氨基糖苷抗生素慶大霉素：基礎(chǔ)研究的新進(jìn)展及應(yīng)用研究的新潛力

簡心韻，鄧子新，孫宇輝

慶大霉素 (Gentamicin) 是一種在臨床上發(fā)揮著重要作用的氨基糖苷類抗生素(Aminoglycosides)，最初由美國 Schering公司W(wǎng)einstein等于 1963年從絳紅小單孢菌Micromonospora purpurea以及棘孢小單孢菌Micromonospora echinospora中分離獲得[1]，并于1969年在美國投入使用。隨后，日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社 (Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd)Okachi等于 1974年從 Micromonospora sagamienisis以及來自俄羅斯的 Abrasimovskii等于 1990年從 Micromonospora purpurea var.violaceae中均分離獲得慶大霉素[2–3]。1966年，我國著名的微生物學(xué)家王岳分離出慶大霉素小單孢產(chǎn)生菌，并且在 1969年成功工業(yè)化生產(chǎn)。目前所使用的慶大霉素主要成分是慶大霉素 C組分，包括慶大霉素C1、C2、C2a、C1a以C2b[4]。其結(jié)構(gòu)主要是由 2-脫氧鏈霉胺(2-Deoxystreptamine) 在C-4與C-6上通過糖苷鍵與加拉糖胺 (Garosamine) 和絳紅糖胺(Purpurosamine) 連接而成 (圖 1)。由于具有廣譜抗菌性以及速效殺菌性，并且價(jià)格低廉，因此被廣泛應(yīng)用于臨床，一度成為治療革蘭氏陰性菌感染的首選藥物。該抗生素通過與靶細(xì)胞內(nèi)核糖體30S亞基16S rRNA上的氨?；稽c(diǎn)結(jié)合，引起mRNA發(fā)生錯(cuò)譯，從而干擾蛋白質(zhì)的合成殺死病原菌[5]。隨著在臨床上長期而大量的使用，慶大霉素不可避免地出現(xiàn)了嚴(yán)重的耐藥性問題，同時(shí)氨基糖苷類抗生素普遍存在的耳毒性和腎毒性等副作用也限制了慶大霉素的使用[6]。雖然隨著β-內(nèi)酰胺類、奎洛酮類、頭孢類等同樣具有廣譜抗菌性但副作用較少的抗生素的出現(xiàn)，使得慶大霉素等氨基糖苷類藥物在臨床上應(yīng)用逐漸式微。但是對(duì)于具有多重耐藥性的病原菌感染，慶大霉素仍然具有良好的治療效果，特別是與 β-內(nèi)酰胺類抗生素具有良好的協(xié)同效應(yīng)使其仍然是臨床上抗擊病原菌嚴(yán)重感染的利器[7]。

因此，圍繞慶大霉素所展開的相關(guān)研究一直被國內(nèi)外眾多學(xué)者所關(guān)注，特別是隨著近年來現(xiàn)代生物技術(shù)水平的發(fā)展，人們對(duì)慶大霉素的認(rèn)識(shí)更加深入。本文就近年來對(duì)慶大霉素的作用和耐藥機(jī)制、生物合成途徑和結(jié)構(gòu)改造，及其新活性探索方面進(jìn)行綜述，并對(duì)慶大霉素的應(yīng)用與發(fā)展前景進(jìn)行展望。

圖1 慶大霉素C組分化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of gentamicin C complex.

1 分子水平作用機(jī)制和耐藥機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)

早在20世紀(jì) 80年代，人們就開展了對(duì)于包括慶大霉素在內(nèi)的氨基糖苷類藥物作用機(jī)制的研究，加州大學(xué)圣克魯斯分校 (University of California at Santa Cruz) 的Moazed等發(fā)現(xiàn)這一類抗生素的作用靶點(diǎn)位于細(xì)菌核糖體 30S亞基的16S rRNA[8]。近年來，隨著X-Ray技術(shù)和生物大分子NMR技術(shù)的發(fā)展，使細(xì)菌核糖體及核糖體 RNA-氨基糖苷類抗生素復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)得以闡明，從而為人們從分子水平上真正了解氨基糖苷類藥物是如何作用于細(xì)菌核糖體及細(xì)菌的耐藥性機(jī)制提供了可能，進(jìn)而也為基于靶標(biāo)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新型氨基糖苷類藥物展示了光明的前景。

1.1 作用機(jī)制的研究進(jìn)展

現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究表明30S核糖體亞基與tRNA的結(jié)合是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵步驟之一。至今，已有至少兩種細(xì)菌(Thermus thermophiles和Escherichia coli) 的核糖體30S亞基的晶體結(jié)構(gòu)被成功報(bào)道[9-12]，從其晶體結(jié)構(gòu)中能清楚地辨析出與 tRNA結(jié)合的 3個(gè)位點(diǎn)：A (Aminoacyl)、P (Peptide)、E (Exit) 位點(diǎn)[13-14](圖2A)。其中解碼區(qū)A 位點(diǎn)是由3個(gè)腺嘌呤A1408、A1492、A1493在Helix44處通過2個(gè) G-C堿基對(duì)組成的一個(gè)不對(duì)稱內(nèi)環(huán)[15](圖2B)。在翻譯過程中，核糖體在與 mRNA及其匹配的tRNA結(jié)合后，其構(gòu)象會(huì)發(fā)生特定的變化[16]：1) 當(dāng)mRNA未與tRNA 結(jié)合時(shí)，A位點(diǎn)處于靜止空閑狀態(tài) (“OFF”)，此時(shí) A1492 和 A1493 隱藏于Helix44的內(nèi)部；2) 當(dāng)mRNA與互補(bǔ)配對(duì)的tRNA結(jié)合時(shí)，A位點(diǎn)構(gòu)象則翻轉(zhuǎn)為解碼狀態(tài)(“ON”)，此時(shí)A1492和A1493翻出內(nèi)環(huán)與mRNA及tRNA相互結(jié)合 (圖2C)，完成解碼過程后再恢復(fù)至“OFF”狀態(tài)[17]。正是這種被嚴(yán)格控制的有序的構(gòu)象變化使核糖體在解碼過程中精確識(shí)別并結(jié)合與 mRNA互補(bǔ)配對(duì)的 tRNA，從而保持蛋白質(zhì)翻譯的準(zhǔn)確性[15]。

慶大霉素等氨基糖苷類藥物正是通過與細(xì)菌核糖體30S亞基的16S rRNA解碼區(qū)A位點(diǎn)特異性結(jié)合來發(fā)揮作用：2-DOS (環(huán)II) 能與A位點(diǎn)保守的G1494和U1495發(fā)生強(qiáng)烈的氫鍵作用；其環(huán)I能插入16S rRNA 的Helix44內(nèi)部，主要與A1408、A1492和A1493形成氫鍵。這些特異性的相互作用都能幫助 16S rRNA形成穩(wěn)定內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，這與“ON”狀態(tài)的 A1492和A1493 翻出內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)類似 (圖 2C)，長期處于“ON”狀態(tài)使得非互補(bǔ)配對(duì)的 tRNA也能夠通過A 位點(diǎn)，最終導(dǎo)致錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的形成[18-19]。還有研究表明，除了以上這些保守的相互作用以外，不同的氨基糖類化合物由于其結(jié)構(gòu)的不同對(duì)于A位點(diǎn)的親和力不同，在影響核糖體構(gòu)象翻轉(zhuǎn)的作用上也有著不盡相同的方式，這也造成了它們活性上的差異[20]。然而，美國新澤西醫(yī)學(xué)和牙科大學(xué) (University of Medicine and Dentistry of New Jersey) 的Phlich研究組研究表明，氨基糖苷類藥物與 A 位點(diǎn)的親和力對(duì)殺菌能力的影響是次要的，而這種結(jié)合效應(yīng)導(dǎo)致的A1492移動(dòng)性的減弱卻是決定其藥效更為重要的因素[21]。除此之外，美國勞倫斯伯克利國家實(shí)驗(yàn)室 (Lawrence Berkeley National Laboratory)的Cate研究組和美國威爾康乃爾醫(yī)學(xué)院 (Weill Cornell Medical College) 的Blanchard研究組的研究都揭示了由于氨基糖苷類抗生素與核糖體30S亞基的結(jié)合造成的核糖體構(gòu)象變化對(duì)于細(xì)菌核糖體亞基遷移性會(huì)造成影響，這種作用抑制了核糖體再循環(huán)因子的結(jié)合，減慢了核糖體再循環(huán)過程從而影響蛋白質(zhì)的合成過程[22-23]。

圖2 細(xì)菌30S亞基16S rRNA氨基糖苷類抗生素結(jié)合位點(diǎn) (A: 細(xì)菌核糖體結(jié)構(gòu)；B: 細(xì)菌核糖體16S rRNA的A位點(diǎn)二級(jí)結(jié)構(gòu)；C: 細(xì)菌30S亞基16S rRNA氨基糖苷類抗生素結(jié)合位點(diǎn))[20]Fig. 2 Aminoglycosides bind in the 30S A site in Helix 44 (H44) of 16S rRNA. (A) Structure of bacterial ribosome.(B) Secondary structure of the bacterial 16S rRNA A site. (C) Aminoglycosides bind in the 30S A site of the 16S rRNA[20].

1.2 耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展

目前，人們關(guān)于氨基糖苷類抗生素的耐藥性機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要包括： 1) 減少對(duì)氨基糖苷類藥物的吸收以及降低其在細(xì)胞內(nèi)的積累； 2) 通過氨基糖苷類抗生素鈍化酶 (Aminoglycosidemodifying enzymes, AME) 對(duì)氨基糖苷類抗生素進(jìn)行修飾；3) 通過突變或甲基化修飾改變氨基糖苷類抗生素在細(xì)菌核糖體 30S亞基中 16S rRNA上的結(jié)合作用位點(diǎn)。其中后兩種機(jī)制可造成更高水平的耐藥性，因此，也更加引發(fā)人們的關(guān)注。

氨基糖苷類抗生素以氨基和羥基作為氫鍵的供體與細(xì)菌的核糖體發(fā)生一系列的相互作用，而它們同時(shí)也是病原菌中AME的作用靶點(diǎn)，被修飾后的氨基糖苷類抗生素對(duì)于細(xì)菌核糖體的親和力減弱，從而產(chǎn)生耐藥性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的鈍化酶分為以下 3種：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-Acetyltransferases, AACs)、O-磷酸轉(zhuǎn)移酶(O-Phosphotransferases, APHs)和O-核苷轉(zhuǎn)移酶(O-Adenyltransferases, ANTs)，它們根據(jù)其作用位點(diǎn)的不同又分為了多個(gè)亞型，其分類、作用位點(diǎn)及在細(xì)菌中的分布見表1和圖3[24]。

1987年加州大學(xué)圣克魯斯分校的Noller研究組報(bào)道了16S rRNA上A位點(diǎn)的突變及特異性甲基化修飾造成細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗生素高水平耐藥的研究結(jié)果[25]。他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌16S rRNA的A位點(diǎn)A1408G的突變，造成了新霉素及慶大霉素等2-DOS類氨基糖苷類抗生素對(duì)于細(xì)菌核糖體親和力的急劇下降甚至無法結(jié)合。而A位點(diǎn)上的特異性甲基化修飾是由細(xì)菌中16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶通過將A位點(diǎn)上的核苷酸甲基化修飾為m7G1405或m1A1408而發(fā)揮作用的，它們被歸類為Rma超家族，且根據(jù)其修飾位點(diǎn)的不同又分為G1405和A1408修飾酶兩類[26]。由于16S rRNA在物種中具有高度保守的特性，因此這種耐藥機(jī)制在臨床上可以被監(jiān)測。但近年來人們在多種病原菌中發(fā)現(xiàn)了由質(zhì)粒介導(dǎo)的 16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，如從Escherichia coli 臨床分離菌中發(fā)現(xiàn)的NpmA[27]和 ArmA[28]，從 Poteus mirabilis分離得到的RmtC[29]等，它們均能特異性甲基化A1408，導(dǎo)致病原菌對(duì)氨基糖苷類抗生素多種類及高水平的耐藥。這一發(fā)現(xiàn)也暗示了由于這種質(zhì)粒介導(dǎo)的甲基轉(zhuǎn)移酶在各個(gè)病原菌中的傳播可能是造成近年來氨基糖苷類抗生素出現(xiàn)大面積耐藥現(xiàn)象的原因之一。最新研究也揭示了NpmA與16S rRNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)[30]，這為開發(fā)這一類甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制劑從而遏制氨基糖苷類抗生素耐藥現(xiàn)象提供了線索。

圖 3 氨基糖苷類抗生素鈍化酶與卡那霉素 B的相互作用位點(diǎn)Fig. 3 AME target sites on kanamycin B.

表1 主要的氨基糖苷類抗生素鈍化酶分類與分布[31]Table 1 Classification and dissemination of main AME[31]

氨基糖苷類抗生素作用機(jī)制及耐藥性機(jī)制在分子水平上的研究成果為基于核糖體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和開發(fā)抗感染力更強(qiáng)、與病原RNA結(jié)合更特異、封閉鈍化酶作用位點(diǎn)的新型氨基糖苷類抗生素衍生物及鈍化酶與 16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑打下了良好的基礎(chǔ)。

2 生物合成途徑的解析

一直以來人們期待能夠全面清晰地闡明慶大霉素的生物合成機(jī)制，然而到目前為止，慶大霉素的生物合成途徑仍然存在許多未解之謎。近年來，隨著測序技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因功能得以闡明，對(duì)其生物合成途徑的分子水平解析也取得了長足的進(jìn)步。

2.1 基于傳統(tǒng)隨機(jī)誘變突變株建立生物合成模型

早在慶大霉素發(fā)現(xiàn)之初，Weinstein等發(fā)現(xiàn)在慶大霉素產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物中除了含有慶大霉素C1、C1a、C2和C2a等主要成分外，還含有一些微量但同樣具有抗菌活性的組分[32-33]。隨著產(chǎn)物分離技術(shù)以及分析檢測技術(shù)水平的提高，慶大霉素 C2b以及合成中間體 A2、X2、G418、JI-20A以及JI-20B等一系列化合物相繼被分離并結(jié)構(gòu)鑒定[34-38]。這些組分的發(fā)現(xiàn)為慶大霉素生物合成精細(xì)途徑的揭示奠定了基礎(chǔ)。1967年，美國Schering公司的Testa等通過對(duì)利用傳統(tǒng)理化方法隨機(jī)誘變所獲得的慶大霉素生物合成阻斷突變株進(jìn)行中間體喂養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，首次提出慶大霉素 C組分化合物通過兩條分支途徑進(jìn)行生物合成的模型[39]。隨后該研究組進(jìn)一步提出可能參與慶大霉素生物合成的甲基轉(zhuǎn)移、氨基轉(zhuǎn)移、脫氫反應(yīng)、糖基轉(zhuǎn)移等步驟[40]。不過在此之后，由于受限于其產(chǎn)生菌分子遺傳操作技術(shù)手段的建立，在較長的一段時(shí)間內(nèi)，慶大霉素生物合成途徑的相關(guān)研究都未能取得突破性的進(jìn)展。

2.2 基于現(xiàn)代分子遺傳學(xué)與生物化學(xué)解析生物合成途徑

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)與DNA測序技術(shù)的發(fā)展，從分子水平上對(duì)慶大霉素等氨基糖苷類抗生素生物合成途徑的揭示逐步進(jìn)入一個(gè)新的階段。1990年，英國萊斯特大學(xué) (University of Leicester) 的Kelemen等首次從慶大霉素產(chǎn)生菌Micromonospora purpurea中克隆到慶大霉素抗性基因 (grmA，即gtmF或gmrA)[41]。隨后，英國華威大學(xué) (University of Warwick) 的Wellington EM 研究組，韓國鮮文大學(xué) (Sun Moon University) 的Sohng JK研究組以及德國伍珀塔爾大學(xué) (Bergische Universit?t Wuppertal)的Piepersberg W研究組分別利用2-脫氧鏈霉胺生物合成基因中的保守序列作為探針，克隆到慶大霉素生物合成基因簇并完成了基因簇測序(GenBank Accession No. 分別為：AY524043、AJ575934、AJ628149)[42-44](圖4)，他們分別對(duì)慶大霉素生物合成基因簇相關(guān)基因進(jìn)行了命名。2004年，韓國鮮文大學(xué)Kharel等通過蛋白體外催化實(shí)驗(yàn)，揭示出gtmA (即gntB或genC) 是負(fù)責(zé)慶大霉素生物合成的第一步反應(yīng)，即葡萄糖-6-磷酸 (Glucose-6-phosphate) 轉(zhuǎn)化為2-脫氧肌醇 (2-Deoxy-scyllo-inosose) 步驟的關(guān)鍵基因[43]。第一次將體外生化酶學(xué)方法應(yīng)用于慶大霉素生物合成機(jī)制的解析。2008年，韓國梨花女子大學(xué) (Ewha Womans University) 的Park等將基因簇中原本分散排列的參與葡萄糖-6-磷酸到慶大霉素A2生物合成的9個(gè)相關(guān)基因通過基因重組，克隆至紅霉素組成型啟動(dòng)子 PermE*下，并在Streptomyces venezuelae YJ003中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，檢測到目標(biāo)產(chǎn)物慶大霉素A2。首次從分子遺傳學(xué)角度證實(shí)了慶大霉素從起始合成原料葡萄糖-6-磷酸到首個(gè)類三糖中間體慶大霉素 A2的生物合成路徑[45]。

圖4 慶大霉素生物合成基因簇Fig. 4 Gentamicin biosynthetic gene cluster.

由于長期以來慶大霉素產(chǎn)生菌的分子遺傳操作系統(tǒng)都難以建立，因此，慶大霉素生物合成機(jī)制的體內(nèi)研究也一直都未有進(jìn)展。直到2004年，Wellington EM研究組才首次通過基于同源重組的基因插入失活方法證實(shí)了所克隆慶大霉素基因簇[46]。隨后，韓國明知大學(xué) (Myongji University) 的Kwon HJ研究組在2008年通過基因置換的方法，將硫鏈絲菌素抗性基因替換慶大霉素生物合成基因簇中的甲基轉(zhuǎn)移酶同源基因gntE (即gtmI或genD1) 導(dǎo)致突變株中間產(chǎn)物慶大霉素A2的積累，提出gntE是負(fù)責(zé)慶大霉素生物合成中類三糖 (Pseudotrisaccharide) 中間產(chǎn)物慶大霉素A2的第一步修飾的基因[46]。隨后福州大學(xué) Hong研究組同樣利用基因置換的方法，將紅霉素抗性基因替換慶大霉素生物合成基因簇中另一甲基轉(zhuǎn)移酶同源基因 gntK (即gacD或 genK)，導(dǎo)致突變株發(fā)酵產(chǎn)物不再產(chǎn)生在 C-6′發(fā)生甲基化修飾的慶大霉素 C組分 (C1和C2)，同時(shí)明顯提高了在C-6′未發(fā)生甲基化修飾的慶大霉素C組分 (C1a) 的產(chǎn)量，因而揭示gntK是負(fù)責(zé)C-6′甲基化修飾的基因[47]。2013年，沈陽藥科大學(xué) Xia研究組通過體內(nèi)同框敲除gacD (即gntK或genK) 獲得了慶大霉素C1a的高產(chǎn)突變株[48]。同年，美國德州大學(xué)奧斯汀分校 (University of Texas at Austin) 的Liu HW研究組在體外成功表達(dá)出鈷胺素依賴型甲基轉(zhuǎn)移酶GenK，并利用慶大霉素X2作為底物進(jìn)行蛋白體外催化實(shí)驗(yàn)，成功觀察到 C-6′上帶有甲基化的產(chǎn)物G418的產(chǎn)生，從體外生化酶學(xué)角度證明genK是負(fù)責(zé)編碼催化慶大霉素C-6′位甲基轉(zhuǎn)移的基因[49]。同樣通過蛋白體外催化的方法，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院陳代杰研究組和中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所劉文研究組利用體外表達(dá)的 GntI (即 GtmJ或 GenP) 與卡那霉素 B(Kanamycin B，慶大霉素JI-20A類似物) 進(jìn)行催化反應(yīng)，成功檢測到在 C-3′含有磷酸化修飾的卡那霉素 B，推測 gntI也負(fù)責(zé)催化慶大霉素C-3′位磷酸轉(zhuǎn)移，成為JI-20A和JI-20B脫去羥基的前提[50]。至此，人們對(duì)慶大霉素生物合成途徑的研究逐漸深入至對(duì)其生物合成基因簇內(nèi)各基因功能的揭示，為從分子水平全面闡釋慶大霉素的合成機(jī)制開辟了道路。

2014年，武漢大學(xué)孫宇輝研究組與劍橋大學(xué)Peter Leadlay研究組綜合利用分子遺傳學(xué)與生物化學(xué)等方法，系統(tǒng)地解析了慶大霉素合成途徑中從首個(gè)類三糖化合物慶大霉素 A2到慶大霉素多組分合成關(guān)鍵中樞分支點(diǎn)慶大霉素X2的生物轉(zhuǎn)化過程：采用同框敲除的手段對(duì)該途徑中所涉及的4個(gè)關(guān)鍵基因genD2 (即gntC或gtmC)、genS2 (即 gntF 或 gtmD)、genN 和 genD1分別進(jìn)行基因失活，并對(duì)突變株進(jìn)行中間產(chǎn)物喂養(yǎng)，根據(jù)突變株發(fā)酵產(chǎn)物變化預(yù)測出所敲除的目的基因與催化步驟的對(duì)應(yīng)關(guān)系——genD2負(fù)責(zé)編碼催化加拉糖胺 C-3″羥基氧化的脫氫酶，genS2負(fù)責(zé)編碼加拉糖胺 C-3″氨基形成的氨基轉(zhuǎn)移酶，genN負(fù)責(zé)編碼催化加拉糖胺C-3″上氨基甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶，genD1負(fù)責(zé)編碼催化加拉糖胺 C-4″甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶；同時(shí)證實(shí)genK編碼負(fù)責(zé)催化慶大霉素A2形成慶大霉素A2e的甲基轉(zhuǎn)移酶，并在ΔgenD1中發(fā)現(xiàn)慶大霉素Ae的積累；從 ΔgenS2ΔgenK突變株中分離出慶大霉素A2，利用其作為底物，與通過體外表達(dá)的GenD2、GenS2、GenN進(jìn)行酶學(xué)催化反應(yīng)可以獲得慶大霉素A，然后再經(jīng)過GenD1催化可以獲得慶大霉素X2，從而在體外重建該生物合成途徑[51]。同時(shí)，本研究組還揭示了位于分支點(diǎn)的慶大霉素 X2到下游不同支路的產(chǎn)物JI-20A和JI-20B的生物轉(zhuǎn)化途徑：同樣采用同框敲除的方法對(duì)genQ以及genK分別進(jìn)行單基因和雙基因失活，同時(shí)結(jié)合對(duì)突變株進(jìn)行中間產(chǎn)物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證明genQ是負(fù)責(zé)編碼導(dǎo)向不包含 C-6′甲基化修飾的慶大霉素 C組分化合物支路的基因，并驗(yàn)證了genK是負(fù)責(zé)編碼導(dǎo)向含有C-6′甲基化修飾的慶大霉素 C組分化合物支路的基因；同時(shí)對(duì) 4個(gè)編碼磷酸吡哆醛依賴型氨基轉(zhuǎn)移酶的基因genB1 (即gntW或gacK)、genB2(即 gntL或gacE)、genB3 (即 gntJ或 gacC)、genB4(即 gntH或 gacB) 分別進(jìn)行同框單基因失活以及多重基因失活，并在體外表達(dá)出這 4個(gè)基因所編碼的蛋白，通過與GenQ聯(lián)合催化G418反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)這 4個(gè)基因所編碼的蛋白均可以不同程度的催化絳紅糖胺的 C-6′的氨基轉(zhuǎn)移過程，其中GenB1催化效率最高；另外還發(fā)現(xiàn)GenB2具有催化慶大霉素 C2a與 C2異構(gòu)化作用，GenB3與GenB4很可能參與絳紅糖胺的C-3′與C-4′上脫羥基過程[52]。上述研究以慶大霉素生物合成途徑中關(guān)鍵分支點(diǎn)慶大霉素X2為突破口，全面地揭示出了慶大霉素X2的合成來源以及通往下游產(chǎn)物的去路 (圖5)，為利用組合生物合成的方法和技術(shù)開展慶大霉素高效定向優(yōu)化和創(chuàng) 新提供了理論依據(jù)。同年，沈陽藥科大學(xué)夏煥章研究組通過體內(nèi)同框敲除gacJ (即gntX或genQ)并輔以隨機(jī)誘變的方式獲得G418高產(chǎn)突變株[53]，為利用慶大霉素產(chǎn)生菌生物發(fā)酵直接獲得單一組分產(chǎn)物探索了新的方法。

圖5 目前已知的慶大霉素生物合成途徑Fig. 5 Currently confirmed gentamicin biosynthetic pathway.

3 新型氨基糖苷類抗生素的研發(fā)及新生物活性的揭示

3.1 基于核糖體結(jié)構(gòu)及AME作用機(jī)制設(shè)計(jì)的半合成新型氨基糖苷類抗生素的研發(fā)

以慶大霉素為代表的第一代氨基糖苷類抗生素曾被廣泛應(yīng)用于臨床上，但隨之而來的耐藥性及毒性問題也引起了人們的密切關(guān)注。隨著對(duì)氨基糖苷類抗生素作用機(jī)制與耐藥性機(jī)制研究的深入，結(jié)合核糖體結(jié)構(gòu)與AME作用機(jī)制研究而設(shè)計(jì)的第二代半合成氨基糖苷類抗生素衍生物的開發(fā)也隨之進(jìn)入了高潮，如：基于卡那霉素改造而來的地貝卡星 (Dibekacin，1971年)、阿米卡星 (Amikacin，1972年)、阿貝卡星(Arbekacin，1973年) ?；趹c大霉素和西索米星(Sisomicin) 改造而來的異帕米星(Isepamicin，1975年)、奈替米星 (Netilmicin，1976年) (圖6) 都已成功投放于市場。

圖6 第二代半合成氨基糖苷類抗生素衍生物結(jié)構(gòu)Fig. 6 Structure of the second generation of aminoglycosides.

圖7 Plazomicin結(jié)構(gòu)及其封閉的氨基糖苷類抗生素鈍化酶作用位點(diǎn)[54]Fig. 7 Structure of Plazomicin in relation to AME target sites[54].

雖然在上世紀(jì)70年代末，由于喹諾酮類抗生素廣泛應(yīng)用使得氨基糖苷類抗生素的使用大幅度地減少，但近年來作為能抗擊由多重耐藥菌引起的嚴(yán)重感染的重要藥物，氨基糖苷類藥物又重新受到了醫(yī)學(xué)界的重視。目前，人們將研究重點(diǎn)集中在能阻斷 AME作用位點(diǎn)及低毒性的第三代氨基糖苷類抗生素開發(fā)上。由美國Achaogen公司開發(fā)的Plazomicin (ACHN-490)[54](圖 7) 則是目前最為典型的代表，它以西索米星為前體通過化學(xué)合成而來，結(jié)合了多種氨基糖苷類抗生素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以增強(qiáng)其抗菌活性，封閉了重要的 AME作用位點(diǎn)與毒性位點(diǎn)：在2-DOS上引入來自于新霉素的 4-氨基-2-羥基丁酰 (4-Amino-2-hydroxybutyric acid，AHBA)側(cè)鏈顯著增強(qiáng)了其抗菌活性；環(huán)III上引入來自于慶大霉素的甲基化修飾，使其躲避了鈍化酶AAC的修飾；環(huán)I上3，4位同于西索米星雙羥基的缺失的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)也能抵御來自于鈍化酶APH (3′)、ANT (4′)的修飾；環(huán) I 6′-NH3 上引入的羥乙基也封閉了AAC (6′)的作用位點(diǎn)及氨基糖苷類抗生素毒性來源的主要位點(diǎn)之一。該抗生素以其能抗擊多重耐藥菌及低毒的特性已于2012年成功完成了第二階段的臨床試驗(yàn)[55]。

3.2 新生物活性與新藥用潛力的挖掘

伴隨著對(duì)氨基糖苷類藥物作用機(jī)制的深入研究，其新的生物活性也不斷被揭示。法國國家科學(xué)研究院分子和細(xì)胞生物學(xué)研究所(Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire du CNRS) 的Westhof E研究組發(fā)現(xiàn)慶大霉素等氨基糖苷類藥物能夠與核糖體內(nèi)RNA特定部位通過不規(guī)則堿基配對(duì)形成的“內(nèi)環(huán)”結(jié)構(gòu)相結(jié)合，而這種特殊的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)與多種病毒RNA的復(fù)制密切相關(guān)，同時(shí)它們還存在于HIV的效應(yīng)元件結(jié)合區(qū)中[56]，這一現(xiàn)象引發(fā)了人們對(duì)于開發(fā)特異性抗病毒的氨基糖苷類抗生素的極大興趣。目前研究較多的能與氨基糖苷類藥物結(jié)合的特異性靶標(biāo)RNA及RNA調(diào)節(jié)因子有：核酶Ⅰ型內(nèi)含子、錘頭核酶和丁型肝炎核酶；HIV反式激活效應(yīng)元件 (Trans-activating responds element,TAR)，rev效應(yīng)元件 (Rev-response element,RRE)。這些研究在治療與RNA相關(guān)的疾病方面，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，使得氨基糖苷類藥物及其衍生物有望用于艾滋病、肝炎病毒等疾病的治療[57]。

堿基對(duì)的置換、插入或者缺失產(chǎn)生的非成熟終止密碼子 (Premature termination codon，PTC) 可造成肽鏈的合成提前終止，形成沒有功能或者是功能不完整的蛋白質(zhì)，這是導(dǎo)致 12%的人類遺傳疾病發(fā)生的根源[58]。1996年，美國阿拉巴馬大學(xué)伯明翰分校 (University of Alabama at Birmingham) Howard等在對(duì)囊性纖維化 (Cystic fibrosis，CF) 的研究過程中首次觀察到慶大霉素等氨基糖苷類化合物可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)抑制 PTC，從而合成完整的有功的蛋白質(zhì)，該研究結(jié)果暗示著慶大霉素可以用于治療囊性纖維化[59]。隨后，具有AHBA側(cè)鏈的巴龍霉素 (Butirosin) 衍生物 NB30、NB54及NB84 也相繼被開發(fā)出來，體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察到這3種衍生物對(duì)CF、進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良 (Duchenne muscular dystrophy，DMD) 及Rett綜合征的PTC均有抑制作用[60-62]。2010 年，美國俄亥俄州立大學(xué)醫(yī)學(xué)院 (The Ohio State University College of Medicine) 的Mendell JR研究組發(fā)現(xiàn)慶大霉素能改善由無義突變引起的DMD癥狀[63]；此外，研究表明慶大霉素在治療遺傳性心率失常方面，也具有一定治療活性[64]。

p53是一類重要的腫瘤抑制因子，其突變與癌癥的發(fā)生有著密切的關(guān)系。近期也有研究報(bào)道顯示，在含有 p53無義突變的人乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞中加入不同的氨基糖苷類抗生素 (G418、慶大霉素等)，能夠恢復(fù)PTC引起的腫瘤抑制因子 p53蛋白質(zhì)的不完全翻譯并且使腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)增加。這一研究的發(fā)現(xiàn)為氨基糖苷類藥物利用終止密碼子的通過效應(yīng)來抑制腫瘤細(xì)胞生長提供了理論依據(jù)[65]，使得將氨基糖苷類藥物應(yīng)用于腫瘤的治療有了突破性的進(jìn)展。

最新研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的慶大霉素還可以作為一種增敏劑，在體外能夠顯著提高抗腫瘤藥物喜樹堿、洋地黃毒苷和長春花堿對(duì)NCI-H460肺癌細(xì)胞的作用活性[66]，這項(xiàng)研究為氨基糖類抗生素新藥用功能的挖掘提供了新的思路。

因此，研制和開發(fā)新型氨基糖苷類藥物或其衍生物，用于由治療無義突變引起的人類遺傳性疾病及利用終止密碼子的通過效應(yīng)來發(fā)揮的抗腫瘤活性成為了氨基糖類抗生素老藥新用的發(fā)展方向之一。結(jié)合對(duì)氨基糖苷類藥物藥理學(xué)的研究，不斷深入挖掘其新的藥用活性也能為氨基糖苷類藥物重新注入新的血液。

4 總結(jié)與展望

慶大霉素自進(jìn)入臨床使用以來，以其良好的治療效果一直在臨床治療中發(fā)揮著重要的作用。雖然因毒性及耐藥性問題受到了一定的限制，但作為治療由革蘭氏陰性菌導(dǎo)致的嚴(yán)重感染的首選藥物在臨床中仍然占據(jù)著不可替代的位置。隨著近年來分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使人們在分子水平對(duì)其作用機(jī)制、耐藥性機(jī)制、生物合成路徑有了更深入的了解，涌現(xiàn)出了一批新型的氨基糖苷類抗生素衍生物，并揭示出了其新的活性，在新的藥用功能的挖掘中也發(fā)現(xiàn)了其巨大的潛力。

人們期待著慶大霉素等氨基糖苷抗生素未來將有可能從幾個(gè)方面取得突破：1) 對(duì)慶大霉素生物全合成途徑的最終闡明，包括對(duì)目前仍然未知的絳紅糖胺 C-3′和 C-4′上脫雙羥基過程以及絳紅糖胺的 N-6′上甲基化過程的揭示。這些生物合成途徑的揭示有助于我們更好地利用慶大霉素，對(duì)其產(chǎn)生菌進(jìn)行基因定向改造，提高慶大霉素產(chǎn)量或者產(chǎn)生單一組分化合物。2)基于對(duì)作用機(jī)制與耐藥性機(jī)制的了解，利用組合生物合成和合成生物學(xué)的手段對(duì)慶大霉素產(chǎn)生菌進(jìn)行分子水平層面的改造，引入新的生物合成模塊，使其產(chǎn)生非天然結(jié)構(gòu)同時(shí)又具有新活性，特別是針對(duì)耐藥性菌株的新氨基糖苷化合物。3) 基于特異性結(jié)合 RNA的特點(diǎn)定向篩選或改造，開發(fā)出具有低毒或無毒副作用的新型慶大霉素衍生物，使得傳統(tǒng)老藥煥發(fā)新的活力。

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