運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎檢測(cè)杭州稻田的生態(tài)毒性

應(yīng)夢(mèng)嬌，李星翰，瞿巧文，錢姣娟，祝彩麗，林蘇杰，王學(xué)漫，陶珊珊，尹曉輝?

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310011；2.慶元縣農(nóng)業(yè)局，浙江慶元 323000）

運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎檢測(cè)杭州稻田的生態(tài)毒性

應(yīng)夢(mèng)嬌1，李星翰1，瞿巧文2，錢姣娟1，祝彩麗1，林蘇杰1，王學(xué)漫1，陶珊珊1，尹曉輝1?

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310011；2.慶元縣農(nóng)業(yè)局，浙江慶元 323000）

浙江省是農(nóng)化產(chǎn)品生產(chǎn)大省，其帶來(lái)一定經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí)，也帶來(lái)了許多負(fù)面影響。稻田底泥對(duì)農(nóng)藥等大多數(shù)污染物有很強(qiáng)的吸附作用，會(huì)嚴(yán)重影響稻田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性。檢測(cè)和分析水稻田底泥農(nóng)藥等污染物的生態(tài)毒性對(duì)稻田生態(tài)評(píng)價(jià)十分重要。2014年3月下旬到4月下旬，在杭州余杭南湖區(qū)、臨安官塘、余杭瓶窯、蕭山浦陽(yáng)先后采集底泥樣品和水樣，將熱帶爪蟾胚胎（NF10?NF11）暴露于1∶4底泥提取液和水樣中48 h，觀測(cè)其發(fā)育狀況。不同采樣點(diǎn)對(duì)熱帶爪蟾胚胎均有不同程度的致畸作用，包括尾部彎曲、腸道突出和腹部水腫等。其中，蕭山浦陽(yáng)地區(qū)X1采樣點(diǎn)底泥提取液處理下熱帶爪蟾的畸形率最高達(dá)19.3%（P＜0.05），X3采樣點(diǎn)水樣處理下熱帶爪蟾的畸形率最高達(dá)30.6%（P＜0.05）。由此可見(jiàn)，蕭山浦陽(yáng)地區(qū)稻田的底泥和水樣的毒性高于臨安官塘、余杭南湖區(qū)、余杭瓶窯。研究表明，杭州稻田底泥對(duì)熱帶爪蟾胚胎的發(fā)育均有不同程度的影響，具有明顯的生態(tài)毒性。

生態(tài)毒性；熱帶爪蟾胚胎；稻田底泥

水稻是中國(guó)的重要糧食作物，尤其是南方地區(qū)。浙江省的主要糧食作物是水稻，種植歷史悠久。且浙江省是農(nóng)藥生產(chǎn)大省，長(zhǎng)期以來(lái)產(chǎn)量居全國(guó)第二［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年浙江省農(nóng)藥總產(chǎn)量為42.9 t，其中除草劑占70.8%，殺蟲(chóng)劑占18.8%，殺菌劑占9.5%。近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)的逐漸發(fā)展，越來(lái)越多的污染物進(jìn)入水稻田。在污染的條件下，稻田中水生生物生存適應(yīng)性降低，稻田生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重退化甚至喪失［2］。而稻田底泥的生態(tài)環(huán)境好壞對(duì)水稻的生長(zhǎng)、發(fā)育有著十分重要的作用。

兩棲動(dòng)物是農(nóng)田、濕地和林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，各種污染物不僅毒害兩棲動(dòng)物，而且造成其種群嚴(yán)重衰退，這已是不爭(zhēng)的事實(shí)［3－6］。兩棲動(dòng)物胚胎和幼年時(shí)期是動(dòng)物發(fā)育的一個(gè)重要敏感期，該時(shí)期對(duì)外源性污染物的吸收和積累可能會(huì)嚴(yán)重影響到胚胎發(fā)育和器官形成，導(dǎo)致身體畸形甚至死亡等不可逆轉(zhuǎn)的傷害［7］。熱帶爪蟾是兩棲動(dòng)物中新的模式生物，其產(chǎn)卵量大，體外受精、體外發(fā)育生長(zhǎng)迅速、性成熟周期短，而且有整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程均可觀察，生命力強(qiáng)等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育、功能基因組學(xué)和人類遺傳疾病研究和動(dòng)物疾病模型的建立［8－9］。爪蟾胚胎致畸（FETAX）是一種運(yùn)用爪蟾胚胎檢測(cè)化合物發(fā)育毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)存活率、畸形率和生長(zhǎng)抑制率等指標(biāo)來(lái)表征化合物的毒性強(qiáng)弱［10］。

余杭、蕭山、臨安位于杭州市周邊，是杭州地區(qū)重要的水稻種植基地。該地區(qū)的水稻田大量施用農(nóng)藥和化肥，化肥包括氮肥、磷肥，農(nóng)藥以除草劑驃馬、乙草胺和草甘膦等為主，殺菌劑有多菌靈和稻瘟凈等。因此，水稻田底泥中殘留的各種農(nóng)藥，具有杭州水稻田的典型特征。除常規(guī)理化指標(biāo)外，對(duì)水稻底泥進(jìn)行生態(tài)毒性檢測(cè)尤為重要，本研究運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎檢測(cè)稻田底泥的生態(tài)毒性，為保護(hù)生物多樣性和水稻適宜生長(zhǎng)的環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

熱帶爪蟾，由實(shí)驗(yàn)室自養(yǎng)，取NF10?11階段且發(fā)育正常的胚胎用于試驗(yàn)［11］。

稻田共采樣2次，采樣時(shí)間為2014年4－10月，利用TATO天泰正合MM9手持GPS定位儀定位，遵循Z字形5點(diǎn)采樣法的原則，在杭州地區(qū)水稻種植基地共設(shè)置采樣地4個(gè)，采樣點(diǎn)20個(gè)，進(jìn)行底泥和水樣的采集，然后用棕色瓶分裝并貼好標(biāo)簽，－80℃保存待用。采集過(guò)程中對(duì)采樣點(diǎn)的常規(guī)理化數(shù)據(jù)（溫度、pH值、溶解氧、氨、電導(dǎo)率）進(jìn)行測(cè)量。

具體采樣地點(diǎn)，余杭南湖區(qū)水稻田地理坐標(biāo)為30°15′51″N，119°56′11″E；余杭瓶窯水稻田地理坐標(biāo)30°22′08″N，119°58′48″E；臨安官塘水稻田地理坐標(biāo)30°15′46″N，119°43′26″E；蕭山浦陽(yáng)水稻田地理坐標(biāo)29°59′23″N，120°15′04″E。

1.2 方法

熱帶爪蟾胚胎致畸試驗(yàn)，挑選實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖的性成熟熱帶爪蟾15對(duì)，采用人工注射絨毛膜促性腺激素（HCG）的方法誘導(dǎo)產(chǎn)卵。每對(duì)熱帶爪蟾各注射2次HCG，待成蛙抱對(duì)產(chǎn)卵結(jié)束后收集受精卵，挑選出達(dá)到NF10?11階段且發(fā)育正常的胚胎進(jìn)行試驗(yàn)。

底泥的處理采用水溶劑提取法，將采集到的底泥與蒸餾水按照1∶4的體積比混合后裝入250 mL的塑料瓶中，密封于振蕩機(jī)上振蕩24 h，條件控制為100 r·min－1，22℃，然后靜置24 h，提取上清液待用［12］。

對(duì)照組和各試驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)平行組，對(duì)照組為曝過(guò)氣的自來(lái)水，試驗(yàn)組為稻田水樣和底泥提取液。每個(gè)平行組放20只正常胚胎，并在25℃多功能培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暴露試驗(yàn)，24 h對(duì)照組和各試驗(yàn)組重新?lián)Q溶液，記錄孵化個(gè)數(shù)，并將未孵化的胚胎挑出。統(tǒng)計(jì)48 h內(nèi)胚胎畸形率，并對(duì)畸形胚胎進(jìn)行顯微拍照，有研究顯示外源化合物對(duì)熱帶爪蟾胚胎48 h后畸形率較高［13］。

將存活胚胎用100 mg·L－1 MS?222麻醉處理后固定于4%的甲醛溶液中，取出經(jīng)固定的胚胎，在Nikon解剖鏡下觀察胚胎的發(fā)育狀況。用NikonDS?SM型顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并計(jì)算孵化率、存活率、體長(zhǎng)和畸形率。孵化率為24 h后孵化胚胎個(gè)數(shù)所占最初放入受精卵個(gè)數(shù)百分比；存活率為48 h后存活胚胎個(gè)數(shù)所占孵化出的個(gè)數(shù)百分比；體長(zhǎng)為胚胎頭部至尾部的水平距離；畸形率為48 h后胚胎畸形個(gè)數(shù)所占存活個(gè)數(shù)百分比。通過(guò)胚胎暴露試驗(yàn)觀測(cè)和分析熱帶爪蟾胚胎的表觀畸形類型及表型特征變化，綜合評(píng)價(jià)稻田底泥和水樣的被農(nóng)藥污染程度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。以每孔中的胚胎為一個(gè)平行樣，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，n＝3。用Tukey?test進(jìn)行分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 畸形現(xiàn)象

畸形現(xiàn)象如圖1所示，主要為脊索彎曲、泄殖腔突出、腹部水腫、色素減少和尾巴變短，其中以尾巴縮短和泄殖腔突出最為普遍。

圖1 稻田底泥提取液對(duì)熱帶爪蟾胚胎的致畸效應(yīng)

2.2 同一地區(qū)不同地點(diǎn)的樣品

2.2.1 臨安官塘

如表1所示，底泥提取液的孵化率和存活率在各個(gè)采樣點(diǎn)差異不顯著，G1點(diǎn)的畸形率與其他采樣點(diǎn)差異顯著；G4，G5采樣點(diǎn)的水樣存活率與其他樣點(diǎn)差異顯著。與清水對(duì)照相比，G4點(diǎn)底泥樣品處理組孵化率略低，為73.3%，但差異不顯著；G5點(diǎn)的水樣的檢測(cè)存活率只有51.0%，差異顯著，孵化率為98.3%，差異不顯著；G4點(diǎn)的底泥提取液的檢測(cè)畸形率高達(dá)11.9%，差異顯著；G2點(diǎn)和G3點(diǎn)的水樣的檢測(cè)畸形率分別達(dá)到7.4%和6.7%，差異顯著。

2.2.2 余杭南湖

如表2所示，除Y5點(diǎn)底泥提取液和水樣的存活率與其他樣點(diǎn)的存活率差異顯著，其他各采樣點(diǎn)之間的孵化率、存活率和畸形率的差異不顯著。與清水對(duì)照相比較，Y4點(diǎn)的底泥提取液和水樣的檢測(cè)孵化率分別為49.3%和68.5%，差異均不顯著；Y3點(diǎn)的底泥提取液的檢測(cè)存活率為39.7%，差異顯著，水樣的檢測(cè)存活率為65.6%，差異不顯著；Y4點(diǎn)的底泥提取液的檢測(cè)畸形率為9.7%，差異顯著，水樣的檢測(cè)畸形率為4.2%，差異不顯著（表2）。

2.2.3 余杭瓶窯

如表3所示，各個(gè)采樣點(diǎn)的底泥提取液和水樣的孵化率和存活率差異不顯著，各采樣點(diǎn)之間水樣的畸形率差異顯著。L2和L4點(diǎn)底泥提取液的畸形率分別為12.9%和14.0%，與清水對(duì)照比較差異顯著；L2和L5點(diǎn)的水樣的檢測(cè)畸形率分別為11.8%和17.6%，與清水對(duì)照比較差異顯著。

表1 臨安官塘5個(gè)樣品對(duì)熱帶爪蟾胚胎的影響

表2 余杭南湖區(qū)5個(gè)樣品對(duì)熱帶爪蟾胚胎的影響

表3 余杭瓶窯5個(gè)樣品對(duì)熱帶爪蟾胚胎的影響

2.2.4 蕭山浦陽(yáng)

如表4所示，從孵化率分析，X1點(diǎn)的水樣的檢測(cè)孵化率有66.7%，與清水對(duì)照比較差異顯著。從畸形率分析，X1，X2，X4和X5點(diǎn)的底泥檢測(cè)畸形率分別為19.3%，18.7%，4.2%和10.0%，與清水對(duì)照比較差異顯著。X3點(diǎn)的水樣的檢測(cè)畸形率高達(dá)30.6%，與清水對(duì)照比較差異顯著。

表4 蕭山浦陽(yáng)5個(gè)樣品對(duì)熱帶爪蟾胚胎的影響

2.3 不同地點(diǎn)底泥、水樣和清水的比較

2.3.1 胚胎孵化率

由圖2可知，臨安官塘、余杭南湖區(qū)、余杭瓶窯、蕭山浦陽(yáng)4個(gè)地區(qū)的底泥、水樣對(duì)熱帶爪蟾的孵化率均無(wú)顯著影響。

2.3.2 胚胎存活率

由圖3可知，臨安官塘、余杭南湖、余杭瓶窯、蕭山浦陽(yáng)4個(gè)地區(qū)，除了余杭南湖區(qū)的底泥樣品、水樣與清水對(duì)照無(wú)顯著差異，其他3個(gè)地區(qū)的底泥、水樣與清水對(duì)照相比，對(duì)熱帶爪蟾的存活率均有顯著的影響。

水樣處理的熱帶爪蟾胚胎的存活率均顯著低于底泥提取液的胚胎存活率（除了蕭山浦陽(yáng)地區(qū)略有差異）。

圖2 對(duì)熱帶爪蟾胚胎孵化率的影響

圖3 對(duì)熱帶爪蟾胚胎存活率的影響

2.3.3 胚胎畸形率

由圖4可知，臨安官塘、余杭南湖區(qū)、余杭瓶窯、蕭山浦陽(yáng)4個(gè)地區(qū)之間相比，各采樣點(diǎn)的底泥和水樣均對(duì)熱帶爪蟾胚胎致畸作用有顯著差異，整體底泥提取液處理的熱帶爪蟾胚胎的畸形率高于水樣處理的（臨安官塘和蕭山浦陽(yáng)地區(qū)的樣品除外）。其中，蕭山浦陽(yáng)地區(qū)的底泥和水樣對(duì)熱帶爪蟾的畸形率與對(duì)照相比差異顯著。

圖4 對(duì)熱帶爪蟾胚胎畸形率的影響

3 討論

文獻(xiàn)表明斑馬魚(yú)、兩棲類動(dòng)物的早期胚胎對(duì)農(nóng)藥有很強(qiáng)的敏感度，并已廣泛應(yīng)用于致畸研究［14－15］。熱帶爪蟾作為一種新的模式生物，應(yīng)用于水質(zhì)的監(jiān)測(cè)尚在起步階段。但其經(jīng)濟(jì)成本低，效果明顯，已逐漸成為評(píng)價(jià)環(huán)境樣品毒性的生物［16］。稻田底泥和水樣中，由于常年積累的農(nóng)藥和其他污染物，對(duì)熱帶爪蟾胚胎有明顯的致死、致畸效果，其畸形表型可作為研究人類先天畸形的重要指標(biāo)［17］。本研究4個(gè)地區(qū)的底泥提取液和水樣對(duì)熱帶爪蟾胚胎的孵化率均無(wú)顯著影響。原因可能有：（1）樣品不含有影響孵化的因子；（2）對(duì)于熱帶爪蟾整個(gè)生命史來(lái)說(shuō)，暴露時(shí)間相對(duì)較短，顯示不出損傷效應(yīng)；（3）胚胎受精卵膜比較堅(jiān)韌，稻田殘留農(nóng)藥或其他有毒物質(zhì)不能進(jìn)入卵殼內(nèi)［18－19］。因此，熱帶爪蟾胚胎的孵化率在本研究中不適合作為檢測(cè)稻田污染物的生態(tài)毒性指標(biāo)。

本研究采樣時(shí)間在3－4月，正值大量使用的農(nóng)藥為除草劑。杭州地區(qū)稻田除草劑主要使用乙草胺、精惡唑禾草靈和丁草胺等。有研究顯示，稻田除草劑乙草胺和丁草胺從地表水、地下水，甚至飲用水中頻繁地被檢測(cè)出來(lái)［20－21］。本研究杭州地區(qū)的不同采樣點(diǎn)對(duì)熱帶爪蟾胚胎均有不同程度的致畸，其中蕭山浦陽(yáng)地區(qū)X1采樣點(diǎn)的底泥提取液的致畸率最高達(dá)19.3%（P＜0.05），X3采樣點(diǎn)的水樣致畸率最高達(dá)30.6%（P＜0.05）。也有研究顯示，乙草胺可以加速兩棲動(dòng)物甲狀腺激素（TH）的T3表達(dá)以及增加TRβ的mRNA水平上的表達(dá)，誘導(dǎo)前肢及尾部出現(xiàn)畸形等形態(tài)學(xué)上的改變［22－23］。另有研究表明，精惡唑禾草靈對(duì)土壤蚯蚓為微毒［24］，但低劑量可誘導(dǎo)鰷紅細(xì)胞微核及核異常的發(fā)生［25］，影響脊椎動(dòng)物的卵母細(xì)胞活力和生殖細(xì)胞的成熟［26］。此外，已有研究表明，不同的污染物導(dǎo)致熱帶爪蟾胚胎畸形現(xiàn)象也不一樣，且某些污染物能導(dǎo)致爪蟾胚胎產(chǎn)生獨(dú)特的畸形表型，如用環(huán)境濃度三丁基氯化錫（50～400 ng·L－1 TBTCL）對(duì)熱帶爪蟾胚胎進(jìn)行24 h、36 h和48 h暴露處理能夠?qū)е屡咛パ劬Ξ惓！⑿怪城煌怀龊亡捵冋榷喾N畸形現(xiàn)象［17］。隨著對(duì)不同污染物致畸機(jī)制的深入研究，熱帶爪蟾胚胎的畸形表型可為污染物識(shí)別提供幫助［27］。因此，熱帶爪蟾胚胎的致畸率可以作為稻田水樣和底泥污染物的生態(tài)毒性指標(biāo)。

部分采樣點(diǎn)的水樣毒性明顯高于底泥提取液，如蕭山浦陽(yáng)地區(qū)X3采樣點(diǎn)的水樣畸形率明顯高于底泥提取液的畸形率，其分別為4.2%和30.6%。主要原因是該點(diǎn)施藥時(shí)間短，還未沉積入稻田底泥，該藥水溶性好，不易被底泥吸附。而蕭山浦陽(yáng)地區(qū)稻田樣品的毒性顯著高于其他地區(qū)，主要原因是稻田水樣或者底泥被其他工業(yè)污染物污染。蕭山農(nóng)村地區(qū)不僅農(nóng)藥污染嚴(yán)重，而且工業(yè)污染嚴(yán)重。但總體來(lái)說(shuō)，4個(gè)采樣點(diǎn)的底泥提取液均可導(dǎo)致胚胎死亡或產(chǎn)生畸形現(xiàn)象，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，稻田底泥均有較強(qiáng)的毒性。與其他三地比較，蕭山浦陽(yáng)地區(qū)稻田底泥表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性，而且在檢測(cè)中相對(duì)比較穩(wěn)定，因此，蕭山浦陽(yáng)地區(qū)稻田底泥及水樣對(duì)熱帶爪蟾胚胎毒性較大，且可能會(huì)影響到稻田生物的多樣性，這有待于進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎檢測(cè)杭州地區(qū)稻田底泥的生態(tài)毒性，結(jié)果表明杭州地區(qū)的水稻田底泥和水樣對(duì)熱帶爪蟾胚胎的發(fā)育均有不同程度的毒性影響，與清水對(duì)照相比表現(xiàn)出畸形率顯著增加。其中，蕭山浦陽(yáng)地區(qū)采樣點(diǎn)的底泥和水樣污染物整體毒性高于臨安官塘、余杭瓶窯、余杭南湖區(qū)的水稻田樣品的毒性。該研究為監(jiān)測(cè)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染的生態(tài)毒性提供依據(jù)，為保護(hù)生物多樣性和水稻適宜生長(zhǎng)的環(huán)境奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

S 481；X 592

A

0528?9017（2015）11?1872?05

文獻(xiàn)著錄格式：應(yīng)夢(mèng)嬌，李星翰，瞿巧文，等.運(yùn)用熱帶爪蟾胚胎檢測(cè)杭州稻田的生態(tài)毒性［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（11）：1872－1876，1879.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151152

2015?08?03

浙江省自然基金（LY14B070014）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃（2014R412003）

應(yīng)夢(mèng)嬌（1992－），女，研究方向?yàn)樗锷鷳B(tài)毒理學(xué)。

尹曉輝。E?mail：yinxiaohui1229＠126.com。