藍莓對四氯化碳所致急性肝損傷大鼠肝組織GCLC mRNA及蛋白表達的影響＊

趙雪珂，吳榮敏，姚玉梅，田 濤，周明玉，張寶芳

（1.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院感染科，貴陽550004；2.貴州省婦幼保健院功能科，貴陽550003；3.貴州省思南縣人民醫(yī)院感染科 565100）

藍莓富含花青素、超氧化物歧化酶（SOD）等多種營養(yǎng)成分，是一種天然的具有抗氧化功能的食品，可改善記憶力、降血壓、防癌等[1-4]。近年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，藍莓可減輕四氯化碳（CCl4）、D-半乳糖胺和脂質(zhì)多糖誘導的急性肝損傷，可能與藍莓的抗氧化活性有關(guān)[5-6]。為進一步明確藍莓減輕大鼠急性肝損傷的可能機制，本實驗用CCl4誘導大鼠急性肝損傷模型，采用實時熒光PCR、免疫組織化學、Western blot方法檢測藍莓對急性肝損傷大鼠肝組織中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞基（GCLC）的mRNA及蛋白表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性 Wistar大鼠50只，清潔級，體質(zhì)量（180±20）g，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心[批號SCXK（渝）2007-0001]。普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，自然采光，室溫15～25℃，實驗前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.1.2 實驗材料 藍莓（兔眼品種），貴州省麻江縣藍莓基地提供，-20℃保存，臨用時解凍榨汁，2g干果榨汁1mL。聯(lián)苯雙酯（北京協(xié)和藥廠，批號11020980）。

1.1.3 主要試劑 CCl4分析純（成都市科龍化工，批號20121019），丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、SOD、還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（南京建成，批號20130226，20130215，20130218，20130228），GCLC 一 抗 （英 國 abcam，ad80841），GCLC上游引物序列：5′-TGG CCA CTA TCT GCC CAA TT-3′，下 游 引 物 序 列：5′-CCC CAG CGA CAA TCA ATG TC-3′，引物擴增片段長度213bp；β-actin上游引物序列：5′-TCC TCC TGA GCG CAA GTA CTC T-3′，下游引物序列：5′-GCT CAG TAA CAG TCC GCC TAG AA-3′，引物擴增片段長度1 536bp，均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.4 主要儀器 752紫外分光光度計（上海菁華科技），核酸定量儀（美國Amersham Biosciences），核酸擴增實時熒光檢測系統(tǒng)（DA7600型，中山大學達安基因），Gel Doc EQ凝膠成像儀（美國Bio-Rad），顯微圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將大鼠分為5組，即空白組、模型組、藍莓汁低劑量預防組（藍低組）、藍莓汁高劑量預防組（藍高組）、聯(lián)苯雙酯預防組（聯(lián)苯雙酯組），每組10只。藍低組、藍高組及聯(lián)苯雙酯組大鼠按文獻[7-8]分別予10.0、20.0g／kg及0.15g／kg劑量灌胃，1次／天，連續(xù)7d，模型組和空白組灌胃等容量0.9%氯化鈉溶液。末次給藥后1h，參照文獻[7]的方法，除空白組外，其余4組大鼠分別腹腔注射20%CCl4花生油溶液5mL／kg，空白組大鼠腹腔注射等容量0.9%氯化鈉溶液。全部大鼠禁食，自由飲水，間隔24h后，采用腹股溝動脈采血，常規(guī)制備血清，全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性。大鼠麻醉后處死，制備肝組織勻漿，嚴格按試劑盒操作測定各組大鼠肝勻漿MDA、CAT、SOD、GSH水平。

1.2.2 肝臟組織形態(tài)學觀察 取相同部位肝臟用4%甲醛固定，石蠟包埋，切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝臟病理變化。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測GCLC基因轉(zhuǎn)錄水平 采用Trizol-酚-氯仿一步法提取總RNA并純化，測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行RT-PCR。實驗過程中以β-actin作內(nèi)對照，進行標準化轉(zhuǎn)換得到各樣本的拷貝數(shù)（Ct值）。以Ct值的均數(shù)來反映目的基因的表達。

1.2.4 免疫組織化學法檢測GCLC蛋白的表達 采用EnVision二步法，光鏡下觀察。結(jié)果判定：肝細胞胞質(zhì)染成棕黃色為陽性。每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），計數(shù)100個細胞中的陽性細胞百分比。

1.2.5 Western Blot檢測GCLC蛋白的表達 提取蛋白并測定蛋白含量，取蛋白質(zhì)樣品40μg，10%十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電脈（SDS-PAGE）電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用 GCLC抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶3 000）室溫1h，ECL曝光顯影，Gel Doc EQ凝膠成像儀掃描，Quantity One軟件分析結(jié)果。以β-actin表達水平作為內(nèi)參照，目標蛋白的表達量以目標蛋白與內(nèi)參照蛋白灰度值的相對比值表示。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，方差齊的情況采用LSD法，方差不齊的情況采用Tamhane法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學觀察 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射性排列，肝細胞無變性、壞死，匯管區(qū)無炎性細胞浸潤。模型組大鼠肝細胞彌漫性水腫及脂肪變性，中央靜脈周圍肝細胞大片狀壞死，炎性細胞浸潤。藍低組和模型組相比，壞死區(qū)域小，但肝細胞仍部分腫大。藍高組、聯(lián)苯雙酯組肝組織結(jié)構(gòu)正常，可見肝細胞水腫，但水腫的程度較模型組明顯減輕，未見氣球樣變，肝細胞壞死程度也明顯減輕，大部分病例肝細胞未見壞死，僅少部分病例可見肝細胞點狀壞死（P＜0.05），見圖1。

圖1 藍莓對CCl4所致急性肝損傷大鼠肝組織病理形態(tài)的影響（HE染色，×400）

2.2 各組大鼠血清ALT、AST活性比較 模型組ALT、AST顯著高于空白組（P＜0.01），藍低組、藍高組及聯(lián)苯雙酯組ALT、AST均顯著低于模型組（P＜0.01），藍高組及聯(lián)苯雙酯組均顯著低于藍低組（P＜0.01），F(xiàn)值分別 1 185.158、641.771，見表1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST活性比較（±s）

表1 各組大鼠血清ALT、AST活性比較（±s）

a：P＜0.01，與空白組比較；b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與藍低組比較。

組別 n ALT（U／L） AST（U／L）空白組10 40.01±3.84 80.79±5.67模型組 10 391.86±11.97a 299.14±10.23a藍低組 10 275.63±17.64ab 240.38±11.80abc藍高組 10 193.94±6.55abc 178.90±8.11abc聯(lián)苯雙酯組 10 187.41±11.32abc 182.01±11.43abc

2.3 各組大鼠肝勻漿中 MDA、CAT、SOD、GSH水平比較模型組 MDA顯著高于空白組（P＜0.01），藍低組、藍高組及聯(lián)苯雙酯組MDA均顯著低于模型組（P＜0.01），藍高組及聯(lián)苯雙酯組 MDA均顯著低于藍低組（F＝231.700，P＜0.01）；模型組CAT、SOD、GSH均顯著低于空白組（P＜0.01），藍低、藍高組及聯(lián)苯雙酯組CAT、SOD、GSH均顯著高于模型組（P＜0.01），藍高組及聯(lián)苯雙酯組CAT、SOD、GSH 均顯著高于藍低組（P＜0.01），F(xiàn)值分別為117.781、576.582、725.135，見表2。

2.4 各組大鼠肝組織GCLC mRNA和蛋白表達水平的比較模型組GCLC mRNA和蛋白質(zhì)表達水平均高于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），藍低組、藍高組及聯(lián)苯雙酯組均顯著高于模型組（P＜0.01），藍高組及聯(lián)苯雙酯組均顯著高于藍低組（P＜0.01），F(xiàn)值分別為257.112、138.666、823.471，見表3、圖2。

表2 各組大鼠肝勻漿中MDA、CAT、SOD、GSH水平比較（±s）

表2 各組大鼠肝勻漿中MDA、CAT、SOD、GSH水平比較（±s）

a：P＜0.01，與空白組比較；b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與藍低組比較。

組別 n MDA（nmol／mg） CAT（U／g） SOD（U／g） GSH（mg／g）空白組 10 0.70±0.03 360.47±11.77 618.02±16.97 2.59±0.07模型組 10 1.46±0.05a 197.42±23.52a110.35±19.67a0.81±0.05a藍低組 10 1.23±0.07ab 254.02±11.97ab 386.47±22.73ab 1.35±0.09ab藍高組 10 1.06±0.06abc 295.04±17.04abc 439.77±25.33abc 1.90±0.07abc聯(lián)苯雙酯組 10 1.03±0.05abc 287.94±17.38abc 447.16±26.37abc 1.87±0.07abc

表3 各組大鼠肝組織GCLC mRNA和蛋白質(zhì)表達（±s）

表3 各組大鼠肝組織GCLC mRNA和蛋白質(zhì)表達（±s）

a：P＜0.01，與空白組比較；b：P＜0.01，與模型組比較；c：P＜0.01，與藍低組比較。

組別 n mRNA相對表達量蛋白相對表達量空白組蛋白陽性表達率（%）10 90.70±5.83 24.17±2.88 0.73±0.03模型組 10 95.26±3.62 26.91±2.95 0.78±0.04藍低組 10 124.99±5.66ab 42.20±4.07ab 1.12±0.08ab藍高組 10 142.81±4.79abc 48.47±3.16abc 1.79±0.07abc聯(lián)苯雙酯組 10 146.58±4.61abc 50.13±2.58abc 1.85±0.05abc

圖2 免疫組織化學法與Western blot檢測各組大鼠肝組織GCLC蛋白的表達（DAB，×400）

3 討 論

藍莓是一種小漿果類藍色水果，因其富含營養(yǎng)和藥用保健成分，被譽為“黃金漿果”，并被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）列為全球五大健康食品之一。藍莓果實除了富含葉酸、花青甙、類黃酮、果糖及維生素A、C、E外，還含有多種抗氧化劑，其SOD含量超過其他果品數(shù)倍，這些化合物與人體清除自由基、增強夜間視力、抗癌等密切相關(guān)[9-10]。Wang等[11-13]研究發(fā)現(xiàn)，藍莓可激活小鼠肝臟核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子2（Nrf2）、血色素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶（NqO1）和金屬硫蛋白（MT）的表達，減輕CCl4所致大鼠急性肝損傷以及肝纖維化。

CCl4所致的急性肝損傷模型是最常用的經(jīng)典模型之一，其所致肝損傷是典型的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)[14]。氧化應(yīng)激時，體內(nèi)氧自由基大量增多，CAT、SOD、GSH等抗氧化物質(zhì)大量耗竭，從而引起肝臟疾病[15]。MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可嚴重破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，導致細胞膜腫脹壞死，其血清及組織中的含量反映了組織過氧化損傷的程度和細胞受損程度[16]。GSH主要在肝臟合成，是細胞內(nèi)主要的還原劑，能夠清除體內(nèi)的超氧離子和自由基，保護細胞膜的完整性，是肝臟抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[17]。GSH的生物合成是在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、GSH合成酶催化下將底物谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸按順序合成。γ-GCS是由Nrf2和抗氧化反應(yīng)元件（ARE）調(diào)控的Ⅱ相酶，是合成GSH的限速酶，該酶由催化亞基GCLC和調(diào)節(jié)亞基GCLM組成，其中GCLC含有γ-GCS所有底物的結(jié)合位點和催化功能，在GSH的合成中起決定性作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞內(nèi)GCLC的缺失會導致肝細胞脂肪變性和肝衰竭[19]，小劑量蛋白酶抑制劑可上調(diào)GSH合成酶及GCLC的表達以治療大鼠酒精性肝病[20]?？梢?，GCLC在緩解多種病因?qū)е碌难趸瘧?yīng)激性肝損傷方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

本實驗采用CCl4腹腔注射復制大鼠急性肝損傷模型，檢測GCLC在急性肝損傷大鼠肝臟的表達情況，并觀察藍莓對急性肝損傷大鼠肝組織GCLC的影響，探討藍莓對CCl4所致大鼠急性肝損傷的干預效果及可能機制。

結(jié)果表明，模型組大鼠肝勻漿GSH顯著低于空白組，而肝組織GCLC表達較空白組雖有所升高，但差異并無統(tǒng)計學意義，提示在大鼠急性肝損傷進程中，GSH大量消耗，而誘導GSH合成的限速酶γ-GCS的催化亞基GCLC反饋性上調(diào)不足，致使GSH的合成進一步減少，機體抗氧化防御功能減弱，可能是CCl4誘導大鼠急性肝損傷的發(fā)病機制之一。

對藍莓汁預防組大鼠的檢測發(fā)現(xiàn)，血清ALT、AST、肝勻漿MDA顯著低于模型組，肝勻漿CAT、SOD、GSH顯著高于模型組，病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)其肝細胞變性及壞死程度顯著減輕，藍高組與聯(lián)苯雙酯組相當。表明藍莓可改善肝功能，減輕氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化所致的肝損傷程度，對CCl4誘導的大鼠急性肝損傷具有一定預防作用。對大鼠肝組織GCLC的檢測發(fā)現(xiàn)，藍莓汁預防組GCLC mRNA及蛋白表達顯著高于模型組，同時，上述指標在藍低組、藍高組之間也存在顯著差異，提示兩組間存在量效關(guān)系。本研究推測，藍莓預防CCl4誘導的大鼠急性肝損傷的機制，可能與上調(diào)GCLC表達，刺激抗氧化因子GSH的合成，進而對抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

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