柑橘抗寒相關(guān)基因及抗寒基因工程研究進(jìn)展

張真真，邱立軍，劉博文，徐超紅，徐建國(guó)

（1.舟山市定海區(qū)林業(yè)工作站，浙江舟山 316000；2.浙江省柑橘研究所，浙江臺(tái)州 318020）

柑橘抗寒相關(guān)基因及抗寒基因工程研究進(jìn)展

張真真1，邱立軍1，劉博文1，徐超紅1，徐建國(guó)2?

（1.舟山市定海區(qū)林業(yè)工作站，浙江舟山 316000；2.浙江省柑橘研究所，浙江臺(tái)州 318020）

柑橘是我國(guó)南方重要經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，而低溫是影響柑橘產(chǎn)量和分布的重要制約因素?；虿町惐磉_(dá)分析技術(shù)是尋找植物抗寒基因的重要技術(shù)手段，而基因工程是獲得植物抗寒品種的重要方法。本文綜述了利用基因差異表達(dá)分析技術(shù)獲得柑橘抗寒基因的方法，重點(diǎn)介紹了近年來(lái)在柑橘中已被分離鑒定的抗寒相關(guān)基因，分析了這些基因的抗寒功能及抗寒調(diào)控分子機(jī)制，并探討了通過(guò)基因工程轉(zhuǎn)化寒敏感柑橘的研究進(jìn)展。

柑橘；低溫誘導(dǎo)基因；抗寒基因；基因表達(dá)調(diào)控；基因工程

柑橘屬（Citrus）是全球產(chǎn)量最大的水果，同時(shí)我國(guó)柑橘年產(chǎn)量位居全球第一［1］。柑橘是亞熱帶植物，喜溫暖，對(duì)低溫的反應(yīng)敏感，所以低溫是影響柑橘品質(zhì)和產(chǎn)量的重要制約因素。同時(shí)低溫影響柑橘的區(qū)域分布，限制柑橘這一重要經(jīng)濟(jì)植物在我國(guó)廣大北方地區(qū)的栽培種植。因此，研究柑橘寒敏感原因，培育柑橘耐寒品種，對(duì)于提高柑橘品質(zhì)和產(chǎn)量，打破柑橘地域，促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展具有重大意義。

基因差異表達(dá)分析技術(shù)是尋找植物抗性基因的重要技術(shù)手段，而基因工程是獲得植物抗性品種的重要方法，因此利用基因差異表達(dá)和基因工程技術(shù)能夠獲得柑橘抗寒相關(guān)基因，揭示柑橘寒敏感本質(zhì)，有助于今后通過(guò)人工方法，調(diào)控柑橘抗寒過(guò)程，提高柑橘抗寒性，培育柑橘抗寒品種。迄今為止，已有80多篇涉及柑橘抗寒基因研究的文章發(fā)表，這些文章從柑橘屬植物溫州蜜柑、葡萄柚、甜橙中，分離鑒定了一部分低溫差異表達(dá)基因，分析了這些基因與植物抗寒性之間的關(guān)系，并通過(guò)基因工程轉(zhuǎn)化了部分柑橘類(lèi)寒敏感品種，從而增加柑橘抗寒性。

1 柑橘抗寒相關(guān)基因獲得方法

高等生物的基因表達(dá)不僅受到發(fā)育和組織特異性的影響，而且還受到環(huán)境變化的影響。任何細(xì)胞的基因90%是基礎(chǔ)性表達(dá)，只有10%是選擇性表達(dá)。而生物表現(xiàn)出來(lái)的各種特性，正是由于這10%基因的差異表達(dá)導(dǎo)致的，這里面包含了新基因的表達(dá)與表達(dá)量差異基因的表達(dá)。所以，分析低溫誘導(dǎo)下不同基因的表達(dá)差異，并克隆這些差異表達(dá)的基因與模式植物比對(duì)了解其抗寒功能，對(duì)于深入研究柑橘抗寒分子機(jī)理，獲得柑橘抗寒基因，轉(zhuǎn)化柑橘寒敏感品種，提高柑橘抗寒性具有重要作用。

獲得柑橘低溫差異表達(dá)基因的主要技術(shù)有mRNA差異顯示（mRNA differential display）、差別雜交（differential hybridization）、交互扣除RNA差別顯示技術(shù)（reciprocal subtraction differential RNA display）、扣除雜交（subtractive hybridization of cDNA）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization）、定量（quantitative interpretation）PCR、半定量（semi?quantitative interpretation）PCR、電子消減（electronic subtraction）、基因表達(dá)系列（serial analysis of gene expression）分析和DNA微列陣分析（DNA microarray）［2］。

2 柑橘抗寒相關(guān)基因及其作用

Weiser［3］在1970年首先提出，植物在抗寒性誘導(dǎo)過(guò)程中基因表達(dá)發(fā)生了改變。隨后利用各種基因差異表達(dá)分析技術(shù)，已在苜蓿、菠菜、冬小麥、馬鈴薯和冬油菜以及其他植物中，分離鑒定了多個(gè)與植物抗寒性相關(guān)的低溫誘導(dǎo)基因［4］，而柑橘植物的抗寒相關(guān)基因也在研究中越來(lái)越多地被分離鑒定出來(lái)。

在柑橘的抗寒性基因研究中，柑橘被認(rèn)為是對(duì)低溫比較敏感的植物，而同為蕓香科柑橘亞科的枳是與柑橘親緣關(guān)系很近的柑橘類(lèi)植物，常用做柑橘砧木，對(duì)低溫抗性好，耐寒［5］，是研究柑橘抗寒性很好的比較材料。在柑橘抗寒能力的研究過(guò)程中，科學(xué)家通過(guò)各種差異表達(dá)分析法在低溫脅迫的柑橘和枳中分離鑒定了一些低溫誘導(dǎo)基因，而這些基因的功能大多通過(guò)與模式植物中已知功能的抗寒基因進(jìn)行同源序列比對(duì)得知，并比較其抗寒性的差異，分析柑橘寒敏感分子機(jī)理，旨在獲得能夠提高柑橘抗寒性的基因。陳文榮等［6］利用mRNA差異顯示技術(shù)分析鑒定寒敏感佛手低溫脅迫相關(guān)的基因，最終獲得121個(gè)低溫差異片段，經(jīng)過(guò)半定量和生物學(xué)分析，最終確定29個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因，這些基因主要涉及植物防御／應(yīng)激反應(yīng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞壁修飾，轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)的合成和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)。張真真［2］研究了低溫脅迫前后這些基因在佛手和枳的表達(dá)量變化情況，其中14個(gè)基因在佛手中的表達(dá)發(fā)生變化，但在枳中表達(dá)量卻不變，這些基因可能與佛手寒敏感相關(guān)，它們所介導(dǎo)的分子途徑可能是揭示佛手寒敏感特性的有利證據(jù)。近15年來(lái)，柑橘類(lèi)植物低溫脅迫后分離鑒定的低溫誘導(dǎo)基因列于表1。

表1 近15年柑橘類(lèi)植物中分離鑒定的低溫誘導(dǎo)基因

在低溫脅迫后，植物能夠誘導(dǎo)體內(nèi)表達(dá)某些基因，這些基因的表達(dá)蛋白直接參與低溫脅迫應(yīng)答或間接調(diào)控其他靶基因的表達(dá)［20］。陳得波等［21］歸納了自馬鈴薯、黑麥、小麥、菠菜、苜蓿和大麥以及其他植物里面分離鑒定的62個(gè)低溫誘導(dǎo)基因，這些基因與植物抗寒能力有關(guān)系，而且這些基因的作用與膜脂相變、抗凍脫水、抗凍活性及低溫下酶活性的變化有關(guān)。從表1中已經(jīng)獲得的柑橘類(lèi)植物低溫誘導(dǎo)基因，分析其合成的蛋白在抗寒中的作用可以分為3大類(lèi)：1）編碼具有催化作用的蛋白；2）促進(jìn)新蛋白生成并附著細(xì)胞膜的表面或者鑲嵌在膜脂之間，對(duì)于細(xì)胞膜的冷穩(wěn)定性有促進(jìn)作用；3）作為蛋白調(diào)節(jié)因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和低溫表達(dá)過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用。下面對(duì)已經(jīng)被分離鑒定的與柑橘低溫誘導(dǎo)相關(guān)基因在抗寒方面的作用進(jìn)行介紹。

2.1 酶活性蛋白

柑橘在低溫脅迫過(guò)程中誘導(dǎo)合成具有催化作用的蛋白，參與一些重要的生理活動(dòng)，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）［19］、ACC合成酶［18］、硫氰酸酶［6］、甘油?3?磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶［22］、核苷二磷酸激酶Ⅲ［16］、氨基酸透酶［16］、酮還原酶［11］等。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是催化苯丙烷類(lèi)代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶。Sanchez?Ballesta等［19］從經(jīng)低溫脅迫下寒敏感的福瓊橘（Fortune）和耐寒的赫南蒂娜克力邁丁紅橘（Hernandina）中分離獲得2個(gè)全序列PAL1和PAL2。研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后寒敏感柑橘的PAL表達(dá)量升高而耐寒柑橘的PAL表達(dá)量和PAL活性均下降，表明低溫脅迫下PAL的表達(dá)量積累與柑橘受到低溫傷害有關(guān)，PAL表達(dá)量的變化是區(qū)分柑橘品種抗寒性強(qiáng)弱的一種指標(biāo)。

氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）合成酶基因ACS，是編碼乙烯合成的關(guān)鍵酶，乙烯主要調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種生理反應(yīng)，如植物逆境脅迫反應(yīng)。Wong等［18］從低溫脅迫的甜橙中分離鑒定了2個(gè)低溫誘導(dǎo)表達(dá)的ACC合成酶基因ACS1和ACS2，這2個(gè)基因不僅被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)也被傷害誘導(dǎo)表達(dá)。

硫氰酸酶具有植物組織解毒作用，能使細(xì)胞中有毒的氰化物，轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)毒的硫氰酸化合物。陳文榮等［6］在寒敏感的柑橘植物佛手中，獲得硫氰酸酶基因，這說(shuō)明即使是抗寒性差的柑橘植物種，也同樣會(huì)產(chǎn)生抗寒物質(zhì)，用于對(duì)抗低溫下氰化物積累對(duì)細(xì)胞造成的傷害。

Lang［16］和Zhang等［11］利用mRNA差異顯示和定量PCR技術(shù)，從低溫馴化的溫州蜜柑中獲得6個(gè)正調(diào)控低溫誘導(dǎo)基因，其中2個(gè)基因編碼具有催化作用的氨基酸透酶6和核苷二磷酸激酶Ⅲ。從低溫馴化的枳中獲得8個(gè)正調(diào)控基因，其中1個(gè)編碼具催化作用的酮還原酶。

2.2 冷保護(hù)蛋白

低溫傷害的主要部位是生物膜，研究表明低溫脅迫過(guò)程中柑橘誘導(dǎo)新的蛋白質(zhì)合成，附著于膜表面或位于膜脂間，具有保護(hù)細(xì)胞生物膜，維持水相，及防止蛋白變性等功能。如防止蛋白質(zhì)受凍而失活的COR（cold?regulated）蛋白［8，15］，保護(hù)細(xì)胞機(jī)能及抗脫水的LEA（late?embryogenesis abundant）蛋白［8］，及一些與LEA蛋白、脫水蛋白類(lèi)似的蛋白［23－25］。

在柑橘植物中報(bào)道最多的COR基因有COR11，COR15，COR19，這3個(gè)基因受低溫、高鹽、干旱等逆境誘導(dǎo)，能形成一類(lèi)獨(dú)特的LEA蛋白基因家族，均與柑橘的抗寒性相關(guān)。Porat等［8］從葡萄柚中獲得COR15基因，編碼一個(gè)15.1 ku的蛋白質(zhì)COR15。Hara等［15］從低溫馴化的溫州蜜柑葉片中獲得COR19基因，從枳中獲得CORc115基因和CORc119基因，分別編碼蛋白質(zhì)COR19和COR11。這2種基因和溫州蜜柑低溫誘導(dǎo)表達(dá)的COR19，氨基酸序列都富含賴(lài)氨酸豐富區(qū)［24］，且高度同源。溫州蜜柑作為柑橘中抗寒性較強(qiáng)的品種，在低溫脅迫下與抗寒性極強(qiáng)的枳均有COR19類(lèi)似蛋白的表達(dá)形成，表明該基因可增加溫州蜜柑的抗寒性。

另外Guy等［25］在低溫馴化柑橘葉片里，觀察到脫水蛋白CAP160和CAP85的累積，這體現(xiàn)出脫水蛋白參與了柑橘的抗寒過(guò)程。而且柑橘的CAP160與菠菜的CAP160無(wú)論分子量還是等電點(diǎn)都很相似，這體現(xiàn)了即使沒(méi)有親緣關(guān)系的植物同樣也能生成一樣的抗寒蛋白。2011年P(guān)orat等［17］在甜橙和葡萄柚熱激后的低溫誘導(dǎo)過(guò)程中獲得脫水蛋白基因DHN，熱激后冷藏時(shí)DHN的表達(dá)量明顯增加。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)葡萄柚在熱激后放在常溫下，被誘導(dǎo)增加表達(dá)的DHN是短暫的，而如果把熱激后的葡萄柚進(jìn)行冷藏，其誘導(dǎo)提高的DHN水平可以維持8周。Porat等［26］也曾有研究證實(shí)，柑橘冷藏前進(jìn)行熱處理可以提高柑橘儲(chǔ)藏期間抗寒性。

2.3 植物的AFP抗凍蛋白

抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）首先發(fā)現(xiàn)于極地的魚(yú)類(lèi)中，它們與其他冷誘導(dǎo)蛋白的基本區(qū)別是：降低溶液冰點(diǎn)、抑制重結(jié)晶、修飾冰晶形態(tài)［27］?？箖龅鞍譇FP已在冬黑麥、小麥、大麥、胡蘿卜、燕麥、冬青、苔蘚、裸子植物、細(xì)菌及真菌等生物中被發(fā)現(xiàn)［28－29］，目前未見(jiàn)柑橘類(lèi)植物獲得AFP的報(bào)道。

2.4 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor）指能結(jié)合基因上游特異核苷酸序列的蛋白質(zhì)并起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用，轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆、發(fā)育及生命活動(dòng)調(diào)控有重要聯(lián)系。轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用研究一直是柑橘抗寒研究的熱點(diǎn)，其中CBF（CRT／DRE binding factor）是目前柑橘中研究最深入的，參與低溫逆境應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子。CBF是啟動(dòng)低溫調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，含有AP2結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域能與COR基因的CRT／DRE結(jié)合，啟動(dòng)COR蛋白，從而提高植物抗寒性［30］。2007年Champ等［5］從枳和葡萄柚中分離獲得CBF，低溫誘導(dǎo)下枳的CBF1比葡萄柚的CBF1積聚更多且達(dá)到更高的表達(dá)水平，而且枳的CBF1能夠更迅速地識(shí)別并結(jié)合CRT／DRE片段，從而更早并更高水平地表達(dá)冷保護(hù)蛋白CORc115，從而增加枳的抗寒性。這項(xiàng)研究首次為2種親緣關(guān)系相近但是抗寒性差距較大的柑橘植物，提供其抗寒差異與CBF表達(dá)（數(shù)量、時(shí)間）和低溫脅迫程度相關(guān)性的證據(jù)。

乙烯應(yīng)答因子（ethylene response factor，ERF）轉(zhuǎn)錄因子家族基因也受低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，同樣具有AP2結(jié)構(gòu)，也在柑橘抗寒中起著重要作用。2011年曹詣斌等［12］通過(guò)RACE擴(kuò)增從枳和佛手中獲得ERF6，并使用定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)抗寒性不同的枳和佛手的ERF6低溫脅迫下表達(dá)變化量完全不同，低溫脅迫下佛手的ERF6表達(dá)量上升12倍，而枳的ERF6表達(dá)量上升4 000倍，說(shuō)明ERF6表達(dá)量的變化與柑橘品種的抗寒性差異呈現(xiàn)正相關(guān)。2006年Sahin?Cevik等［9］通過(guò)扣除雜交法在枳的低溫誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)中篩選獲得Pl?B05和Pl?C10 2個(gè)基因，均含AP2／ERF結(jié)構(gòu)域。在寒冷的不同時(shí)期對(duì)枳和葡萄柚的這2個(gè)基因表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因在枳中被誘導(dǎo)表達(dá)，葡萄柚中未被表達(dá)，說(shuō)明ERF轉(zhuǎn)錄因子與柑橘抗寒性具有重要相關(guān)性。

GRAS是高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、解毒作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物和非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程［31］。葉杰君等［14］2013年采用定量PCR，檢測(cè)GRAS基因在低溫脅迫的佛手、甌柑、本地早、處紅柚和枳，這5種抗寒性不同的柑橘中的表達(dá)量差異。這5種柑橘類(lèi)植物半致死溫度測(cè)定確定抗寒性強(qiáng)弱順序是枳＞本地早＞甌柑＞處紅柚＞佛手，最終發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下GRAS基因在這5種柑橘中表達(dá)量均上調(diào)，并且表達(dá)量上調(diào)的幅度大小與植株的抗寒能力的強(qiáng)弱呈正相關(guān)。

3 柑橘抗寒基因工程

柑橘抗寒基因工程是指將外源抗寒基因?qū)氲礁涕偌?xì)胞，并培養(yǎng)成整個(gè)植株的過(guò)程。近15年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了大量植物低溫誘導(dǎo)基因，并逐步探明低溫脅迫的分子機(jī)理，柑橘抗寒基因工程取得了巨大的進(jìn)步，通過(guò)導(dǎo)入植物抗寒基因進(jìn)而提高柑橘抗寒性的方法已成為現(xiàn)代柑橘育種的重要手段。植物抗寒基因主要包括，與膜脂不飽和相關(guān)的酶基因，防止低溫對(duì)細(xì)胞傷害的酶（SOD、脂脫氫酶）基因，抗凍及防止蛋白受凍失活的COR基因，抗脫水及保護(hù)胞體機(jī)能的LEA蛋白基因等。以下對(duì)柑橘中已有報(bào)道的抗寒基因工程途徑做具體的介紹。

3.1 魚(yú)類(lèi)抗凍基因途徑

抗凍蛋白（AFP）首先在魚(yú)類(lèi)中被發(fā)現(xiàn)，人們通過(guò)分離純化獲得高活性AFP，并篩選、克隆抗凍基因，以期能改良其他生物的抗凍性能，已有在昆蟲(chóng)和魚(yú)類(lèi)中獲得AFP基因成功轉(zhuǎn)化煙草和胡蘿卜的報(bào)道［32－33］。萬(wàn)巧蘭［34］利用含AFP基因的根癌農(nóng)桿菌菌株感染錦橙、椪柑和枳的實(shí)生苗上胚軸部分，經(jīng)卡那霉素篩選出抗性芽，并微嫁接成株，最后獲得3株轉(zhuǎn)基因柑橘（1株錦橙、2株枳）。通過(guò)Southern雜交和斑點(diǎn)雜交檢測(cè)證實(shí)AFP基因已整合到柑橘基因組中。該研究結(jié)果初步表明，這種動(dòng)物AFP能夠在柑橘細(xì)胞中得到表達(dá)，但對(duì)柑橘抗寒性的影響尚待進(jìn)一步研究。

3.2 脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因途徑

植物的細(xì)胞膜是整個(gè)細(xì)胞中對(duì)外界脅迫反應(yīng)最大的部位，所以細(xì)胞膜的組成成分與植物的抗寒性有著密切的關(guān)系。植物受到低溫脅迫時(shí)不飽和脂肪酸含量會(huì)增加，同時(shí)質(zhì)膜中磷脂含量及其與蛋白質(zhì)的比值也會(huì)發(fā)生改變。有研究發(fā)現(xiàn)74種植物的抗寒性與反式單不飽和磷脂酸的含量密切相關(guān)［35］，其不飽和度越高，抗寒性也就越強(qiáng)，因此在柑橘中導(dǎo)入脂肪酸去飽和酶基因，減少脂肪酸的飽和程度，能夠大大提高柑橘的抗旱能力。甘霖等［36］研究證明抗寒性強(qiáng)的金柑和宜昌橙葉片的亞油酸、棕櫚酸含量低，亞麻酸含量高，相對(duì)的脂肪酸不飽和度程度也高；然后抗寒能力比較差的哈姆林甜橙、伏令夏橙和粗檸檬卻與此相反，由此可見(jiàn)脂肪酸不飽和程度與質(zhì)膜的相變及流動(dòng)性有著密切關(guān)系。孫中海等［37］同樣認(rèn)為柑橘質(zhì)膜的不飽和程度與抗寒性呈正相關(guān)。

通過(guò)基因工程手段改變植物膜脂脂肪酸的組成，從而提高植物抗寒性的研究已有報(bào)道［23］。郭惠紅等［22］將從枳中獲得甘油?3?磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol?3?phosphat?e?acyl?transferase，GPAT）基因?qū)霚刂菝鄹毯吞鸪戎?，以提高這2個(gè)柑橘品種的抗寒性，GPAT是磷酰甘油PG生成的關(guān)鍵酶，很大程度上決定了細(xì)胞膜PG的不飽和度。

3.3 外源抗氧化酶基因途徑

低溫脅迫下寒敏感植物細(xì)胞膜的傷害，可能與活性氧的升高有關(guān)。細(xì)胞原本就具有抗氧化能力，能夠清除活性氧和自由基，其中包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等。細(xì)胞的抗氧化能力與柑橘的抗寒性呈正相關(guān)，因此細(xì)胞的氧化應(yīng)激機(jī)制可能是調(diào)節(jié)柑橘抗寒性的另一重要機(jī)制。Sala等［38］發(fā)現(xiàn)柑橘品種間的抗旱性能的不同主要在于CAT，GR對(duì)過(guò)氧化氫的清除能力不同，經(jīng)低溫馴化后的柑橘，體內(nèi)POD和SOD活性顯著增強(qiáng)，葉片抗寒能力也顯著提高。另一方面，有研究表明低溫馴化提升了柑橘細(xì)胞體內(nèi)抗氧化劑的含量和抗氧化酶活性，從而提高了柑橘的抗寒性。瞿金旺［39］利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將蘋(píng)果中獲得的亞精胺合成酶基因MSPDS1轉(zhuǎn)入金錢(qián)橘，設(shè)想通過(guò)基因工程技術(shù)手段來(lái)提高柑橘內(nèi)源多胺的含量，從而增強(qiáng)金錢(qián)橘抗寒性。研究結(jié)果表明低溫脅迫下轉(zhuǎn)入亞精胺合成酶基因MSPDS1的金錢(qián)橘葉片比對(duì)照植株葉片的相對(duì)電導(dǎo)率低，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗寒性。

4 前景展望

對(duì)柑橘抗寒基因的研究其最大意義在于通過(guò)基因工程方法提高一些寒敏感柑橘的抗寒能力。目前，已從魚(yú)類(lèi)抗凍基因途徑、脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因途徑、外源抗氧化酶基因途徑這3個(gè)方面取得了一定的進(jìn)展，其應(yīng)用前景非常廣闊［40］。柑橘作為重要的經(jīng)濟(jì)物種，在進(jìn)行抗寒育種的同時(shí)應(yīng)將基因工程技術(shù)手段與遺傳育種、化學(xué)調(diào)控及科學(xué)栽培方法相結(jié)合，以最終提高柑橘抗寒性，防止冷害，打破柑橘種植地域限制，提高柑橘品質(zhì)和產(chǎn)量。

［1］ 郭衛(wèi)東，張真真，蔣小韋，等.低溫脅迫下佛手半致死溫度測(cè)定和抗寒性分析［J］.園藝學(xué)報(bào)，2009，36（1）：81－86.

［2］ 張真真.佛手低溫脅迫相關(guān)基因的差異表達(dá)研究［D］.金華：浙江師范大學(xué)，2009.

［3］ Weiser C J.Cold resistance and injury in woody plants［J］. Science，1970，169：1269－1273.

［4］ 沈漫，王明麻，黃敏仁.植物抗寒機(jī)理研究進(jìn)展［J］.植物學(xué)通報(bào)，1997，14（2）：1－8.

［5］ Champ K I，F(xiàn)ebres V J，Moore G A.The role of CBF transcriptional activators in two citrus species（Poncirus and Citrus）with contrasting levels of freezing tolerance［J］. Physiologia Plantarum，2007，129（3）：529－541.

［6］ 陳文榮，葉杰君，李永強(qiáng)，等.佛手低溫脅迫相關(guān)基因的差異表達(dá)［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，33（5）：1594－1606.

［7］ Jia Y，Rio H S，Robbins A L，et al.Cloning and sequence analysis of a low temperature?induced gene from trifoliate orange with unusual pre?mRNA processing［J］.Plant Cell Reports，2004，23：159－166.

［8］ Porat R，Pavoncello D，Lurie S，et al.Identification of a grapefruit cDNA belonging to a unique class of citrus dehydrins and characterization of its expression patterns under temperature stress conditions［J］.Physiologia Plantarum，2002，115：598－603.

［9］ Sahin?cevik M，Moore G A.Two AP2domain containing genes isolated from the cold?hardy citrus relative Poncirus trifoliate are induced in response to cold［J］.Functional Plant Biology，2006，33（9）：863－875.

［10］ Sahin?cevik M，Moore G A.Isolation and characterization of a novel RING·H2 finger gene induced in response to cold and drought in the interfertile Citrus relative Poncirus trifoliata［J］. Physiologia Plantarum，2006，126（1）：153－161.

［11］ Zhang C K，Lang P，Dane F，et al.Cold acclimation induced genes of trifoliate orange（Poncirus trifoliata）［J］.Plant Cell Reports，2005，23（10／11）：764－769.

［12］ 曹詣斌，石瑞，陳文榮，等.低溫脅迫下佛手和枳乙烯應(yīng)答因子6（ERF6）表達(dá)變化的比較分析［J］.園藝學(xué)報(bào)，2011，38（10）：1873－1882.

［13］ Long G Y，Song JY，Deng Z N，et al.Ptcorp gene induced by cold stress was identified by proteomic analysis in leaves of Poncirus trifoliat a（L.）Raf［J］.Molecular Biology Reports，2012，39（5）：5859－5866.

［14］ 葉杰君.柑橘類(lèi)植物EF6和GRAS基因的低溫脅迫應(yīng)答及啟動(dòng)子序列分析［D］.金華：浙江師范大學(xué)，2013.

［15］ Hara M，Wakasugi Y，Ikoma Y.cDNA sequence and expression of a cold?responsive gene in Citrus unshiu［J］. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1999，63（2）：433－437.

［16］ Lang P，Zhang C K，Ebel R C，et al.Identification of cold acclimated genes in leavesof Citrusunshiu bymRNA differential display［J］.Gene，2005，359：111－118.

［17］ Porat R，Pasentsis K，Rozentzvieg D，et al.Isolation of a dehydrin cDNA from orange and grapefruit citrus fruit that is specifically induced by the combination of heat followed by chilling temperatures［J］.Physiologia Plantarum，2004，120：256－264.

［18］ Wong W S，Ning W，Xu P L，et al.Identification of two chilling?regulated 1?aminocyclopropane?1?carboxylate syntheses genes from citrus（Citrus sinensis Osbeck）fruit［J］.Plant Molecular Biology，1999，41（5）：587－600.

［19］ Sanchez?ballesta M T，Lafuente M T，Zacarlas L，et al. Involvement of phenylalanine ammonialyase in the response of Fortunemandarin fruits to cold temperature［J］.Physiologia Plantarum，2000，108：382－389.

［20］ Sahin?cevik M.Identification and expression analysis of early cold?induced genes from cold?hardy Citrus relative Poncirus trifoliata（L.）Raf［J］.Gene，2013，512（2）：536－545.

［21］ 陳得波，張愛(ài)平，姚泉洪.植物抗寒基因工程研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2001（4）：14－20.

［22］ 郭惠紅，高述民，李鳳蘭，等.植物抗凍蛋白和抗寒基因表達(dá)的調(diào)控［J］.植物生理學(xué)通訊，2003，39（6）：555－561.

［23］ Zhu L，Cai Z，Zhang Y，etal.Engineering stress tolerance ofEscherichia coli by stress?induced mutagenesis（SIM）?based adaptive evolution［J］.Biotechnology Journal，2014，9（1）：120－127.

［24］ Sahin?cevik M，Moore G A.Cold?induced dehydrins from Poncirus trifoliata localized in the nucleus［J］.Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology，2012，21（1）：134－139.

［25］ Guy C L，Haskell P，Yelenosk Y G.Changes in freezing tolerance and polypeptide content of spinach and citrus at 5℃［J］.Cryobiology，1988，25：264－271.

［26］ Porat R，Pavoncello D，Peretz J，etal.Effectsof variousheat treatments on the induction of cold tolerance and on the postharvest qualities of‘Star Ruby’grapefruit［J］.Postharvest Biology and Technology，2000，18（2000）：159－165.

［27］ 江勇，賈士榮，費(fèi)云標(biāo).抗凍蛋白及其在植物抗凍生理中的作用［J］.植物學(xué)報(bào)，1999，7（41）：687－692.

［28］ Griffith M，Ala P，Yang D S，et al.Antifreeze protein produced endogenously in winter rye leaves［J］.Plant Physiology，1992，100：593－596.

［29］ Dwnan JG，Olsen T M.Thermal hysteresis protein activity in bacteria，fungi，and phylogenetically diverse plants［J］. Cryobiology，1993，30：322－328.

［30］ Hsieh T H，Lee JT，Yang P T，et al.Heterology expression of the Arabidopsis C?repeat／dehydration response element binding factor I gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato［J］.Plant Physiology，2002，129（3）：1086－1094.

［31］ Li J，Yu C，Wu H，et al.Knockdown of a JmjC domain?containing gene JMJ524 confers altered gibberellin responses by transcriptional regulation of GRAS protein lacking the DELLA domain genes in tomato［J］.Journal of Experimental Botany， 2015，66（5）：1413－1426.

［32］ Worrall D，Ellas L，Ashford D，et al.A carrot leucine rich repeat protein that inhibits ice recrystallization［J］.Science，1998，282（5386）：115－117.

［33］ Kenward K D，Brandle J，Mcpherson J，et al.Type II fish antifreeze protein accumulation in transgenic tobacco does not confer frost resistance［J］.Transgenic Research，1999，8（2）：105－117.

［34］ 萬(wàn)巧蘭.柑橘離體形態(tài)建成及轉(zhuǎn)魚(yú)類(lèi)抗凍蛋白基因研究［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，1996：25－38.

［35］ Roughan P G.Phosphatidylglycerol and chilling sensitivity in plant［J］.Plant Physiology，1985，77：740－746.

［36］ 甘霖，孫中海，鄧秀新，等.柑橘體細(xì)胞雜種的抗性研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，1995，22（3）：209－214.

［37］ 孫中海，章文才，區(qū)勝祥，等.柑橘抗寒性與其膜脂脂肪酸組分的關(guān)系研究［J］.武漢植物學(xué)研究，1990，8（1）：79－86.

［38］ Sala JM，Lafuente M T.Catalase in the heat?induced chilling tolerance of cold?stored hybrid Fortune Mandarin fruits［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47：2410－2414.

［39］ 瞿金旺.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)亞精胺合成酶基因MdSPDSl的柑橘遺傳轉(zhuǎn)化及離體再生［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：12－16.

［40］ Zhang Z，Honda C，Kita M，et al.Structure and expression of spermidine synthase genes in apple：two cDNAsare spatially and developmentally regulated through alternative splicing［J］. Molecular Genetics and Genomics，2003，268（6）：799－807.

（責(zé)任編輯：張 韻）

S 666

A

0528?9017（2015）11?1845?06

文獻(xiàn)著錄格式：張真真，邱立軍，劉博文，等.柑橘抗寒相關(guān)基因及抗寒基因工程研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（11）：1845－1850.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151146

2015?07?02

浙江省果品農(nóng)業(yè)新品種選育（2012C12904）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS?27）

張真真（1983－），浙江舟山人，農(nóng)藝師，碩士研究生，主要從事浙江省特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)研究工作。E?mail：zhangzhenzhen1983＠sina.com。

徐建國(guó)。E?mail：xujg＠m(xù)ail.zaas.ac.cn。