血脂、LP（a）及TNF-α水平變化及在動脈粥樣硬化過程中的作用

鄭昌柱，任雨笙，李蘭蓀，賈國良

（1.上海浦東新區(qū)周浦醫(yī)院心內(nèi)科 201318；2.第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院心內(nèi)科，上海200003；3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科，西安710032）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是由多種因素共同作用導(dǎo)致的結(jié)果，其中以炎癥、脂質(zhì)浸潤、血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、平滑肌細(xì)胞增生等起著關(guān)鍵作用[1]，高血脂和脂質(zhì)代謝紊亂在AS發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，脂蛋白（A）[Lipoprotein（a），LP（a）]有致AS作用，其血中濃度升高與心肌梗死、血管再狹窄和腦卒中等密切相關(guān)，是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一種具有多種生物學(xué)活性的小分子蛋白，具有促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的作用，也參與了AS的發(fā)生與發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)采用高脂喂養(yǎng)-球囊損傷新西蘭兔胸腹主動脈復(fù)制動脈粥樣硬化及血管成形術(shù)（percutaneous tranluminal angioplasty，PTA）后再狹窄模型，在慢性實(shí)驗(yàn)過程中以血管病理學(xué)變化為基礎(chǔ)，研究血管AS及PTA后血管組織結(jié)構(gòu)的改變以及血脂、LP（a）和TNF-α在這一過程的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑 純種新西蘭兔30只、雄性、7月齡、體質(zhì)量2.5～3.5kg（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）。膽固醇（天津市東方衛(wèi)生材料廠進(jìn)口分裝），LP（a）檢測試劑盒（上海博力生物制品公司），TNF-α檢測試劑盒（北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），單C臂心臟介入X光系統(tǒng)（Philips Lab，荷蘭），造影導(dǎo)管及PTCA球囊導(dǎo)管（Cordis，美國），日立7150型自動生化分析儀（Hitachi Co，日本），Shandon AS352R 型切片機(jī)（Life Sci.Inter.Limited，英國）。

1.2 方法

1.2.1 高脂動物模型的制備 30只高脂飲食（1.0%膽固醇、5.0%蛋黃粉、1.5%豬油）喂養(yǎng)的純種新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)組。高脂飲食喂養(yǎng)2周后，使用3%戊巴比妥鈉30mg／kg麻醉動物，常規(guī)穿刺左側(cè)股動脈，經(jīng)右股動脈送入4F球囊導(dǎo)管至胸主動脈分別以6、8、12個(gè)大氣壓充盈球囊后回拉至髂總動脈，反復(fù)回拉3次以造成腹主動脈內(nèi)膜損傷。以氣囊的機(jī)械作用造成動脈內(nèi)膜損傷，術(shù)后動物繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)。10只普通飼料喂養(yǎng)的純種新西蘭兔作為對照組。實(shí)驗(yàn)組和對照組新西蘭兔在月齡、性別和術(shù)前體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組術(shù)前指標(biāo)（±s）

表1 實(shí)驗(yàn)組和對照組術(shù)前指標(biāo)（±s）

組別 n TC（mmol／L） TC（mmol／L） LDL-C（mmol／L） HDL-C（mmol／L） Lp（a）（mg／L） TNF-α（ng／L）實(shí)驗(yàn)組 30 1.62±0.92 0.89±0.37 2.26±0.47 0.89±0.18 83.93±17.83 0.34±0.08對照組 10 1.63±0.92 0.85±0.35 2.51±0.48 0.90±0.18 82.78±17.05 0.32±0.07

表2 新西蘭兔高脂實(shí)驗(yàn)前后指標(biāo)變化（±s，n＝30）

表2 新西蘭兔高脂實(shí)驗(yàn)前后指標(biāo)變化（±s，n＝30）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與試驗(yàn)前比較。

時(shí)間 TC（mmol／L） TG（mmol／L） LDL-C（mmol／L） HDL-C（mmol／L） LP（a）（mg／L） TNF-α（ng／L）93±17.83 0.34±0.08實(shí)驗(yàn)后2周 23.30±8.45b 1.27±0.55a 5.62±1.22a 0.66±0.24a 88.92±22.76 0.34±0.12 PTA術(shù)后1個(gè)月 39.52±15.92b 2.91±0.49b 8.74±2.13b 0.82±0.32 107.31±23.82a 0.44±0.13 PTA術(shù)后2個(gè)月 43.22±13.64b 3.24±0.62b 18.35±3.42b 0.83±0.54 89.36±27.68 3.54±0.67b PTA術(shù)后3個(gè)月 47.63±16.57b 3.67±0.57b 23.46±5.41b 0.86±0.61 86.51±24.54 3.48±1.32實(shí)驗(yàn)前 1.62±0.92 0.89±0.37 2.26±0.47 0.89±0.18 83.b

1.2.2 血液生化檢查 分別于實(shí)驗(yàn)前、喂養(yǎng)2周和PTA術(shù)后1、2、3個(gè)月行血液生化檢查，常規(guī)生化法檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）濃度、低密度脂蛋白（LDL-C）濃度、按Friedewald公式計(jì)算；ELISA法檢測LP（a）和TNF-α濃度。

1.2.3 病理學(xué)檢查 PTA術(shù)后3月時(shí)，解剖胸腹腔及腹股溝區(qū)，分離胸、腹主動脈及髂總動脈全長，縱行切開后，觀察血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，斑塊、血栓形成情況照相記錄；分段截取全程血管壁組織，常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組以及對照組血管的病理改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)、方差分析及Logistic相關(guān)分析等處理。相對參考值確定用ROC曲線下面積（area under the curve，AUC），AUC＜0.5表明無診斷價(jià)值；AUC 為0.5～＜0.7有較低的診斷價(jià)值；AUC為0.7～≤0.9中等診斷準(zhǔn)確性；AUC＞0.9具有較高診斷準(zhǔn)確性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)組及對照組實(shí)驗(yàn)前一般特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。經(jīng)高脂喂養(yǎng)的新西蘭兔的TC、TG、LDL-C水平隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長明顯增高，顯著高于基礎(chǔ)水平（P＜0.05），高脂喂養(yǎng)2周時(shí) HDL-C較實(shí)驗(yàn)前明顯較低（P＜0.05），PTA術(shù)后HDL-C水平略有升高但仍低于實(shí)驗(yàn)前（P＞0.05）；高脂喂養(yǎng)2周時(shí)及PTA術(shù)后1個(gè)月兔血中LP（a）含量與高脂實(shí)驗(yàn)前差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在PTA術(shù)后2～3個(gè)月的兔血中LP（a）含量與高脂實(shí)驗(yàn)前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高脂喂養(yǎng)PTA術(shù)后1個(gè)月的兔血中TNF-α含量較高脂實(shí)驗(yàn)前無明顯升高（P＞0.05），PTA術(shù)后2個(gè)月時(shí)TNF-α含量急劇升高，明顯高于實(shí)驗(yàn)前（P＜0.01），PTA術(shù)后3個(gè)月時(shí)TNF-α含量進(jìn)一步升高，見表2。

球囊擴(kuò)張拉傷腹主動脈后3周，高脂喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組動物主動脈內(nèi)膜廣泛增厚，部分呈瘢痕樣改變，斑塊內(nèi)大量平滑肌細(xì)胞增生伴纖維結(jié)締組織透明變性，內(nèi)膜下灶性鈣鹽沉積及少量炎癥細(xì)胞浸潤，而對照組動脈內(nèi)膜完整，無增生，表面光滑，血管壁彈力纖維分布均勻，無泡沫細(xì)胞及類脂質(zhì)沉積，見圖1。

圖1 3個(gè)月后腹主動脈組織切片（HE染色，×100）

圖2 TNF-α和LP（a）ROC曲線

以術(shù)后腹主動脈是否發(fā)生大于50%狹窄為因變量，月齡，術(shù)前體質(zhì)量，術(shù)前后 TG、TC、HDL-C、LDL-C、LP（a）、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TNF-α水平等均作為自變量，進(jìn)行多元Logistic逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)后，2個(gè)月TNF-α水平對于腹主動脈狹窄發(fā)生的危險(xiǎn)性比值（RR）為1.84（95%CI：1.26～2.73，P＜0.01）。表明術(shù)后2個(gè)月TNF-α峰值為腹主動脈狹窄發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。TNF-α的ROC曲線下面積為0.871（95%CI：0.811～0.956），Lp（α）為0.523（95%CI：0.409～0.720），表明 TNF-α對高血壓伴隨冠心病具有較高診斷準(zhǔn)確性。以敏感性加特異性最大值為截?cái)帱c(diǎn)，對TNF-α進(jìn)行分析，其截?cái)帱c(diǎn)為3.1 ng／L，敏感性為87.2%，特異性為78.3%，見圖2。

3 討 論

AS的形成與發(fā)展是一個(gè)緩慢的炎癥過程，早期由于血管內(nèi)膜的損傷、血小板聚集、炎細(xì)胞浸潤，包括血小板源性生長因子（PGDF）等的大量生長因子及血管活性物質(zhì)的釋放，促進(jìn)了血栓形成及平滑肌細(xì)胞的遷移、增生以及細(xì)胞外基質(zhì)的增生，在AS的不同時(shí)間段血管壁出現(xiàn)不規(guī)則狹窄等。本實(shí)驗(yàn)采用高脂狀態(tài)下的新西蘭兔動脈損傷模型，應(yīng)用球囊導(dǎo)管的機(jī)械作用模擬PTCA導(dǎo)致兔動脈血管壁的損傷，觀察AS的慢性實(shí)驗(yàn)過程中動脈血管組織的病理形態(tài)及改變以及血脂、LP（a）和TNF-α在這一過程的變化。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常動脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整、表面光滑；而實(shí)驗(yàn)組腹主動脈內(nèi)膜廣泛增厚，斑塊內(nèi)大量平滑肌細(xì)胞增生伴纖維結(jié)締組織透明變性，內(nèi)膜下灶性鈣鹽沉積及少量炎細(xì)胞浸潤。研究證實(shí)高血脂和脂代謝紊亂、LP（a）、慢性炎性反應(yīng)等均參與AS的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。Lp（a）結(jié)構(gòu)與LDL-C相似，是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]，與冠狀動脈病變程度呈正相關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)顯示，血清中LP（a）水平變化與TC、LDL-C的變化沒有平行關(guān)系，LP（a）水平在TPA術(shù)后1個(gè)月比術(shù)前有升高，但TPA術(shù)后2～3個(gè)月同術(shù)前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。體內(nèi)LP（a）的水平與遺傳因素有關(guān)，個(gè)體差異很大，變化不受年齡、飲食、吸煙、酗酒及多數(shù)降脂藥物的影響[7]。在本實(shí)驗(yàn)中LP（a）水平未表現(xiàn)出明顯升高，這可能與實(shí)驗(yàn)動物的種屬和抗原性不同及實(shí)驗(yàn)中采血時(shí)間點(diǎn)選擇較寬等有關(guān)。LP（a）的生物學(xué)性質(zhì)、致病機(jī)制等還需進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α對腹主動脈粥樣硬化敏感性為87.2%，特異性為78.3%。AS早期階段，TNF-α可通過破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性、sis原癌基因的轉(zhuǎn)錄、血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凝血與抗凝系統(tǒng)失平衡等機(jī)制參與AS的發(fā)生與發(fā)展[8-9]。TNF-a參與動脈粥樣硬化的炎癥發(fā)生、發(fā)展過程[10]，并處于核心地位[11]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTA術(shù)后1個(gè)月的血清TNF-α濃度升高，PTA術(shù)后2個(gè)月時(shí)TNF-α濃度急劇升高，PTA術(shù)后3個(gè)月時(shí)TNF-α含量較前一個(gè)月無明顯改變。提示TNF-α升高并非發(fā)生在組織損傷期，而多與組織的修復(fù)過程有關(guān)。由于巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞都可產(chǎn)生TNF-α，推測TNF-α在PTA 后中晚期急劇升高可能是血管平滑肌及內(nèi)皮細(xì)胞在組織修復(fù)過程中產(chǎn)生的，與血管PTA后再狹窄發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后2個(gè)月TNF-α峰值為腹主動脈狹窄發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說明TNF-α在引起動脈粥樣硬化發(fā)展的病理進(jìn)程中，起到了關(guān)鍵作用?？傊?，TNF-α參與了PTA后血管再狹窄過程的發(fā)生發(fā)展，但其在AS中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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