胃蛋白酶水解紅豆蛋白工藝研究

張變玲，張 儒，賀 婷，陽吉平, 景 卓

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104)

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胃蛋白酶水解紅豆蛋白工藝研究

張變玲，張 儒，賀 婷，陽吉平, 景 卓

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湘潭 411104)

研究胃蛋白酶對紅豆蛋白的水解工藝.考察酶濃度、pH、溫度、水解時間等因素對紅豆蛋白水解度的影響.結(jié)果表明：制備的胃蛋白酶能夠較好地水解紅豆蛋白，其最佳水解工藝為：溫度40 ℃、酶濃度7 U/g干蛋白、pH1.5、水解時間4 h，其最佳水解度為30.97%.

胃蛋白酶；紅豆蛋白；水解度

0 前 言

蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶促水解作用后主要以低肽(特別是二肽和三肽)的形式被直接吸收，低肽的吸收率比氨基酸大，且比完全游離氨基酸更易、更快被機(jī)體吸收利用[1-2]；此外，某些低肽不僅能提供人體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)，還具有重要的生理功能，如促進(jìn)礦物質(zhì)吸收、防治肝性腦病、促進(jìn)消化吸收、抑制膽固醇、機(jī)體防御、增加脂肪組織代謝等[3].近年來，這些生物活性肽的研究在食品營養(yǎng)學(xué)界引起廣泛的重視.在植物來源的低肽中，大豆肽的研究比較系統(tǒng)和深入[4]，而且已有幾種大豆肽產(chǎn)品得到商品化生產(chǎn).此外，綠豆肽、花生肽、核桃肽、玉米肽、大米肽和小麥肽等的研究已有報道.而紅豆作為我國傳統(tǒng)的藥食兼用和營養(yǎng)豐富的食物，其蛋白肽的研究甚少.

紅豆(Phaseolus angularis)又稱赤豆，為菜豆屬豆科草本植物赤小豆或赤豆的成熟種子，顏色淡紅、鮮紅或深紅[5].紅豆?fàn)I養(yǎng)價值高，氨基酸種類齊全，口感好，是食品加工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原材料，而且蛋白質(zhì)含量高，平均達(dá)22.65%，比禾谷類蛋白質(zhì)含量高2～3倍[6].我國傳統(tǒng)食用紅豆的方式除直接食用外，主要用于加工制成豆沙或者豆餡，再制成各種主副食品，而忽略了對紅豆蛋白的開發(fā)，造成紅豆資源浪費(fèi).

胃蛋白酶(pepsin)是一種酸性天冬氨酸蛋白水解酶類，其前體為胃蛋白酶原，在pH1.5～5.0條件下，被活化成胃蛋白酶[7].胃蛋白酶被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類的水解等[8-10].本文參考文獻(xiàn)[11]方法，采用雙水相萃取法從豬胃中制備胃蛋白酶，研究各因素對酶水解反應(yīng)的影響，從而確定豬胃蛋白酶水解紅豆蛋白制備紅豆蛋白肽的可行性及最佳工藝，既提高了生豬副產(chǎn)物的利用率，又為紅豆蛋白肽的研究及新的植物活性肽的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).因此，研究豬胃蛋白酶水解紅豆蛋白工藝有較高的應(yīng)用價值.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆，購于步步高湘潭分公司；紅豆蛋白粉，自制；豬胃蛋白酶，自制；PEG1000，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清清蛋白，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸、硫酸銨、鹽酸、乙酸、甲醇、乙醇、甲醛、氫氧化鈉、酚酞等均為分析純.

BS323S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；UV-2102PCS型紫外-可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司)；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)(賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；85-2集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(常州澳森電器有限公司)；NH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司).

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃蛋白酶的制備及活力測定

[11]方法，選擇成年豬胃，剝?nèi)∝i胃基底部粘膜，液氮迅速冷凍，用研缽磨碎，制成胃粉.以聚乙二醇/硫酸銨雙水相萃取分離得到豬胃蛋白酶，并測定其活力.

1.2.2 紅豆蛋白粉的制備[12]

紅豆→清洗→除雜→研磨→粉碎70目過篩→浸泡→攪拌→調(diào)pH值至8～10→離心→上清液→調(diào)pH值4.2或5.0→離心→沉淀→干燥→蛋白成品(得率為18.8%)

1.2.3 水解工藝

配制6%的紅豆蛋白溶液，在一定溫度下保溫10 min，達(dá)到反應(yīng)的溫度后，調(diào)pH至適當(dāng)值，加入一定量的豬胃蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng).以1 mol/L NaOH溶液滴定使pH不變，反應(yīng)一定時間后，取出水解液，立即置于沸水浴中加熱10 min，滅活酶以終止酶解反應(yīng).酶解液3000 r/min離心15 min，取上清液測定水解度.

1.2.4 紅豆蛋白水解度的測定

采用甲醛滴定法測定水解度(DH)[13].

1.2.5 紅豆蛋白水解條件優(yōu)化

1.2.5.1 酶濃度的選擇

將紅豆蛋白溶液的pH值調(diào)至1.5，反應(yīng)溫度為40 ℃，分別在豬胃蛋白酶濃度為0.5、1.5、3.0、5.0、7.0和9.0(U/g干蛋白質(zhì))的條件下，水解紅豆蛋白3 h，以DH為指標(biāo)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析不同加酶量對紅豆蛋白水解反應(yīng)的影響，以初步確定豬胃蛋白酶水解紅豆蛋白的合適酶濃度范圍.

1.2.5.2 酶解溫度的選擇

將紅豆蛋白溶液的pH值調(diào)至1.5，分別置于6個不同的反應(yīng)溫度30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和60 ℃，按照1.2.5.1實(shí)驗(yàn)所測最適酶濃度5.0 U/g干蛋白分別加入胃蛋白酶，水解紅豆蛋白3 h，以DH為指標(biāo)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析不同溫度對紅豆蛋白水解反應(yīng)的影響，以初步確定胃蛋白酶水解紅豆蛋白的合適反應(yīng)溫度范圍.

1.2.5.3 酶解pH的選擇

分別采用1.2.5.1和1.2.5.2測定的最適酶濃度5.0 U/g和最適水解溫度40 ℃，在溶液pH值分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5的條件下，對紅豆蛋白溶液進(jìn)行酶解反應(yīng)3 h，以DH為指標(biāo)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析不同pH對水解反應(yīng)的影響，以初步確定胃蛋白酶水解紅豆蛋白的合適pH范圍.

1.2.5.4 酶解時間的選擇

分別采用1.2.5.1、1.2.5.2和1.2.5.3測定的最適酶濃度5.0 U/g、最適水解溫度40 ℃和最適反應(yīng)pH1.5，在水解時間分別為1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和7.0 h的條件下對紅豆蛋白溶液進(jìn)行酶解反應(yīng)，以DH為指標(biāo)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析不同水解時間對水解反應(yīng)的影響，以初步確定胃蛋白酶水解紅豆蛋白的合適反應(yīng)時間范圍.

1.2.5.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝

以胃蛋白酶的水解度為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各因素的水平值范圍進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，按L9(34)正交表安排試驗(yàn)(見表1)，優(yōu)化酶解條件.

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表L9(34)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶濃度對紅豆蛋白水解度的影響

酶濃度對紅豆蛋白水解度的影響結(jié)果見圖1，從圖中可以看出，當(dāng)酶濃度從0.5 U/g干蛋白逐漸增大時，蛋白質(zhì)水解度總體呈現(xiàn)增加趨勢，其中酶濃度在0.5～5 U/g干蛋白時，水解度增長趨勢較快，酶濃度為5～9 U/g干蛋白時，水解度增加比較緩慢.酶法水解紅豆蛋白的過程中適量的酶對酶解具有積極的意義，但酶過量時，酶反應(yīng)體系中酶使料液的粘度過大，影響了酶和底物的流動，也降低了酶作用效果，同時也增加了成本.但酶量過少時，使酶分子與底物分子碰撞的幾率降低，酶作用效果降低.因而酶的使用濃度在3～7 U/g干蛋白范圍內(nèi)效果較好.

圖1 胃蛋白酶濃度對水解度的影響

2.2 溫度對紅豆蛋白水解度的影響

圖2 溫度對水解度的影響

溫度對水解度的影響結(jié)果見圖2，從圖2中可以看出在溫度為30～40 ℃之間隨溫度升高水解度逐漸增大，但是之后隨溫度增加水解度逐漸降低.溫度對酶促反應(yīng)的影響有兩個方面，一般情況下溫度提高可使反應(yīng)速度加快；二是隨著溫度的提高，酶失活速度也開始加快，因考慮到溫度控制，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，胃蛋白酶水解紅豆蛋白的最適溫度范圍40 ℃左右.

2.3 pH對紅豆蛋白水解度的影響

pH對紅豆蛋白水解度的影響結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，隨著溶液pH的增加，蛋白質(zhì)的水解度逐漸增加，當(dāng)pH為1.5時，蛋白質(zhì)水解度最高，達(dá)29.69%.而后隨著pH的增加，蛋白質(zhì)水解度逐漸降低，蛋白質(zhì)水解度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢.其主要原因是胃蛋白酶屬于酸性蛋白酶，分子量為42.2 ku，胃中是以胃蛋白酶原形式存在，在胃酸或已激活的胃蛋白酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?4.1 ku的具有活性的胃蛋白酶[7].在傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝中，胃蛋白酶中含有一定量的胃蛋白酶原，因而pH對酶的活性影響甚大，強(qiáng)酸處理使其在體外轉(zhuǎn)化成胃蛋白酶，進(jìn)而增加其對蛋白質(zhì)的酶解能力.因此胃蛋白酶水解紅豆蛋白的最適pH范圍為1.5左右.

圖3 pH對水解度的影響

2.4 時間對紅豆蛋白水解度的影響

時間對水解度的影響結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，隨著酶解時間的增加，蛋白質(zhì)水解度先是顯著升高，當(dāng)水解時間為3.5 h時水解度達(dá)到29.06%，之后，隨著水解時間的進(jìn)一步延長，水解度升高趨于平緩.一般來講，要達(dá)到同樣的水解率，水解時間與酶的用量有關(guān)，酶的用量大，水解時間可以縮短.加酶量相同，時間越長，水解率越高，但達(dá)到一定的時間后上升趨勢減緩，綜合考慮到能耗、生產(chǎn)周期及防止水解液變質(zhì)等因素.因此，胃蛋白酶水解紅豆蛋白的最適水解時間范圍為3.5 h左右.

圖4 時間對水解度的影響

2.5 胃蛋白酶水解紅豆蛋白的最佳工藝確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取適宜因素水平進(jìn)行4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對影響胃蛋白酶水解紅豆蛋白的4個因素(酶濃度、溫度、pH和水解時間)進(jìn)行極差分析，表明各因素的主次順序?yàn)锽>A>C>D，即：溫度>酶濃度>pH>水解時間，溫度對紅豆蛋白的水解程度影響比較顯著，極差分析可知4個因素的優(yōu)選方案為：A3B2C2D3，但是表2中8號實(shí)驗(yàn)組合A3B2C1D3的水解度最高，為29.77%，和優(yōu)選方案組合A3B2C2D3不一致，故對極差分析所得優(yōu)選方案組合A3B2C2D3和8號實(shí)驗(yàn)組合A3B2C1D3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果8號實(shí)驗(yàn)組合水解度為29.71%，極差分析所得優(yōu)選方案水解度為30.97%，所以最佳實(shí)驗(yàn)組合為A3B2C2D3，即酶濃度7 U/g干蛋白、溫度40 ℃、pH1.5和水解時間4 h.

3 結(jié) 論

采用雙水相萃取方法所制備的豬胃蛋白酶能夠較好的水解紅豆蛋白，在此水解工藝中，影響紅豆蛋白水解度的因素主次序?yàn)闇囟?酶濃度>pH>水解時間，其最佳水解工藝為：溫度40 ℃、酶濃度7 U/g干蛋白、pH1.5、水解時間4 h，水解度為30.97%.

參 考 文 獻(xiàn)

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Preparation Technology of Peptides by Pepsin Hydrolyzation of Proteins Isolated From Red Bean

ZHANG Bian-ling, ZHANG Ru, HE Ting,YANG Ji-ping, JING Zhuo

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan 411104, China)

Red bean protein is hydrolyzed by pepsin from stomach of swine. The effects of enzyme concentration, temperature, pH and time on enzymatic hydrolysis are discussed. The results show that the optimal conditions for producing peptides from red bean protein by pepsin are enzyme concentration of 7 U/g dry protein, pH of 1.5, the temperature of 40℃ and hydrolysis time 4.0 h. The degree of hydrolysis is 30.97%.

pepsin; red bean protein; degree of hydrolysis

2014-12-09

湖南省教育廳科研資助項(xiàng)目(11C0329)；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項(xiàng)目(201411342004)；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計劃項(xiàng)目(湘教通[2014]248號).

張變玲(1982-)，女，碩士，講師，研究方向：天然活性成分開發(fā)與利用.

張 儒(1979-)，男，博士，講師，研究方向：天然活性成分生物合成調(diào)控與開發(fā)利用.

R284.2

A

1671-119X(2015)02-0073-04