HPLC-DAD快速測(cè)定飲品中咖啡因含量

盛美意　周心艷　方　萍　李秀東

(1.紹興文理學(xué)院　化學(xué)化工學(xué)院　浙江　紹興312000；2.紹興文理學(xué)院　元培學(xué)院　浙江　紹興312000)

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HPLC-DAD快速測(cè)定飲品中咖啡因含量

盛美意1周心艷2方萍1李秀東1

(1.紹興文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院浙江紹興312000；2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院浙江紹興312000)

摘要：建立了一種快速測(cè)定飲品中咖啡因的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-DAD法).流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸水溶液(20∶10∶70)，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm，流速1.0 mL/min.結(jié)果表明，在咖啡因濃度為0.003~0.120 mg/mL范圍內(nèi)，線性良好(R2=0.9999)；方法精密度RSD為1.75%；重復(fù)性RSD為0.51%；平均加標(biāo)回收率為99%~103%.

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法；咖啡因；飲品

0引言

咖啡因是日常飲料中的主要成分，如1g雀巢咖啡約含咖啡因35 mg，1g茶約含咖啡因20～35 mg，1 000 mL可樂飲料含咖啡因90～100 mg[1].在北美，一個(gè)成年人平均每天攝入咖啡因約200～250 mg，我國(guó)咖啡因的消耗量也在逐年增加[2].咖啡因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮藥，不僅對(duì)心血管系統(tǒng)具有正性作用，還能促進(jìn)胃酸分泌和治療偏頭痛等疾病.適度地使用咖啡因有祛除疲勞、興奮神經(jīng)的作用，臨床上用于治療神經(jīng)衰弱和昏迷復(fù)蘇.但大劑量或長(zhǎng)期使用也會(huì)對(duì)人體造成損害，特別是它具有成癮性，一旦停用會(huì)出現(xiàn)精神萎靡不振、渾身困乏等各種戒斷癥狀，因此被列入受國(guó)家管制的精神藥品范圍[3].

可樂型飲料、咖啡、茶葉及制成品中咖啡因含量的測(cè)定方法有許多，有薄層色譜法[4]、紫外光譜分析法[5-6]、色-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS法)、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)等.其中高效液相色譜法[7-13](HPLC)是最為普遍和實(shí)用的.本實(shí)驗(yàn)主要以綠茶為代表性樣品，用正交試驗(yàn)對(duì)其中咖啡因的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)HPLC條件進(jìn)行了優(yōu)化，并用優(yōu)化好的方法對(duì)不同種類飲品中的咖啡因進(jìn)行了測(cè)定.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器和材料

實(shí)驗(yàn)儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司，配二極管陣列檢測(cè)器)；SK3210HP超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；UPWS超純水器(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司).

實(shí)驗(yàn)材料：咖啡因(GBW(E)130142)為高純度(天津市計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)科學(xué)研究院)；甲醇、乙腈為色譜純(美國(guó)天地試劑有限公司)；無(wú)水甲酸、三氯甲烷均為分析純(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，取自ΜPWS超純水器；7種不同種類飲品均購(gòu)自超市.

1.2　咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品配制

別為0.003、0.006、0.012、0.030、0.060、0.120、10.000 mg/mL的咖啡因?qū)φ掌啡芤?

1.3　樣品制備

液體樣品：取脫氣后試樣10 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取1mL續(xù)濾液備用.

茶及咖啡類等固體樣品：精密稱取粉碎均勻的樣品100.0 mg，加水適量，定容至100.0 mL，搖勻，超聲提取60 min，進(jìn)行脫氣至無(wú)氣泡產(chǎn)生.取10 mL過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取1 mL續(xù)濾液備用.

1.4　HPLC的條件

色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)273 nm.

2結(jié)果與討論

2.1　色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的選擇

在保持其他色譜條件相同的情況下，分別在流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70[9]，甲醇-乙腈-水=57∶29∶14(每升流動(dòng)相中加入0.8 mol/L乙酸液50 mL)[11]，甲醇-水=23∶77[13]下觀察咖啡因的出峰效果和峰形，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.圖1表明，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸=20∶10∶70時(shí)峰形最好，分離效果最佳.

圖1　咖啡因在不同流動(dòng)相中的高效液相色譜圖

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用二極管陣列檢測(cè)器在線掃描咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.圖2表明，咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液最大吸收波長(zhǎng)分別是210 nm和273 nm，因在210 nm處測(cè)樣品時(shí)有雜質(zhì)干擾，故選定273 nm為檢測(cè)波長(zhǎng).

圖2　咖啡因紫外吸收?qǐng)D

2.2　咖啡因前處理方法的選擇

對(duì)綠茶中咖啡因的提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間等因素進(jìn)行(2×3×3)正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.由表1可見，提取方法為超聲、提取溶劑為超純水、提取時(shí)間為60 min的方法最佳，峰面積最大，故選取這一方法為樣品中咖啡因的提取方法.

今寧波設(shè)立的“平字水則”建立在宋寶祐年間（1253—1258年）的古“平字水則”基礎(chǔ)上。據(jù)史書記載，在溫州譙樓前五福橋上的“永嘉水則”為宋元祐三年（1088年）所立，比寧波“平字水則”早170年，并具有管理運(yùn)用功能，是至今為止發(fā)現(xiàn)最早的 “平字水則”。出土于溫州的“開平閘”石刻，顯然與“平字水則”有著必然的聯(lián)系，“平字水則”的“平”字極有可能取自“開平閘”的簡(jiǎn)化運(yùn)用。因此，“開平閘”石刻很可能是“平字水則”的前身，“平字水則”是其演化的結(jié)果。它既是石刻記錄，又具運(yùn)用調(diào)度功能，是“水則”發(fā)展史中第二階段到第三階段的過(guò)渡。

表12×3×3正交試驗(yàn)

序號(hào)方法溶劑時(shí)間/min峰面積1超聲超純水201340.42超聲超純水401529.93超聲超純水601571.74超聲甲醇201273.35超聲甲醇401495.76超聲甲醇601501.77超聲三氯甲烷2096.28超聲三氯甲烷40115.59超聲三氯甲烷60122.410浸泡超純水201220.311浸泡超純水401368.412浸泡超純水601456.913浸泡甲醇201166.814浸泡甲醇401349.615浸泡甲醇601397.216浸泡三氯甲烷2087.817浸泡三氯甲烷40102.918浸泡三氯甲烷60116.7

2.3　線性范圍、精密度、重現(xiàn)性及回收率

將配置好的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液按以上色譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得在0.003～0.120 mg/mL濃度范圍內(nèi)的線性回歸方程為：

Y=56136x+29.303，

其相關(guān)系數(shù)R2=0.9999.此方法既好又寬的線性范圍可以滿足不同種類飲品咖啡因含量的測(cè)定.

精密吸取0.03 mg/mL的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，重復(fù)6次進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.75%，小于2%，說(shuō)明儀器精密度良好.

取同一批綠茶樣品6份，每份精密稱取100.0 mg，按以上方法制備樣品并測(cè)定，得到綠茶中咖啡因平均含量是27.51 mg/g，RSD為0.51%，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性好.

在綠茶樣品中分別加入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg、2.00 mg、5.00 mg，按以上方法制備樣品并上機(jī)測(cè)試，根據(jù)在實(shí)際樣品中提取出的咖啡因含量和標(biāo)準(zhǔn)品含量之比計(jì)算回收率，得平均回收率為99.16%～103.38%，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.表2結(jié)果說(shuō)明，該提取方法切實(shí)可行，具有很好的準(zhǔn)確度.

2.4　實(shí)際樣品的測(cè)定

分別取康師傅綠茶、康師傅冰紅茶、百事可樂、綠茶、大肚子茶、摩卡特濃奶茶、摩卡咖啡等飲品，按以上方法制備樣品并上機(jī)測(cè)試，結(jié)果見表3.

表2綠茶中咖啡因的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

樣 品本底值/(mg·g-1)加標(biāo)量/mg平均測(cè)定值/(mg·g-1)回收率/%綠茶1綠茶2綠茶327.711.0037.6299.162.0047.86100.755.0079.40103.38

表3不同飲品的咖啡因含量的測(cè)定結(jié)果

名 稱含 量(mg/mL或mg/g)康師傅綠茶10.13康師傅綠茶20.14康師傅冰紅茶10.07康師傅冰紅茶20.07百事可樂10.11百事可樂20.11綠茶128.16綠茶227.94大肚子茶110.63大肚子茶210.56摩卡特濃奶茶11.51摩卡特濃奶茶21.48摩卡咖啡134.15摩卡咖啡234.20

3結(jié)論

本文利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法快速測(cè)定了飲品中咖啡因的含量，探討了咖啡因的提取方法并優(yōu)化了色譜條件.該方法的提取溶劑為超純水，對(duì)環(huán)境友好，分析速度快，儀器測(cè)試時(shí)間在10 min內(nèi)完成，極大地節(jié)約了測(cè)試成本，提高了工作效率.同時(shí)對(duì)不同飲品中的咖啡因進(jìn)行了測(cè)定分析.該方法線性范圍寬，具有良好的重現(xiàn)性和回收率，可用于不同種類飲品中咖啡因含量的測(cè)定.

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(責(zé)任編輯鄧穎)

Rapid Determination of Caffeine in Beverages by HPLC-DAD

Sheng Meiyi1Zhou Xinyan2Fang Ping1Li Xiudong1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000;

2. College of Yuanpei, Shaoxing University, Shaoxing, Zhejiang 312000)

Abstract：An analytical method for rapid determination of caffeine in beverages was established by high performance liquid chromatography-diode array detection. The chromatography conditions were optimized as follows: Mobile phase consisted of methanol-acetonitrile- 0.1% formic acid (20∶10∶70), the detection wavelength was set at 273 nm, and the flow rate was 1.0 mL/min. The results showed that there was a good linearity within the range of 0.003~0.12 mg/mL(R2=0.9999). The Precision RSD was 1.75%. The repeatability RSD was 0.51%. The average recovery was 99%~103%. This simple, rapid, accurate and reproducible method can be used as an analysis method for determining caffeine in beverages.

Key words：HPLC-DAD; caffeine; beverage

中圖分類號(hào)：O657.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-293X(2015)10-0021-03

doi：10.16169/j.issn.1008-293x.k.2015.10.05

*收稿日期：2015-06-08基金項(xiàng)目：紹興文理學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目(2014LG1003)

作者簡(jiǎn)介：盛美意(1987-)，女，浙江新昌人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：色質(zhì)譜分析.