有放療或化療史；（5）妊娠或有嚴(yán)重肝腎功能不全者；（6）非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡、性別匹配；（2）腸鏡檢查陰性；（3）收集到合格糞便樣本。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）各種原因而未行腸鏡檢查的；（2）收到的糞便樣本不合格。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 用商品化的糞便留樣瓶收集CRC患者、AA患者手術(shù)前和正常人新鮮糞便標(biāo)本約3g，所有糞便標(biāo)本收集后36h內(nèi)保存于-80℃冰箱待測(cè)。

1.2.2 主要試劑和儀器 QIAamp DNA stool mini kit（50次）和EpiTect HRM PCR Kit（100次）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；CpGenome Universal Methylated DNA（10μg）和 CpGenome Universal Unmethylated DNA（10μg）購(gòu)自美國(guó) Millipore公司；EZ DNA Methylation-GoldTMKit（50次）購(gòu)自美國(guó)Zymoresearch公司；MS-HRM檢測(cè)采用全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)LightCycler480System（羅氏公司）；便隱血檢測(cè)試紙（膠體金人血紅蛋白單抗檢測(cè)法，萬華普曼生物工程有限公司）。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)vimentin基因CpG島序列，由上海生工公司設(shè)計(jì)合成引物。vimentin基因的MS-HRM引物序列為，上游：5′-GCG ATG GTT TAG TTG TAA GTT GGT AGT-3′，下游：5′-CTA TCC CGC CGA TTA AAA ACT CCT A-3′，退火溫度為63℃，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為126bp。

1.2.4 糞便DNA的提取 按QIAamp DNA stool mini kit（Qiagen）說明書操作。稱取糞便約200mg于2mL EP管，加入1.6mL Buffer ASL渦旋混勻1min，使糞便溶解，13 000 r／min離心1min。吸取1.4mL上清液到新的2mL EP管，加入inhibitEX Tablet混勻1min，室溫靜置1min，吸收雜質(zhì)，13 000r／min離心3min。吸25μL Proteinase K到新2mL EP管中，加入上清液600μL，Buffer AL 600μL，混勻，70℃溫浴10min。加600μL無水乙醇到裂解液，混勻。取吸附柱，加入上述裂解液，13 000r／min離心1min，棄廢液。加入500μL的AW1，13 000r／min離心1min，棄廢液。加入500μL的AW2，13 000r／min離心3min，棄廢液。最后回收DNA，溶于100μL Buffer AE，并保存在-20℃冰箱。DNA濃度和純度使用NanoDropND-1000UV Spectrophotometer分光光度計(jì)測(cè)定，DNA質(zhì)量經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 亞硫酸氫鹽處理 取500ng DNA樣品，按照EZ DNA Methylation-GoldTMKit（50次，zymoresearch）甲基化修飾試劑盒說明書進(jìn)行甲基化修飾，修飾時(shí)間約為3.5h，修飾后的DNA在24h內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.6 MS-HRM 分 析 PCR 擴(kuò) 增 和 HRM 在 LightCycler480System一個(gè)反應(yīng)中完成，步驟按EpiTect HRM PCR Kit（100次，Qiagen）說明書進(jìn)行，所有反應(yīng)均可重復(fù)進(jìn)行。25 μL反應(yīng)體系包括：12.5μL 2xEpiTect HRM PCR Master Mix，上下游引物（10μmol／L）各1.9μL，0.2μL亞硫酸氫鹽修飾后DNA，8.5μL DEPC水；反應(yīng)條件如下：95℃15min，然后95℃10s，55℃30s，72℃10s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后HRM步驟，65℃1s，然后按0.02℃／s的速度從65℃升至95℃，每秒鐘收集25次熒光。最后40℃冷卻1s。使用Gene Scanning Software分析HRM的數(shù)據(jù)。

1.2.7 糞便潛血試驗(yàn) 按照便隱血檢測(cè)試紙說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，計(jì)數(shù)資料采用率表示，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher′s精確概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MS-HRM在3組糞便樣本中的陽(yáng)性檢出率 糞便中vimentin基因甲基化陽(yáng)性檢出率在CRC組、AA組和對(duì)照組中分別為81.5%（22／27），80.0%（20／25）和6.7%（2／30），病例組明顯高于對(duì)照組（χ2＝42.012，P＜0.05）。其中，CRC組和AA組均明顯高于對(duì)照組（χ2＝32.629，P＜0.05；χ2＝30.556，P＜0.05），而CRC組和 AA 組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.000，P＞0.05），見圖1。

圖1 vimentin基因的MS-HRM檢測(cè)結(jié)果。

2.2 FOBT在3組糞便樣本中的陽(yáng)性檢出率 FOBT在CRC組、AA組和對(duì)照組中的陽(yáng)性檢出率分別為37.0%（10／27）、12.0%（3／25）和3.3%（1／30），病例組明顯高于對(duì)照組（χ2＝6.308，P＜0.05）。其中，CRC 組明顯 高于對(duì) 照組（χ2＝10.365，P＜0.05），而 AA 組與對(duì)照組間無明顯差異（χ2＝0.506，P＞0.05）；CRC組的陽(yáng)性檢出率明顯高于 AA組（χ2＝4.340，P＜0.05）。

2.3 MS-HRM和FOBT的診斷性能比較 在病例組中，MSHRM 和FOBT的診斷敏感性分別為80.8%（42／52）和25.0%（13／52），前者顯著高于后者（χ2＝32.454，P＜0.05）；在對(duì)照組中，兩者的診斷特異性分別為93.3%（28／30）和96.7%（29／30），兩者之間無明顯差異（χ2＝0.000，P＞0.05），見表1。

表1 3組中vimentin基因甲基化狀態(tài)[n（%）]

3 討 論

近年來我國(guó)CRC發(fā)病率呈升高趨勢(shì)，早期診斷是改善其預(yù)后的關(guān)鍵，篩查可以提高早期診斷率。與糞便潛血和腸鏡相比，糞便DNA檢測(cè)具有諸多優(yōu)勢(shì)，并被列入美國(guó)結(jié)直腸癌篩查指南的供選方法。除廉價(jià)外，糞便DNA檢測(cè)幾乎繼承了糞便潛血檢測(cè)所有優(yōu)點(diǎn)，而且具有更好的檢測(cè)性能，檢測(cè)CRC的敏感性達(dá)52%～91%，特異性達(dá)91%～97%[3]；更重要的是腺瘤檢出率更高，能有效地降低CRC的發(fā)病率。糞便DNA與糞便潛血單獨(dú)檢測(cè)AA的敏感性分別是18%和10%（P＜0.05），特異性相當(dāng)，分別是94%和95%[3]。此外，糞便 DNA只需1次大便采樣[5，11-12]；它不受大腸腫瘤部位的影響[13]；DNA來源于大腸局部腫瘤本身，而且癌細(xì)胞的脫落量大，加上逃避了細(xì)胞凋亡，其DNA仍保持完整，這些都無形中提高了檢測(cè)的靈敏度[3，5，14]。

在CRC篩查的糞便DNA分子標(biāo)記中，目前存在著一種以甲基化標(biāo)記取代基因突變標(biāo)記的趨勢(shì)[5]。Bosch等[5]總結(jié)近10年關(guān)于CRC糞便DNA標(biāo)記物的研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)甲基化標(biāo)記檢測(cè)能達(dá)到與一組基因突變標(biāo)記相當(dāng)?shù)男阅?。以基因突變作為糞便DNA篩查標(biāo)記，其特異性和敏感性均不能滿足CRC篩查的要求，檢測(cè)CRC的敏感性為25%～73%，檢測(cè)大腸腺瘤的敏感性為15%～17%，特異性為94%～96%；而以單個(gè)基因甲基化為糞便DNA篩查標(biāo)記，檢測(cè)CRC敏感性達(dá)38%～94%，檢測(cè)大腸腺瘤的敏感性為31%～70%，特異性為79%～100%[5]。因此，基因甲基化是篩查CRC較理想的生物標(biāo)記。在眾多CRC早期篩查的糞便DNA甲基化標(biāo)記中，vimentin是研究比較成熟并被充分證實(shí)具有很好檢測(cè)性能的基因[15]。有研究表明，vimentin基因在組織樣本中進(jìn)行甲基化分析，檢測(cè)CRC和腺瘤的靈敏度分別是53%～83%和50%～84%[12，15]；通過糞便vimentin基因甲基化分析檢測(cè) CRC 和AA的敏感性也分別達(dá)81%和83%，特異性為82%[16]。然而，目前常用基因甲基化檢測(cè)技術(shù)難以滿足便捷、經(jīng)濟(jì)、安全高效的大規(guī)模篩查要求，急需尋求更理想的檢測(cè)技術(shù)。

MS-HRM是表觀遺傳學(xué)中檢測(cè)CpG位點(diǎn)的最新技術(shù)。它主要是根據(jù)DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量、堿基互補(bǔ)性差異和特定飽和染料可以插入DNA雙鏈中的特性，應(yīng)用高分辨率的熔解曲線對(duì)樣品進(jìn)行分析，通過比較曲線的熔解溫度和峰形，在一系列的CpG位點(diǎn)中，檢測(cè)出單個(gè)甲基化的發(fā)生，也可以對(duì)平均甲基化水平進(jìn)行分析，是一種PCR后閉管操作技術(shù)，無需序列特異性探針及PCR后繼分管處理，具有高通量、無污染、操作簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高、重復(fù)性好、成本低、不受檢測(cè)位點(diǎn)局限等優(yōu)勢(shì)[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，MS-HRM檢測(cè)CRC患者外周血中AKAP12基因啟動(dòng)子甲基化的敏感性為48.0%，特異性為98.0%[7]；檢測(cè)CRC組織中 MGMT基因甲基化的敏感性為42.4%，特異性為91.0%[8]。這些研究都證實(shí) MS-HRM檢測(cè)基因甲基化具有性能好、可靠、快捷、成本低等優(yōu)勢(shì)。與血液、組織不同，糞便中人DNA含量極低，其平均濃度為100ng／g，大約只占總糞便DNA的0.01%，其他微生物和食物DNA卻占99.99%；而且糞便中的人DNA還包括來自正常大腸黏膜的DNA[17]。因此，從糞便中檢測(cè)人基因甲基化對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求更高。

本研究應(yīng)用MS-HRM技術(shù)檢測(cè)糞便中vimentin基因的甲基化狀態(tài)來篩查大腸腫瘤，在CRC和AA組中的診斷敏感性分別為81.5%和80.0%，在對(duì)照組中的診斷特異性為93.3%，診斷敏感性和特異性都在目前國(guó)外研究報(bào)道的范圍內(nèi)（CRC和AA診斷敏感性分別為38.0%～86.0%和15.0%～83.0%，診斷特異性為73.0%～100.0%）[5，12，16]，且比較理想。FOBT具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、非侵入性等優(yōu)點(diǎn)，是目前篩查CRC最常用的方法，但它敏感性和特異性欠佳。本研究中FOBT對(duì)CRC和AA的診斷敏感性分別為37.5%和12.0%，這與國(guó)外相關(guān)研究報(bào)道相近[3]，卻明顯低于筆者用 MS-HRM檢測(cè)基因甲基化對(duì)CRC和AA的診斷敏感性。兩種方法的特異性無明顯差異。研究已經(jīng)證實(shí)，絕大多數(shù)CRC是從癌前病變演變而來，遵循“早期腺瘤-進(jìn)展期腺瘤-癌”的癌變模式[18]。對(duì)腺瘤尤其是AA進(jìn)行檢測(cè)并及時(shí)處理，不僅可以降低CRC的病死率，還可以降低其發(fā)病率，因此，腺瘤才是預(yù)防篩查的真正目標(biāo)。但是目前最常用的CRC篩查方法FOBT對(duì)腺瘤的檢出率太低[3，13]，對(duì)CRC的發(fā)病率影響較小。本試驗(yàn)FOBT在AA組中的陽(yáng)性率也只有12.0%，與對(duì)照組無明顯差異。而MS-HRM技術(shù)對(duì)AA的檢出率卻能達(dá)到80.0%，與CRC的檢出率相近。此外，F(xiàn)OBT還易受飲食及痔瘡、炎癥性腸病等其他疾病的影響，而MS-HRM方法不受飲食影響。顯然，應(yīng)用MS-HRM檢測(cè)糞便中基因甲基化有望取代FOBT而作為CRC篩查的手段。

然而，研究發(fā)現(xiàn)vimentin基因并不只是在大腸腫瘤中發(fā)生甲基化，它還與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)，比如乳腺癌等[19]。更重要的是它在上消化道腫瘤中也有很高的檢出率，甚至可以作為篩查上消化道腫瘤的生物標(biāo)記[20]。因此還需要對(duì)通過vimentin基因甲基化檢測(cè)篩查出來的CRC患者進(jìn)行腸鏡等其他檢查方法以進(jìn)一步確診。和FOBT結(jié)果受其他疾病影響一樣，這并不影響對(duì)應(yīng)用MS-HRM技術(shù)來篩查CRC的性能評(píng)估。

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