卵泡液成分與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)性研究進(jìn)展

那　晶(綜述),湯小晗,盧美松(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕科室，哈爾濱 150001)

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卵泡液成分與卵母細(xì)胞質(zhì)量相關(guān)性研究進(jìn)展

那晶(綜述),湯小晗,盧美松※(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖健康與不孕科室，哈爾濱 150001)

摘要：在輔助生殖治療過程中，正確評估卵母細(xì)胞的質(zhì)量對于治療結(jié)局具有重要意義。對卵母細(xì)胞質(zhì)量的評估方法有許多種，卵泡液獲取方便，是目前對卵母細(xì)胞質(zhì)量評估的最理想非侵入性指標(biāo)。所以，卵泡液因子在評估卵母細(xì)胞質(zhì)量中備受關(guān)注。大量研究表明,卵泡液中的甾體激素水平、促性腺激素水平及卵泡液中一些細(xì)胞因子均與卵母細(xì)胞質(zhì)量具有相關(guān)性。近年來，卵泡液蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)的研究成為主要趨勢，也有望成為卵母細(xì)胞評估的重要工具。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；卵泡液；蛋白組學(xué)；代謝組學(xué)

卵母細(xì)胞的成熟是一個(gè)由多因素調(diào)控的復(fù)雜過程，對于卵母細(xì)胞質(zhì)量評估是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。對于成熟卵母細(xì)胞的選擇有許多方法，卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法較其他方法快速而且簡單，是目前臨床主要的選擇方法，然而，根據(jù)卵母細(xì)胞形態(tài)評估其質(zhì)量主觀影響因素較大[1]。有研究通過對卵母細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)的檢測[2]、對卵母細(xì)胞極體進(jìn)行活檢或研究特定基因在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞的表達(dá)[3]，從而對卵母細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)行準(zhǔn)確的評估，然后多損傷卵母細(xì)胞活力,因而不具有實(shí)用性，且這些技術(shù)大部分過程非常復(fù)雜，而且需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和消耗大量的時(shí)間，因此目前還沒有在臨床實(shí)踐中應(yīng)用。

卵泡液由血漿滲出物和卵巢局部分泌物組成，在卵泡發(fā)育、成熟、排卵、閉鎖過程中起重要的調(diào)控作用。卵泡液中的許多成分都隨著卵母細(xì)胞的生長發(fā)育發(fā)生動態(tài)變化，對卵母細(xì)胞的成熟起到正向或負(fù)向的作用，隨著研究的不斷發(fā)展，對于卵泡液的研究也逐漸成熟。現(xiàn)對卵泡液成分與卵母細(xì)胞質(zhì)相關(guān)性進(jìn)行綜述。

1卵泡液中激素水平與卵母細(xì)胞成熟度的相關(guān)性

1.1雌激素、孕激素、雄激素卵泡液中雌激素水平隨著卵泡的生長而逐漸升高，雌激素能促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟,因此血清中的雌激素水平曾被認(rèn)為是反映卵母細(xì)胞質(zhì)量的最好指標(biāo)[4]，目前仍在臨床上廣泛使用。另有研究表明，卵泡液中的雌激素水平不能很好地預(yù)測卵母細(xì)胞的質(zhì)量，雌激素與雄激素的比率或雌激素與孕激素的比率可以更好地評估卵母細(xì)胞質(zhì)量，研究指出卵泡液中雌激素與雄激素的比率>200，提示可獲得高比值的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞[5]。

針對卵泡液中孕激素水平的意義還存在爭議，Wiltbank等[6]研究發(fā)現(xiàn)排卵期卵泡液中孕激素濃度增加，卵母細(xì)胞成熟率增加，遠(yuǎn)期妊娠率也相對提升。另一方面,當(dāng)卵泡液中孕激素的水平較高，其卵母細(xì)胞多為過度成熟的卵母細(xì)胞，易導(dǎo)致受精異常,引發(fā)多核胚胎[7]。由此可見，卵泡液中孕激素水平的升高可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，但水平過高會導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化，但目前有關(guān)卵泡液中孕激素的閾值還沒有定論。

Uehara等[8]指出，卵泡液中雄激素的升高與卵母細(xì)胞質(zhì)量差以及卵母細(xì)胞受精后胚胎分裂率低有關(guān)，體外受精成功的患者其卵泡液中雌激素/雄激素比值高[5]。在卵泡液中低雌激素/雄激素比率可能與早期卵泡閉鎖有關(guān)。閉鎖卵泡的卵母細(xì)胞生存能力差，同時(shí)減少受精和懷孕的機(jī)會。卵泡液中雄激素微環(huán)境會導(dǎo)致卵泡閉鎖的觀點(diǎn)已被大家接受。但是，卵泡液中含有一定量的雄激素對于卵泡的良好生長是必要的也同樣被人們所認(rèn)可。

由于甾體激素間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，在評估卵母細(xì)胞質(zhì)量時(shí)多個(gè)激素指標(biāo)的應(yīng)用較單個(gè)指標(biāo)更有效。

1.2促性腺激素卵泡液中促卵泡生成素和促黃體生成素水平受其在體循環(huán)中水平影響。目前已有報(bào)道指出卵泡液中促卵泡生成素[9]、促黃體生成素[10]的高水平可以促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟，而且與提高受精有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，試管嬰兒最終成功的卵母細(xì)胞其所在的卵泡液中促黃體生成素持續(xù)性增高[10]。促性腺激素在顆粒細(xì)胞分泌過程中發(fā)揮重要作用，反過來影響卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟。促性腺激素還與雌激素有協(xié)同作用增強(qiáng)胞質(zhì)成熟的卵子和控制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，高促性腺激素水平會改善這些流程和帶來更好的卵母細(xì)胞,更好的胚胎和提高懷孕率。

1.3生長激素雖然已確定卵泡液中存在生長激素，但還沒有明確卵泡液中生長激素水平和妊娠之間的聯(lián)系。Lucy[11]指出生長激素對生殖細(xì)胞的作用為調(diào)節(jié)代謝活動或者控制胰島素樣生長因子的釋放從而促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，含有更高水平生長激素的卵泡中的卵母細(xì)胞體外受精的胚胎試管嬰兒的成功率相對較高[12]，生長激素似乎扮演類似(可能與促性腺激素協(xié)同)的角色，但是Tarlatzis等[13]持相反意見，他認(rèn)為相對于未妊娠的婦女，妊娠婦女卵泡中生長激素的水平低。針對生長激素對卵母細(xì)胞成熟的作用仍需進(jìn)一步證實(shí)。

1.4前列腺素前列腺素F2α由促性腺激素刺激下的顆粒細(xì)胞所分泌，在受精卵母細(xì)胞所在的卵泡液中其水平明顯增高[14]，前列腺素E2可以作為卵母細(xì)胞成熟的指標(biāo)。在哺乳動物的一項(xiàng)研究顯示,前列腺素E2可延遲卵母細(xì)胞核成熟。因此，生理濃度的前列腺素E2可能是卵母細(xì)胞成熟的信號，從而在最佳的時(shí)候取卵[15]。在含有成熟卵母細(xì)胞的卵泡液中，前列腺素E2和前列腺素F2α水平均有提高[16]。由于前列腺半衰期很短，其在卵泡液中的水平變化很快，對其的測量方法難度大，很多實(shí)驗(yàn)室不能對其測量，所以前列腺素在臨床上作為卵母細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)未被廣泛應(yīng)用。

2卵泡液中生長因子與卵母細(xì)胞成熟度的相關(guān)性

2.1轉(zhuǎn)化生長因子β超家族轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員眾多，擁有共同的結(jié)構(gòu)序列，包括轉(zhuǎn)化生長因子β、激活素/抑制素、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)，以及抗苗勒激素(anti-Müllerian hormone,AMH)。轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的很多成員在控制細(xì)胞生長和分化中起重要作用。在卵巢中，抑制素/激活素、BMP等在卵泡的生長、發(fā)育、成熟等過程中均起重要作用。

抑制素由顆粒細(xì)胞所分泌，在卵泡液中濃度反映相應(yīng)卵泡中顆粒細(xì)胞的數(shù)量與活性。研究發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量卵母細(xì)胞所在卵泡液中的抑制素B明顯增高[17]，可以作為一個(gè)卵泡生長發(fā)育的可靠標(biāo)志。

AMH對卵泡生長發(fā)育起重要作用[18]，由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生與分泌。Kim等[19]指出排卵前卵泡內(nèi)產(chǎn)生高水平的AMH。Fanchin等[20]表明，排卵期前卵泡液中AMH水平與胚胎植入呈正相關(guān)。相反，Cupisti等[21]發(fā)現(xiàn)，每個(gè)卵泡中AMH水平與卵母細(xì)胞的成熟和生長能力具有負(fù)相關(guān)性。對于排卵前卵泡液中AMH水平與卵母細(xì)胞質(zhì)量之間的關(guān)系仍有爭議。

BMP-15對卵母細(xì)胞的成熟和質(zhì)量也有重要作用。有研究指出卵泡液中高BMP-15組在種植率、臨產(chǎn)率、活產(chǎn)率均高于低BMP-15組[22]。Otsuka等[23]指出BMP-15在卵母細(xì)胞的生長發(fā)育過程中扮演重要角色，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。BMP-15 與卵母細(xì)胞的質(zhì)量和胚胎的發(fā)育有正相關(guān)性，可對輔助生殖的治療結(jié)局行初步的預(yù)測[22]。

2.2胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)IGFs是一條多肽，能促進(jìn)多種類型細(xì)胞增殖和分化，其生物效應(yīng)由相應(yīng)的結(jié)合蛋白(IGFBP-1~6)調(diào)控。研究表明，卵巢及卵泡液中的IGFs系統(tǒng)與卵泡的生長、成熟、優(yōu)勢卵泡的選擇、卵泡的閉鎖及卵子的成熟度密切相關(guān)[24]，在卵泡生長過程中調(diào)節(jié)芳香化酶活性和雌激素的產(chǎn)生。臨床研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中高IGF-1組比低IGF-1組顯示出更高的受精率、卵裂率、囊胚形成率和高質(zhì)量胚胎形成率[25]。取卵日卵泡液中IGF-2、IGFBP-3、IGFBP-4 水平與卵母細(xì)胞的受精、胚胎分裂與發(fā)育均有顯著正向關(guān)系[26]。Pereira等[27]報(bào)道，生長激素與IGFs協(xié)同,共同促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。

3卵泡液中細(xì)胞因子與卵母細(xì)胞成熟度的相關(guān)性

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α主要由巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，通過誘導(dǎo)卵母細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及顆粒細(xì)胞凋亡,參與卵泡的閉鎖過程。從卵巢對促性腺激素的反應(yīng)來看,隨著獲卵數(shù)量的增加,卵泡液中TNF-α水平逐漸降低，表明當(dāng)卵泡液TNF-α水平升高時(shí)獲卵數(shù)減少,可能是TNF-α通過抑制顆粒細(xì)胞對雌激素及孕激素的合成致使卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性下降[28]。進(jìn)一步的研究也證實(shí)，卵泡液中TNF-α水平與胚胎質(zhì)量和妊娠關(guān)系密切，TNF-α水平越低,胚胎質(zhì)量越好,妊娠率就越高[28]。

在卵泡成熟至排卵期間，卵巢合成和分泌促炎性細(xì)胞因子到卵泡液中。Zollner等[29]研究指出卵泡液中白細(xì)胞介素1β與卵母細(xì)胞受精率呈正相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)其與胚胎發(fā)育具有相關(guān)性。Lédée 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，形成早期卵裂胚胎的卵母細(xì)胞所對應(yīng)的卵泡液中含有較高水平的白細(xì)胞介素2和干擾素γ；卵泡液中高水平的集落形成刺激因子提示胚胎具有較高的植入潛能。

4卵泡中氧化應(yīng)激與卵母細(xì)胞成熟度相關(guān)性

卵泡中氧含量和線粒體活動是維持卵母細(xì)胞良好生長發(fā)育的因素。通過研究卵泡的周圍血管形成和氧化作用可以獲得不同卵母細(xì)胞發(fā)育能力的信息。氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)DNA損傷,引發(fā)細(xì)胞凋亡。卵泡嚴(yán)重缺氧會導(dǎo)致其內(nèi)卵母細(xì)胞出現(xiàn)減數(shù)分裂異常的可能性增高,從而增加非整倍染色體胚胎，且缺氧的卵泡所包含的卵母細(xì)胞多為胞質(zhì)缺陷。

活性氧類是正常有氧代謝的產(chǎn)物。Askocylaki等[31]指出卵泡液中少量活性氧類有利于卵母細(xì)胞的發(fā)育，然而活性氧類水平過高誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對卵母細(xì)胞產(chǎn)生負(fù)面作用[32]。卵泡液中活性氧類的低水平可以作為試管嬰兒成功的預(yù)測指標(biāo)，高活性氧類水平是影響受精的一個(gè)病理因素，一些內(nèi)源性的抗氧化劑可以中和活性氧類的有害作用，如超氧化物歧化酶、硒依賴性的谷胱甘肽過氧化物酶。有研究發(fā)現(xiàn)，受精卵母細(xì)胞卵泡液中總抗氧化能力相對比未受精的高[33]?？偪寡趸芰λ降纳呖梢宰鳛槌墒炻雅莸臉?biāo)志，從而獲得高質(zhì)量的卵母細(xì)胞。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)主要有顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生，可增加卵泡的促性腺激素和缺氧的反應(yīng)，從而對卵泡周圍血管的生成和調(diào)節(jié)卵泡供氧具有重要作用，VEGF水平過高可能引起卵巢過度刺激綜合征[34]。有研究指出，卵泡液中VEGF水平與卵巢反應(yīng)性和卵母細(xì)胞的成熟呈負(fù)相關(guān)性[35]，高水平的VEGF還與胚胎形態(tài)差和體外受精-胚胎移植妊娠率降低有關(guān)。在人工助孕過程中，VEGF可以用來排除卵母細(xì)胞處于缺氧的環(huán)境，但是到目前為止，VEGF的檢測比較昂貴，且耗時(shí)久，所以沒有在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。

5卵泡液的蛋白組學(xué)與卵母細(xì)胞成熟度的相關(guān)性

卵泡液中含有許多蛋白物質(zhì)，主要來源于血漿滲透及顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞分泌產(chǎn)生，有研究指出可以通過分析卵泡液中蛋白質(zhì)的組成對卵母細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行評估[36]。卵泡液中蛋白組成復(fù)雜多樣且動態(tài)變化，所以急需一個(gè)敏感的、高選擇性的蛋白分離技術(shù)。

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是蛋氨酸代謝產(chǎn)物，在卵泡生長發(fā)育過程中，Hcy促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞閉鎖。卵泡液中高Hcy(>14.7 μmol/L)氧化產(chǎn)生過多自由基，不利于卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，從而降低胚胎質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，卵泡液中Hcy水平與相應(yīng)卵母細(xì)胞成熟率、受精率、胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)性[38]。由于葉酸可以降低卵泡和血清中Hcy的水平，這樣可以解釋妊娠前后葉酸對于人工助孕成功的積極影響。

還有報(bào)道指出免疫抗原[39]、血管緊張素Ⅱ[40]、乳鐵蛋白[41]等在卵泡液中的濃度與相應(yīng)卵細(xì)胞的質(zhì)量有關(guān)，但均需要進(jìn)一步研究與證明。總的來說，目前對于卵泡液中蛋白組學(xué)的了解及在卵泡生長和卵細(xì)胞成熟中的作用還是相對局限的。

6卵泡液的理化性質(zhì)與卵母細(xì)胞成熟度的相關(guān)性

除了生物特性，專家對于卵泡理化性質(zhì)與相應(yīng)的卵母細(xì)胞之間的相關(guān)性也進(jìn)行了研究。人類卵泡液在可見光譜的分光光度吸收值顯示了兩個(gè)不同的峰值分別在波長415 nm和455 nm。研究發(fā)現(xiàn)，成熟卵母細(xì)胞的卵泡液的吸光度明顯高于這兩個(gè)峰值[42]。目前，無論是卵泡液的黏度還是折射率沒有發(fā)現(xiàn)與卵母細(xì)胞的成熟度及受精能力有關(guān)[42]。

7卵泡液代謝組學(xué)與卵母細(xì)胞成熟度的相關(guān)性

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的一個(gè)新的組學(xué)研究熱點(diǎn)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)，定量分析特定時(shí)期特定生理?xiàng)l件下細(xì)胞體系中所有的代謝物。代謝物可以代表基因的信息表達(dá)和功能細(xì)胞表型之間的交流。它們的數(shù)量比一個(gè)細(xì)胞或者一個(gè)有機(jī)體的基因和蛋白要少許多。所以，分析代謝物比分析基因或者蛋白要快許多。

代謝物是許多生物系統(tǒng)模式識別系統(tǒng)的一致信息技術(shù)，并應(yīng)用于人類胚胎和卵母細(xì)胞的研究。在特定的生理?xiàng)l件下和時(shí)間點(diǎn)，代謝組學(xué)是識別和確定在一個(gè)生物流體中的所有代謝物。代謝物是細(xì)胞正常活動的最終產(chǎn)物的代表；可以側(cè)面描述卵母細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的化合物，當(dāng)取回卵母細(xì)胞其不再增加。對卵母細(xì)胞及其體外培養(yǎng)基的整體代謝分析比有針對性的代謝方法和研究選取某一種物質(zhì)評估卵母細(xì)胞質(zhì)量用處更大。關(guān)于卵母細(xì)胞質(zhì)量評估的相關(guān)研究已經(jīng)在動物模型中擬行實(shí)驗(yàn)，并著手選擇一類代謝物進(jìn)行分析，如脂肪酸、氨基酸或者糖。目前有研究指出卵泡液中總游離脂肪酸和三酰甘油水平與輔助生殖治療結(jié)局呈負(fù)相關(guān)性[43]。Preis等[44]研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞可以吸引大量的糖并把它們轉(zhuǎn)化為乳糖，從而展示其高受精能力。另有研究通過測量能量底物[45]或者在培養(yǎng)基中的耗氧量[40]來評估卵母細(xì)胞的質(zhì)量。卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中氧含量可以通過特殊敏感的感受器測量，假定它反映線粒體產(chǎn)生活動必要的生產(chǎn)發(fā)展所需的能源,它已被證明與細(xì)胞的生存能力相關(guān)[46]。

在未來的研究中，對取卵時(shí)獲得的卵泡液進(jìn)行代謝組學(xué)分析可能對預(yù)測卵母細(xì)胞質(zhì)量提供更多的信息。代謝組學(xué)研究的預(yù)測價(jià)值要通過新技術(shù)實(shí)現(xiàn)，可以通過一個(gè)分析平臺確定代謝物的變化范圍。有關(guān)卵泡液中代謝物與人類卵母細(xì)胞發(fā)育潛能關(guān)系的研究以及成為應(yīng)用到臨床上的無創(chuàng)技術(shù)需要大規(guī)模前瞻性的研究。

8結(jié)語

正確地評估卵母細(xì)胞的質(zhì)量，挑選優(yōu)質(zhì)的卵細(xì)胞，形成優(yōu)質(zhì)的胚胎，一方面可以提高體外受精臨床妊娠率，另一方面可以減少多胚胎移植。卵泡液具有取材方便、無損傷性等優(yōu)勢，所以通過卵泡液評估卵母細(xì)胞質(zhì)量是最理想的方法。目前，大多數(shù)研究目的主要在卵泡液中找到一個(gè)好的分子可預(yù)測其與卵母細(xì)胞質(zhì)量之間的相關(guān)性，這些指標(biāo)還需要大樣本、隨機(jī)對照研究的證實(shí)才能應(yīng)用于臨床。將卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)、卵泡液中分子預(yù)測及卵泡液代謝組學(xué)整合的看，可以提供更多的準(zhǔn)確信息，幫助選擇更好的卵母細(xì)胞。

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Research Progress of the Correlation of Follicular Fluid Composition and Oocyte QualityNAJing,TANGXiao-han,LUMei-song.(DepartmentofReproductiveHealth,theFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract：During the treatment of assisted reproduction,it is very important for the treatment outcomes to correctly evaluate the quality of oocytes.There are many kinds of methods for the evaluation of quality of oocytes,since the extraction of follicular fluid could be easily acquired,it is currently the most ideal non-invasive index for evaluation of oocytes quality.Therefore,follicular fluid factors have got much attention in the evaluation of oocytes quality.A large number of studies showed that the levels of steroid hormone,gonadotropin and some cytokines in the follicular fluid are associated with the quality of oocytes.In recent years,proteomics of follicular fluid and metabonomics have become a major trend,which hopefully will become an important tool for oocytes evaluation.

Key words：Oocytes； Follicular fluid； Proteomics； Metabonomics

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-04-14編輯：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.016

中圖分類號：R715.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)21-3886-04