IL-1β誘導支氣管上皮細胞高遷移率族蛋白1主動釋放＊

譚小玉，侯長春，陳俊健，黎 雨，劉唐娟，周鴻江

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院西院呼吸內(nèi)科，南寧530007）

慢性氣道炎癥是支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等慢性氣道疾病的核心病理生理學改變，IL-1β是已發(fā)現(xiàn)的啟動和維持炎癥最主要的因子之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β在哮喘患者的肺泡灌洗液和肺活檢標本中顯著增高，支氣管上皮細胞是主要來源[2]，但IL-1參與氣道炎癥機制未完全明了。氣道上皮細胞在氣道及肺部固有免疫和獲得性免疫過程中扮演著重要角色，研究表明氣道上皮細胞可通過釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（TSLP）等炎癥因子參與哮喘、COPD等慢性氣道疾病炎癥過程[3]。高遷移率族蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB1）在內(nèi)毒素血癥作為晚期炎癥介質(zhì)發(fā)揮促炎作用，眾多研究也表明HMGB1參與多種局部性和全身性炎癥性疾病的炎癥過程[4-5]。有研究證明，HMGB1在哮喘和COPD患者誘導痰、肺活檢標本中顯著增加，與肺功能嚴重程度呈顯著正相關(guān)，表明HMGB1是參與慢性氣道炎癥發(fā)生、發(fā)展一種重要炎癥介質(zhì)[6-7]。本研究探討IL-1β能否誘導支氣管上皮細胞的HMGB1表達和釋放，以增加對IL-1β參與慢性氣道疾病發(fā)病機制的理解，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選用 健康人支氣管上皮細胞（HBE）135-E6E7（美國ATCC，CRL-2741TM）；胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德公司）；Human HMGB1ELISA kit（ground biotechnology diagnosticate，USA）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng) HBE135-E6E7 用含10%胎牛血清，100U／mL青霉素，100μg／mL的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，80%～90%融合后，2～3d傳一代。HBE細胞胰酶消化后，按2.5×104個／cm2的密度傳至6孔板、24孔板、96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，細胞刺激前24h換成角質(zhì)化無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別加入不同濃度IL-1β。

1.2.2 四唑鹽（MTT）比色法檢測細胞活力 傳至96孔板的HBE，加入0.1、1.0、10.0ng／mL不同濃度的IL-1β，同時以未加任何處理因素的HBE作為對照組，每個濃度設(shè)8個復孔。培養(yǎng)24h后，每孔加入濃度為5mg／mL的20μL MTT，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，棄培養(yǎng)液，加入150μL二甲基亞砜（DMSO）振蕩儀振蕩至晶體顆粒溶解，在酶標儀上測定490nm的吸光度值（A值），細胞活力＝（加IL-1β組A值-不加細胞組A值）／（不加IL-1β對照組A值-不加細胞組A值）×100%。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-PCR） 采用異硫氰酸胍法提取總RNA。將IL-1β處理或?qū)φ盏腍BE（6孔板）加入TRIzol（invitrogen）1mL吹勻，然后經(jīng)過氯仿萃取，異丙醇沉淀，70%乙醇沖洗沉淀后，以焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。用分光光度計測量RNA濃度，以1μg總RNA為底物，加入20μL RT反應(yīng)體系中進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（按format；thermo scientific說明書進行），-20℃凍存?zhèn)溆?。Real-time PCR反應(yīng)中所用的引物：HMGB1引物：上游：5′-TGT CCA CAC ACC CTG CAT ATT G-3′，下 游：5′-AAT CCC ATG GTG TGA CAG AAT GGA-3′，序列長度為446bp；β-actin：上游5′-AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT-3′和下游5′-TAC ATG GCT GGG GTG TTG AA-3′，序列長度為324bp。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃變性5min，95℃15s，60℃45s，72℃30s，共40個循環(huán)。采用SYBR Premix EX Taq（Takana）熒光，整個RT-PCR過程在ABI 7900熒光定量PCR儀上完成，熒光信號使用SDS軟件分析。每組實驗重復3次。

1.2.4 免疫蛋白印跡檢測IL-1β刺激HBE總蛋白、胞核、胞漿HMGB1表達 按胞質(zhì)和胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德公司）說明書步驟提取胞質(zhì)胞核蛋白，簡述如下：收集處理后的細胞，加入100μL預冷的緩沖液A[10mmol／L 4-羥乙基哌嗉乙磺酸（HEPES），pH 7.9；10mmol／L KCl；0.1mmol／L EDTA；0.1mmol／L 乙 二 酸 醇 雙 （2-氨 基 乙 基 醚 ）四 乙 醉（EGTA）；1mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）；0.5mmol／L 苯甲基磺酰氟（PMSF）]劇烈震蕩30s后，冰上靜置15min破壞細胞膜，2 000×g離心10min，上清液部分即為胞質(zhì)蛋白，沉淀，加入15μL預冷的緩沖液 B （20mmol／L HEPES，pH 7.9；0.4 mol／L NaCl；1mmol／L EDTA；1mmol／L EGTA；1mmol／L DTT；1mmol／L PMSF）冰上靜置30min，每隔5min劇烈振蕩1次，破壞核膜，4℃下15 000×g離心5min，上清液含核蛋白組分。BCA法蛋白質(zhì)定量置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?jīng)10%十二烷基-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離1.5h、轉(zhuǎn)膜1.5h到硝酸纖維素膜（Pall公司）和5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，依次加入兔抗HMGB1，β-actin單克隆抗體（Abcam 1∶1 000）1%TBST 4℃過夜、辣根過氧化酶耦聯(lián)的兔抗羊 （中衫金橋，1∶6 000），ECL化學發(fā)光法顯影，Quantity One凝膠成像系統(tǒng)觀察分析條帶灰度值。

1.2.5 雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)基中HMGB1 嚴格按照Human HMGB1ELISA Kit的說明書操作。將50μL標準品和上清液加入抗體包被的96孔板內(nèi)，在上清液樣本孔中分別加入50μL酶標記溶液后充分混勻；置于溫箱內(nèi)37℃孵育60min；用1×PBS手工洗板清洗5次；每孔各加50μL反應(yīng)液A和B；蓋起微孔板37℃孵育15min，每孔加50μL終止液終止反應(yīng)，30min后用酶標儀測定每孔的吸光度值（450nm），依據(jù)標準曲線計算上清液樣本蛋白濃度。實驗重復3次。

1.2.6 免疫熒光觀察IL-1β刺激后對HBE HMGB1的移位的影響 在支氣管上皮細胞爬片后，4%多聚甲醛固定15min，0.1%Triton-100處理10min，每片滴50μL 5%BSA封閉，37℃，30min；滴加 HMGB1一抗（1∶100稀釋）37℃，90min，PBS沖洗3次；避光滴加熒光二抗，37℃，60min，PBS沖洗；50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、照相。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用SNK法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT比色法檢測不同濃度IL-1β對細胞活力的影響分別用0、0.1、1.0、10.0ng／mL濃度IL-1β刺激 HBE 24h，各組細胞活力分別為100.0%、95.6%、100.3%、105.2%（圖1）。與對照組比較，各濃度的IL-1β對HBE活力影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 不同濃度IL-1β對HBE細胞活力影響（n＝8）

圖2 IL-1β上調(diào)了HBE的HMGB1的mRNA表達水平

2.2 IL-1β對支氣管上皮細胞HMGB1mRNA和蛋白表達影響 支氣管上皮細胞組成性表達HMGB1，對照組HBE的HMGB1mRNA表達水平在18h最高（圖2）。IL-1β以濃度和時間依賴方式增加了HBE的HMGB1mRNA表達水平，最顯著的差異性發(fā)生在IL-1β10ng／mL刺激HBE 18h時，約為對照組2.5倍（2.78±0.08vs.1.35±0.04）。IL-1β0.1ng／mL只是在18h輕度增加了 HMGB1mRNA表達。IL-1β1.0、10.0ng／mL刺激HBE 24h，HBE的 HMGB1蛋白表達水平升高，IL-1β10ng／mL更明顯，見圖3。

圖3 IL-1β上調(diào)了HBE的HMGB1的蛋白表達水平

圖4 ELISA檢測不同劑量IL-1β對HBE釋放HMGB1的影響

2.3 IL-1β對支氣管上皮細胞 HMGB1釋放的影響 0、0.1、1.0、10.0ng／mL IL-1β刺激 HBE 24h后上清液 HMGB1蛋白含量分別為（9.77±1.03）ng／mL及（18.90±1.34）ng／mL，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)對照組和0.1ng／mL IL-1β刺激組細胞上清液HMGB1含量低于試劑盒檢測下限。1.0ng／mL和10.0ng／mL IL-1β刺激HBE 24h后HMGB1蛋白含量明顯增加，10.0 ng／mL IL-1β更加顯著（P＜0.05），IL-1β對 HBE HMGB1的釋放有劑量依賴性（圖4）。本研究也觀察了IL-1β影響HMGB1分泌釋放有時間依賴性，10.0ng／mL IL-1β刺激HBE 0、6、12h及24h后上清液中HMGB1蛋白含量分別為（11.60±0.83）ng／mL、（19.80±0.89）ng／mL，統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)：10.0ng／mL IL-1β刺激支氣管上皮細胞6h后，細胞上清液中HMGB1含量無變化，而當刺激時間延長至12h和24 h，上清液中HMGB1含量明顯增加（P＜0.05），見圖5。

圖5 在不同時間點IL-1β（10.0ng／mL）對 HBE細胞培養(yǎng)上清液HMGB1水平的影響

2.4 IL-1β對HBE胞質(zhì)和胞核HMGB1含量影響 通過蛋白免疫印跡方法檢測發(fā)現(xiàn)IL-1β（10.0ng／mL）刺激 HBE 24h后，發(fā)現(xiàn)胞核蛋白有減少，而細胞胞質(zhì)蛋白相應(yīng)明顯增加，這進一步印證了IL-1β誘導了HBE的HMGB1的釋放（圖6）。免疫熒光發(fā)現(xiàn)HMGB1高豐度表達于未受刺激HBE的細胞核，少量表達于細胞質(zhì)，免疫熒光進一步證實IL-1β刺激HBE，HMGB1從胞核中轉(zhuǎn)位出來，見圖7。

圖6 IL-1β（10.0ng／mL）對 HBE細胞質(zhì)和細胞核HMGB1表達的影響

圖7 免疫熒光觀察IL-1β對HBE HMGB1表達及移位的影響

3 討 論

HMGB1在非應(yīng)激狀態(tài)下主要定位細胞核內(nèi)，在細胞因子、損傷等應(yīng)激狀態(tài)下，HMGB1可以被主動釋放到胞外，發(fā)揮其胞外促炎癥等效應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)H2O2可以誘導支氣管上皮細胞HMGB1的主動釋放[8]。本研究在體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以濃度和時間依賴性地增加支氣管上皮細胞HMGB1表達，并促進HMGB1從胞核向胞漿轉(zhuǎn)位和主動釋放到胞外。

研究證明IL-1β是啟動和維持機體內(nèi)炎性反應(yīng)最重要的細胞因子之一[1]，是一種典型的多功能細胞因子。IL-1β可以促進單核細胞、中性粒細胞等多種免疫細胞和組織細胞炎癥因子釋放，亦可以促進骨髓修復，有利于癌癥治療。IL-1β在穩(wěn)定期COPD患者中產(chǎn)生增多，在COPD急性加重期進一步升高[9]，IL-1β在哮喘患者支氣管上皮細胞、巨噬細胞和肺泡灌洗液中表達也增加[2]。Lappalainen等[10]通過IL-1β轉(zhuǎn)基因動物模型證明高表達IL-1β可以引起肺泡間隔擴大、氣管壁增厚、黏液分泌增加、肺間質(zhì)纖維化等，這些符合支氣管哮喘和COPD病理學改變。初步揭示IL-1β誘導肺部這些病變與增加中性粒細胞趨化因子CXCL1、CXCL2和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9和MMP-12）有關(guān)，但是否存在其他機制尚不明確。

HMGB1是細胞核內(nèi)非組蛋白染色質(zhì)蛋白，核內(nèi)主要參與穩(wěn)定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能并協(xié)調(diào)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。HMGB1作為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）分子通過釋放到胞外發(fā)揮促炎癥作用成為近年來該分子研究的熱點[11]。單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞在各種外界刺激因素或應(yīng)激下HMGB1可以從細胞中釋放出來，促進炎性反應(yīng)。在膿毒血癥和關(guān)節(jié)炎等炎癥過程中，HMGB1可以通過募集中性粒細胞，促進內(nèi)皮細胞表達黏附分子，促進樹突狀細胞成熟等途徑參與促炎反應(yīng)[11]。

HMGB1在真核生物細胞核中廣泛高豐度表達，在肺部HMGB1被發(fā)現(xiàn)主要高表達于支氣管上皮細胞和肺泡巨噬細胞[12]，OVA致敏哮喘小鼠模型進一步被證實HMGB1主要定位于支氣管上皮細胞[13]。這些結(jié)果高度提示支氣管上皮細胞是肺部HMGB1主要來源，這也是本研究選擇支氣管上皮細胞作為研究靶點的主要原因。本研究首先通過MTT法證實實驗選用濃度的IL-1β對支氣管上皮細胞無毒性，而且IL-1β的劑量也接近于體內(nèi)生理量和哮喘、COPD患者肺內(nèi)表達量。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β不僅能誘導HMGB1表達，還可促進HMGB1的轉(zhuǎn)位和主動釋放，進一步驗證了氣道上皮細胞是作為DAMPs分子HMGB1的重要來源。本研究發(fā)現(xiàn)的IL-1β促進HMGB1的主動釋放類似于既往的研究，均具有一定時間和濃度依賴性[8]。更重要的是，大量的研究證實HMGB1在哮喘和COPD、慢性肺源性心臟病發(fā)病中起作用，因而被誘導釋放HMGB1可能是IL-β介導慢性氣道炎癥的新機制之一[6-8，13-15]。IL-β不僅可以通過增加 CXCL1、CXCL2和基質(zhì)金屬蛋白酶來加劇氣道炎癥，通過誘導釋放HMGB1也可能是另一條重要途徑。

目前氣道上皮細胞HMGB1釋放的機制涉及相關(guān)的信號通路的活化尚不清楚，而釋放到局部氣道腔能否與IL-1β形成復合物也是值得探討的問題，因為HMGB1-IL-1β復合物促炎癥功能遠大于單一的HMGB1或IL-1β。這些是本研究課題組接下來探討的方向，將進一步研究。

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