地中海擬無(wú)枝酸菌“硝酸鹽效應(yīng)”的研究進(jìn)展

邵志會(huì)，趙維，王穎，丁曉明，王金，姜衛(wèi)紅，趙國(guó)屏,

利福霉素是安莎類抗生素 (Ansamycins)的一個(gè)亞群，臨床上廣泛地用于治療由分枝桿菌 Mycobacterium、肺炎球菌 Pneumococcus及其他革蘭氏陽(yáng)性菌引起的各種感染[1-5]。利福霉素可以特異性地抑制依賴于DNA的RNA聚合酶的活性，使病原菌不能正常合成RNA產(chǎn)物，從而達(dá)到抑菌目的。地中海擬無(wú)枝酸菌Amycolatopsis mediterranei是工業(yè)上用來(lái)生產(chǎn)利福霉素的稀有放線菌。該菌在1957年首次從地中海沿岸的法國(guó)Saint Raphael附近土樣中被分離出來(lái)，被命名為地中海鏈霉菌Streptomyces mediterranei[6]，后來(lái)又被Thiemann等重新鑒定為地中海諾卡氏菌Nocardia mediterranei[7]。直到20世紀(jì)80年代中期，Lechevalier等根據(jù)其細(xì)胞壁的組成缺乏分支酸以及對(duì)諾卡氏菌屬Nocardia和紅球菌屬 Rhodococcus的噬菌體不敏感等特征最終將其歸到一個(gè)新的屬，擬無(wú)枝酸菌屬Amycolatopsis[8]。最初地中海擬無(wú)枝酸菌的發(fā)酵液分離到了利福霉素 A、B、C、D、E五個(gè)組分，其中最主要是 B組分[6]；后來(lái)人們又從不同的生產(chǎn)菌種中分離到了S、O以及SV等組分[9]。這些組分中活性最高的是利福霉素SV；而利福霉素B雖然活性較小但其產(chǎn)量高，而且可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其他組分，如S、O以及SV等[10-11]。目前，工廠中主要生產(chǎn)利福霉素B或SV，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)修飾來(lái)獲得利福平、利福噴丁等利福霉素衍生藥物。

1 “硝酸鹽效應(yīng)”的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì) 70年代末，焦瑞身先生等從上海第三制藥廠處獲得一株高產(chǎn)利福霉素 SV的菌株——地中海擬無(wú)枝酸菌 U32。通過(guò)傳統(tǒng)的育種手段 (如紫外及亞硝基胍 (NTG) 誘變) 多輪篩選后，獲得一株產(chǎn)量更高的菌株NG12-4 (注：按照當(dāng)時(shí)的分類標(biāo)準(zhǔn)，U32及 NG12-4最初被稱為地中海諾卡氏菌)。由于硝酸鹽促進(jìn)抗生素的合成是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象，上海第三制藥廠的張永昌等發(fā)現(xiàn)在工業(yè)發(fā)酵利福霉素 SV的過(guò)程添加硝酸鉀能夠提高其產(chǎn)量[12]。焦瑞身等進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定在發(fā)酵起始添加終濃度為 0.8%(80 mmol/L) 的硝酸鉀能使地中海擬無(wú)枝酸菌NG12-4利福霉素SV的產(chǎn)量提高170%。為了確定究竟是硝酸根離子還是鉀離子的影響，早期的研究人員設(shè)計(jì)了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照實(shí)驗(yàn)，證明了雖然培養(yǎng)基中的鉀離子對(duì)利福霉素的合成也有部分促進(jìn)作用，但硝酸根離子是促進(jìn)利福霉素 SV高產(chǎn)的主要因素[13]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)硝酸鹽不僅能夠明顯地改變菌體的生理代謝，如引起硝酸還原酶、異檸檬酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶等多個(gè)酶的活力發(fā)生變化；而且還影響了菌體內(nèi)的脂肪酸含量：不添加 KNO3的菌體內(nèi)脂肪酸為 13.6%；而添加硝酸鹽后，菌體的脂肪酸含量則降到5.7% (圖1)。

圖 1 有無(wú)硝酸鹽培養(yǎng)條件下地中海擬無(wú)枝酸菌 U32菌體電鏡下的形態(tài) (本圖引自文獻(xiàn)[5])Fig. 1 Mycelium morphology of A. mediterranei U32 under electron microscope in the condition with or without nitrate (cited from reference [5]).

2 “硝酸鹽效應(yīng)”分子機(jī)制的初步研究

2.1 利福霉素生物合成途徑的鑒定

1973年P(guān)relog等確定了利福霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該類化合物為29個(gè)碳原子的大環(huán)內(nèi)酰胺，其立體脂肪鏈橋跨接平面芳香核的結(jié)構(gòu)形成了典型的提桶狀結(jié)構(gòu)，并將具有這種大環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素稱為安莎霉素[17]。此后，許多科研人員對(duì)利福霉素的生物合成途徑進(jìn)行了探索：White等曾用同位素標(biāo)記的丙酸和乙酸闡明了利福霉素大環(huán)部分的來(lái)源問(wèn)題[18]；焦瑞身等在20世紀(jì)70年代末通過(guò)誘變方法篩選到利福霉素的非活性突變株，并進(jìn)行一系列的生化互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，從而為進(jìn)一步闡明利福霉素SV的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)[19-20]。通過(guò)菌體洗滌實(shí)驗(yàn)，焦瑞身等發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺促進(jìn)利福霉素 SV合成的作用遠(yuǎn)比谷氨酸顯著，而且這一促進(jìn)作用不受GS專一性抑制劑重氮基-5-氧-L-正亮氨酸(DON) 的抑制，而谷氨酸和天冬酰胺對(duì)利福霉素SV的促進(jìn)作用則受到DON的抑制。在分別利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的谷氨酰氨-CO15NH2與谷氨酸-15NH2摻入到利福霉素SV并進(jìn)行終產(chǎn)物比較實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，前者是利福霉素合成更直接的前體，它促進(jìn)了利福霉素芳香前體 (AHBA) 的合成[21]。根據(jù)以上結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室提出了利福霉素分子中的氮原子來(lái)源于谷氨酰胺。此后，通過(guò)穩(wěn)定性15N標(biāo)記的硝酸鉀摻入實(shí)驗(yàn)證明利福霉素中的氮原子是來(lái)源于硝酸鉀，并經(jīng)谷氨酰胺最終摻入利福霉素中[22]，這也是第一次明確了利福霉素合成中氮原子的摻入途徑。

關(guān)于利福霉素合成的芳香環(huán)碳骨架部分的來(lái)源，最初 Ghisaba等認(rèn)為其主要來(lái)自于莽草酸途徑[23]。Guo等在2002年又對(duì)A. mediterranei S699利福霉素B的生物合成途徑進(jìn)行了修正，他們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多糖合成的前提物 UDP-葡萄糖和谷氨酰胺經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)可以得到亞氨基-4-磷酸-赤蘚糖 (Imino E-4-P)。在此基礎(chǔ)上，磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 和亞氨基-4-磷酸-赤蘚糖可以進(jìn)一步合成得到 5-脫氧-5-氨基-3-脫氫莽草酸(Amino DHS)，后者在3-氨基5-羥基苯甲酸合成酶作用下轉(zhuǎn)化為3-氨基5-羥基苯甲酸 (AHBA)[24]。AHBA合成酶 (ahbas) 是合成前體AHBA (又稱C7N母核) 的關(guān)鍵酶。黃健強(qiáng)等利用來(lái)源于利福霉素B產(chǎn)生菌A. mediterranei S699的ahbas基因作為探針從U32基因組文庫(kù)中篩選到了ahbas基因 (rifK，AMED_0627)；中斷了該基因的突變菌株基本不產(chǎn)生利福霉素，證明了AHBA是利福霉素生物合成過(guò)程中必不可少的前體[25]。

在利福霉素生物合成途徑方面，1998年Floss和Hutchinson研究組率先從地中海擬無(wú)枝酸菌S699中克隆、測(cè)序了利福霉素B的生物合成基因簇，并在實(shí)驗(yàn)及前期文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上，對(duì)利福霉素B的合成途徑進(jìn)行了詳細(xì)描述[26]。2010年，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)A. mediterranei U32進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定和注釋，進(jìn)一步明確了利福霉素 SV生物合成及前體供給的途徑 (圖2)[27]。U32的染色體大約為10.2 Mb，環(huán)形，含有9 228個(gè)基因以及 52個(gè)tRNA。通過(guò)全基因組序列分析并結(jié)合以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果研究定位了與利福霉素SV生物合成及前體供給相關(guān)的大多數(shù)基因，并鑒定了從利福霉素 SV到 B的關(guān)鍵 P450酶(AMED_0653，Rif16)[27]。

2.2 “硝酸鹽效應(yīng)”機(jī)制的解析

通過(guò)對(duì)利福霉素生物合成過(guò)程中關(guān)鍵酶的活力測(cè)定和相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析，我們提出硝酸鹽通過(guò)促進(jìn)利福霉素生物合成前體的供給和生物合成酶系的表達(dá)來(lái)提高菌體利福霉素的產(chǎn)量的假說(shuō)。

2.2.1 利福霉素前體

利福霉素的前體主要包括 AHBA (碳骨架和氮原子) 和二碳/三碳延伸單位 (圖2)。

1) 碳骨架合成：UDP-葡萄糖是 AHBA 合成的重要底物[24]。U32基因組的工作對(duì)催化從1-P-葡萄糖合成 UDP-葡萄糖的編碼基因 galU(AMED_8311) 進(jìn)行了注釋[27]。最近通過(guò)RNA-seq實(shí)驗(yàn)，我們對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄水平也進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)硝酸鹽能夠促進(jìn)galU的轉(zhuǎn)錄上調(diào)近7倍左右 (Manuscript under revision)，UDP-葡萄糖和谷氨酰胺經(jīng)多步反應(yīng)可得到利福霉素合成的中間前體AHBA[28]。

2) 氮原子摻入：雖然利福霉素中的氮原子來(lái)源于谷氨酰胺，但是焦瑞身等早期通過(guò)菌體洗滌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白胨等氮源不能代替硝酸鹽來(lái)提高利福霉素產(chǎn)量，因此，硝酸鹽的作用并不僅僅作為氮源被菌體利用[13]。在添加蛋白質(zhì)合成抑制劑——氯霉素的培養(yǎng)條件下，硝酸鹽便不能促進(jìn)利福霉素的合成[29]，這說(shuō)明氯霉素抑制了硝酸鹽所誘導(dǎo)的酶系的合成，并進(jìn)而抑制了“硝酸鹽效應(yīng)”?？偨Y(jié)下來(lái)，我們認(rèn)為硝酸鹽一方面作為氮源提供利福霉素生物合成中所需的氮原子；同時(shí)，也通過(guò)某種途徑誘導(dǎo)一系列關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控，從而協(xié)同調(diào)控初級(jí)、次級(jí)代謝，最終促進(jìn)利福霉素產(chǎn)量的提高。

硝酸鹽還原酶是硝酸鹽作為氮源利用的關(guān)鍵酶，催化硝酸鹽同化的第一步反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，利福霉素高產(chǎn)和低產(chǎn)菌株的硝酸還原酶活力存在差異；而且在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上，低產(chǎn)菌株生長(zhǎng)較差。這表明硝酸同化酶與利福霉素產(chǎn)量之間可能存在一定的相關(guān)性[30]。通過(guò)對(duì)硝酸還原酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)A. mediterranei U32的硝酸還原酶同其他同化型硝酸還原酶相似，而且其合成受銨鹽的阻遏，受硝酸鹽的誘導(dǎo)[31]。隨后，通過(guò)對(duì)U32的硝酸鹽同化基因簇 (Nitrate assimilatory cluster, nas)進(jìn)行克隆和鑒定，發(fā)現(xiàn)其由nasACKBDE等6個(gè)基因組成，其中nasAC編碼硝酸還原酶，nasK編碼亞硝酸鹽排出蛋白，而nasBDE則編碼亞硝酸還原酶[32]。U32中U32唯一的同化型硝酸鹽還原酶是NasA，其敲除突變株在以硝酸鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；同時(shí)，也失去了“硝酸鹽效應(yīng)”，說(shuō)明硝酸鹽同化在“硝酸鹽效應(yīng)”中起著至關(guān)重要的作用，并為利福霉素生物合成提供唯一的氮原子。另一方面，硝酸鹽仍然能夠激活突變株中利福霉素合成基因簇及其他受硝酸鹽誘導(dǎo)的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[32]，這也在一定程度上證明了我們前面提到了關(guān)于硝酸鹽作用機(jī)制的猜想，即硝酸鹽自身 (或其他相關(guān)中間代謝物) 可能扮演著信號(hào)分子的作用。

圖2 地中海擬無(wú)枝酸菌U32的利福霉素SV合成途徑 (本圖引自文獻(xiàn)[27])Fig. 2 RifamycinSV biosynthesis pathway of A. mediterraneiU32 (cited from reference [27]).

硝酸鹽在還原為氨之后，會(huì)被谷氨酰胺合成酶 (GS) 進(jìn)一步固定，生成谷氨酰胺，從而進(jìn)入氮代謝循環(huán)；同時(shí)，谷氨酰胺也能為利福霉素提供唯一的氮原子。在 U32中存在兩條氨同化途徑，即丙氨酸脫氫酶 (AlaDH) 和谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶 (GS/GOGAT) 途徑[33-34]。在硝酸鹽條件下，菌體主要采用GS/GOGAT途徑，并且 GS的酶活與利福霉素的產(chǎn)量之間存在正相關(guān)性 (圖3)；而AlaDH則與利福霉素的產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)性[34-35]。除硝酸鹽外，在其他氮源條件如以脯氨酸、硝酸鉀、丙氨酸、谷氨酸、尿素及谷氨酰胺為唯一氮源下，這種相關(guān)性仍然存在[35]。我們推測(cè)合理的解釋是：在高 GS活力情況下，菌體內(nèi)的谷氨酰胺(Gln) 濃度比較高，因此能夠保證利福霉素合成中氮原子的充分供給，從而導(dǎo)致利福霉素的產(chǎn)量較高。

圖3 不同氮源種類及濃度培養(yǎng)地中海擬無(wú)枝酸菌U32的GS活力和利福霉素的相關(guān)性 (本圖引自文獻(xiàn)[21])Fig. 3 Correlation between yield of rifamycin SV and specific activity of GS in A. mediterranei U32 cultivated in different sort and concentration of nitrogen sources (cited from reference [21]).

在U32中存在有6個(gè)GS編碼基因，但唯有 glnA (AMED_1229) 編碼有生物功能的GS[36]。U32的GS屬于GSI類，由12個(gè)亞基組成，其中每 6個(gè)亞基呈六角形排列，且兩個(gè)六角形結(jié)構(gòu)重疊排列。早期研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)的GS受到腺苷化修飾不同，U32中GS雖然含有保守的腺苷酰化調(diào)節(jié)區(qū)域，其不被腺苷化修飾調(diào)控，其活力調(diào)節(jié)機(jī)制主要發(fā)生在酶量水平上。其具體原因未知，推測(cè)U32在長(zhǎng)期的菌種誘變過(guò)程中發(fā)生突變，使腺苷酰化調(diào)節(jié)的通路受到影響[34,36-37]。最近的轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加硝酸鹽之后，U32中g(shù)lnA的轉(zhuǎn)錄上調(diào)13倍，而編碼AlaDH的基因ald (AMED_7939)[38]則下調(diào)41倍之多，與早期測(cè)得的酶活變化趨勢(shì)完全一致[28]。

3) AHBA的合成：UDP-葡萄糖和谷氨酰胺首先在 RifL和 RifK 的催化下合成UDP-Kanosamine，然后在RifM、RifN和RifH的催化下進(jìn)一步合成 AminoDAHP，最后在RifG、RifJ和RifK的催化下合成AHBA[24]。編碼這些酶類的基因全部集中在利福霉素生物合成基因簇中[27]。近期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作發(fā)現(xiàn)硝酸鹽能夠促進(jìn)基因簇中的大部分基因 (包括AHBA合成中涉及的基因) 在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都保持高表達(dá)；而沒(méi)有添加硝酸鹽的菌體中，該基因簇只在對(duì)數(shù)前期高表達(dá)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄水平急劇下降，這也與硝酸鹽促進(jìn)AHBA生物合成的結(jié)論一致[28]。

4) 二碳/三碳單位延伸：除了芳香部分的AHBA外，利福霉素的合成還由 3個(gè)乙酸和 8個(gè)丙酸分子分別通過(guò)丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA合成多聚酮，進(jìn)而合成環(huán)橋鏈[18]。焦瑞身等通過(guò)透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，添加硝酸鹽之后菌體內(nèi)脂肪堆積減少。定量分析菌體的脂肪酸成分發(fā)現(xiàn)，中性脂的總量變低，但其在組成成分上無(wú)顯著差異；而且在硝酸鹽存在下利福霉素SV產(chǎn)量的增加量幾乎相當(dāng)于脂肪含量的減少量[39]。由于利福霉素的環(huán)橋鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸合成共用前體丙二酰 CoA，我們推測(cè)硝酸鹽抑制了菌體脂肪酸的生物合成，并將用于合成脂肪的乙酰CoA轉(zhuǎn)向利福霉素SV的生物合成。該現(xiàn)象與我們目前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致，例如脂肪酸合成酶系 (FAS) 的基因 (fabD等) 在添加硝酸鹽后轉(zhuǎn)錄下調(diào)了3倍多[28]。

對(duì)于利福霉素合成的另外一個(gè)重要前體——(2R)-甲基丙二酰CoA，研究認(rèn)為U32中存在 3條合成途徑[40]，其關(guān)鍵酶分別為甲基丙二酰 CoA 轉(zhuǎn)羧酶、丙二酰 CoA羧化酶、甲基丙酰 CoA 變位酶 (MCM) 和甲基丙二酰 CoA消旋酶 (MCE)。通過(guò)對(duì)地中海擬無(wú)枝酸菌U32來(lái)源的甲基丙二酰CoA轉(zhuǎn)羧酶、甲基丙二酰CoA變位酶和消旋酶進(jìn)行純化和酶活測(cè)定，證明了它們的酶學(xué)性質(zhì)和其他生物來(lái)源的相似[41-42]。在 3條合成途徑中，通過(guò)分析各個(gè)酶活性的時(shí)間進(jìn)程和利福霉素合成時(shí)間的相關(guān)性，及各個(gè)酶的底物親合力，發(fā)現(xiàn)甲基丙二酰CoA變位酶途徑是主要負(fù)責(zé)酶系，該途徑催化從琥珀酰CoA生成 (2R)-甲基丙二酰 CoA[40]。盡管丙二酰羧化酶途徑不是前體 (2R)-甲基丙二酰 CoA供應(yīng)的主要途徑，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源添加10 mmol/L的丙酸鹽仍然能促進(jìn)地中海擬無(wú)枝酸菌U32的利福霉素SV產(chǎn)量提高30%[43]。

2.2.2 利福霉素生物合成基因簇

利福霉素合成基因簇上共含 43個(gè)基因(AMED_0613-AMED_0655)，是U32中最大的基因簇。其中，rifABCDE負(fù)責(zé)編碼PKS模塊合成酶類；rifG-rifN負(fù)責(zé)編碼合成AHBA前體酶類；rifP負(fù)責(zé)編碼利福霉素排出蛋白；其他基因則大部分主要負(fù)責(zé)編碼后修飾蛋白和調(diào)控蛋白[27]。

通過(guò)最近的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)在有無(wú)添加硝酸鹽的條件下，利福霉素生物合成基因簇在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期都是處于高水平的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)；而到了穩(wěn)定前期，在添加硝酸鹽的條件下該基因簇的轉(zhuǎn)錄仍然保持高水平，但無(wú)硝酸鹽的條件下則轉(zhuǎn)錄水平急劇下降。在穩(wěn)定前期，有、無(wú)硝酸鹽條件下基因簇內(nèi)各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄差異在7–2 960 倍之間[28]。

2.2.3 能量代謝

添加硝酸鹽之后，菌體內(nèi)三羧酸循環(huán)中的異檸檬酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶的酶活力都顯著提高[5]。最近的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[28]也支持了之前的酶活測(cè)定結(jié)果，即硝酸鹽能夠促進(jìn)can (編碼烏頭酸酶) 和 icd (編碼異檸檬酸脫氫酶) 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。三羧酸循環(huán)中這些酶活力的提高無(wú)疑為合成利福霉素提供了更多的能量；同時(shí)，由于(2R)-甲基丙二酰CoA主要由三羧酸循環(huán)中的琥珀酰CoA生成，三羧酸循環(huán)的增強(qiáng)能夠促進(jìn)該前體物質(zhì)的合成。至于硝酸鹽如何調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，以及在調(diào)控轉(zhuǎn)錄的同時(shí)是否影響酶的修飾，這些都有待于進(jìn)一步的深入研究。

2.2.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

GlnR屬于OmpR/PhoB家族，是一個(gè)非典型的孤對(duì)應(yīng)答調(diào)控蛋白；其負(fù)責(zé)調(diào)控放線菌中與氮代謝相關(guān)的絕大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄。為了深入了解GlnR的調(diào)控機(jī)制，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)其結(jié)合保守序列進(jìn)行了深入研究，提出了GlnR蛋白的保守結(jié)合位點(diǎn)模型[44-48]。在U32中，GlnR被發(fā)現(xiàn)與硝酸鹽效應(yīng)直接相關(guān)：在glnR突變株RK中，添加硝酸鹽并不能促進(jìn)利福霉素產(chǎn)量的提高。目前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，在硝酸鹽存在的條件下，GlnR激活了與利福霉素前體供給相關(guān)的nas operon[49]和glnA[36,50-51]的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制了ald基因的轉(zhuǎn)錄[38]，從而促進(jìn)氮代謝以及體內(nèi)Gln (谷氨酰胺) 的積累。而在RK中，由于nas和glnA的轉(zhuǎn)錄無(wú)法被激活，因此菌體內(nèi)無(wú)法生成大量的Gln，從而限制了利福霉素合成過(guò)程中氮原子的供給。

作為“硝酸鹽效應(yīng)”乃至整個(gè)氮代謝調(diào)控中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，鑒定GlnR的翻譯后修飾及其上游的信號(hào) (信號(hào)分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路) 對(duì)于我們理解“硝酸鹽效應(yīng)”具有非常重要的意義。我們還對(duì)GlnR蛋白N端Receiver結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)其缺乏典型的磷酸化口袋，而且保守的 Asp50并不被磷酸化修飾；但Asp50對(duì)形成有功能的同源二聚體是不可缺少的，該結(jié)構(gòu)由Arg-Asp-Thr電荷網(wǎng)絡(luò)形成[52]。

雖然GlnR的Asp50位點(diǎn)不被磷酸化修飾，通過(guò)現(xiàn)有的 2D-蛋白凝膠電泳結(jié)合 Western blotting技術(shù)，我們已經(jīng)證明GlnR蛋白存在多個(gè)未知的翻譯后修飾 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。進(jìn)一步鑒定這些修飾類型及其與 GlnR功能的關(guān)系將是我們今后工作的重點(diǎn)之一。

除氮代謝外，硝酸鹽還調(diào)控了初級(jí)代謝中其他與前體供給相關(guān)基因的表達(dá)，如脂肪酸合成及 (2R)-甲基丙二酰 CoA合成相關(guān)基因。此外，目前還不清楚利福霉素生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其調(diào)控機(jī)制。對(duì)這些基因調(diào)控機(jī)制的研究將能夠幫助我們更加深入地理解“硝酸鹽效應(yīng)”的分子機(jī)制。

3 展望

自20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)“硝酸鹽效應(yīng)”以來(lái)，中國(guó)科學(xué)院合成生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 (原微生物次生代謝調(diào)控實(shí)驗(yàn)室/分子微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)在焦瑞身先生、姜衛(wèi)紅研究員、趙國(guó)屏院士等的帶領(lǐng)下對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)而深入的研究，并揭示了硝酸鹽通過(guò)促進(jìn)利福霉素生物合成前體供給和合成基因簇基因的高表達(dá)來(lái)最終提高利福霉素的產(chǎn)量。同時(shí)，隨著氮代謝調(diào)控蛋白GlnR的鑒定，我們對(duì)硝酸鹽調(diào)控氮代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)理有了初步的認(rèn)識(shí)。然而，目前仍有大量未知的問(wèn)題有待進(jìn)一步解決。例如，“硝酸鹽效應(yīng)”中的信號(hào)分子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，GlnR蛋白的翻譯后修飾類型及機(jī)制，利福霉素生物合成基因簇的調(diào)控機(jī)制以及除氮代謝之外的其他前體代謝途徑 (特別是脂肪酸代謝) 的調(diào)控機(jī)制。近年來(lái)，隨著各種研究手段的飛速發(fā)展，我們可以借助比較基因組分析、RNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝流分析等多種方法來(lái)進(jìn)一步研究“硝酸鹽效應(yīng)”，并進(jìn)而認(rèn)識(shí)地中海擬無(wú)枝酸菌乃至整個(gè)放線菌屬的氮代謝調(diào)控機(jī)制。由于氮代謝與放線菌的次級(jí)代謝密切，對(duì)氮代謝的深入理解將能夠幫助我們?cè)诠I(yè)上更好地進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。同時(shí)，放線菌的氮代謝調(diào)控與腸細(xì)菌及低 GC革蘭氏陽(yáng)性菌 (如枯草芽胞桿菌) 都有顯著的差異，對(duì)放線菌氮代謝調(diào)控的研究將能夠豐富人們對(duì)微生物氮代謝調(diào)控的認(rèn)識(shí)。

致謝:感謝香港中文大學(xué)王駿教授對(duì)本文的認(rèn)真修改。

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