不同儲存時間血液制備洗滌紅細胞效果分析

李美霖 段錦 麻靜敏 車進 張燕華 李天君

洗滌紅細胞經(jīng)0.9%氯化鈉溶液洗滌，去除了其中大部分血漿、白細胞和血小板［1］，可減少非溶血性發(fā)熱反應(NHFTR)和血漿蛋白所致的過敏反應，減少或降低輸血傳播病毒的概率。雖然洗滌紅細胞只能保留70%～80%的原紅細胞，保存期較短，但臨床貧血患者和緊急輸血時均首選洗滌紅細胞［2，3］，所以臨床需求呈上升趨勢。2012年7月衛(wèi)生部發(fā)布的《全血及成分血質量要求》(GB18469-2012)［4］將洗滌紅細胞質量控制項目中的“紅細胞回收率”調整為“血紅蛋白含量”，“血漿蛋白清除率”調整為“上清蛋白質含量”，并增加了對洗滌紅細胞“溶血率”(≤0.8%)的要求。新國標僅規(guī)定使用保存期內的全血或懸浮紅細胞制備洗滌紅細胞，并未對原料血的儲存時間進行規(guī)定。我們在對CPDA-1方全血制備的懸浮紅細胞儲存期內溶血率調查中發(fā)現(xiàn)懸浮紅細胞溶血率隨儲存天數(shù)增加成進行性增加，儲存期末溶血率指標不符合率為1.25%［5］。因此，為了監(jiān)測以不同儲存時間懸浮紅細胞為原料制備的洗滌紅細胞的質量，我們對不同保存時間的懸浮紅細胞所制備的洗滌紅細胞血紅蛋白含量、上清蛋白質含量、血漿游離血紅蛋白含量進行了檢測，同時分析產(chǎn)品溶血情況，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 一次性使用塑料血袋(山東威高，批號:13070242)，四聯(lián)袋0.9%氯化鈉溶液(費森尤斯卡比，批號:85GG20AD004)，XS-500i血細胞計數(shù)儀(日本Sysmex公司)，M-300型半自動生化分析儀(Vital Scientific公司)，PC203型分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，fresco離心機(SORVALL)，電熱恒溫水箱(北京市醫(yī)療設備廠)，血漿游離血紅蛋白試劑盒(Trinder法)(北京瑞爾達公司，批號:150108);腦脊液與尿蛋白測定試劑盒(終點法)(北京利德曼公司，批號:402201L)，大容量離心機(Thermo公司)，無菌管路對接機(日本Terumo公司)，電子天平(美國雙杰兄弟公司)。

1.2 方法

1.2.1 洗滌紅細胞的制備:將隨機采集400 ml CPDA-1保養(yǎng)液處方全血制備的2 U懸浮紅細胞120袋保存于(4±2)℃儲血專用冰箱，取儲存期第7、14、21、28和35天的懸浮紅細胞(無破損滲漏，血液外觀正常)各24袋。待用洗滌溶液聯(lián)袋提前放置冷凝保存，無破損滲漏，溶液外觀正常，在有效期內。洗滌溶液聯(lián)袋分別為1號，2號，3號，4號，把1號和2號的鹽水全部擠入3號，4號，1號和2號排空待用。使用無菌接合機將待洗滌的紅細胞懸液袋導管和洗滌溶液聯(lián)袋進行無菌接合連通，將洗滌溶液移至紅細胞袋內，液體量約為100 ml，夾緊導管，混勻后3 500 r/min離心［溫度(4 ±2)℃］。離心后將血袋取出，避免震蕩，垂直放入分漿夾中，把上清液轉移至空袋內，將洗滌溶液再次移至紅細胞袋內，液體量約為150 ml，夾緊導管。經(jīng)上述步驟離心洗滌3次后加入適量 0.9%氯化鈉溶液(50 ml/U)移入已完成洗滌的紅細胞。將紅細胞混勻后注滿配血管，熱合留取40 cm配血管進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

血紅蛋白含量第28天與第35天、第7天與第35天比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。上清蛋白質含量第21天與第28天比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。溶血率第7天與第14天比較溶血率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第7天、第14天與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，第21天、第28天和第35天兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第35天組有一例洗滌紅細胞的溶血率為0.85%，超出質量控制要求。原料血第7天與第14天比較溶血率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第7天、第14天與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同儲存時間懸浮紅細胞制備的洗滌紅細胞檢測結果 n=24，±s

表1 不同儲存時間懸浮紅細胞制備的洗滌紅細胞檢測結果 n=24，±s

注:與7 d比較，*P＜0.05;與14 d比較，#P＜0.05;與21 d比較，△P＜0.05;與28 d比較，☆P＜0.05

項目 第7天 第14天 第21天 第28天 第35天Hb含量(g) 43.98±5.81 43.72±9.19 39.86±11.89 42.43±4.26 39.55±3.49＊☆上清蛋白質含量(g) 0.36±0.12 0.46±0.20* 0.54±0.20*# 0.58±0.17*# 0.68±0.20*#△☆溶血率(%) 0.13±0.05 0.15±0.04 0.22±0.13*# 0.26±0.10*# 0.41±0.15*#原料血溶血率(%) 0.07±0.07 0.02±0.05* 0.13±0.08*# 0.27±0.11*#△ 0.48±0.19*#△☆

3 討論

洗滌紅細胞是采用特定的方法將保存期內的全血、懸浮紅細胞用大量的等滲溶液進行洗滌，去除了幾乎所有的血漿成分和部分非紅細胞成分，并用氯化鈉注射液或紅細胞添加液懸浮所制成的紅細胞成分血［4］。一般手工洗滌紅細胞可以去除紅細胞中90%左右的白細胞和99%以上的血漿蛋白。采用氯化鈉注射液懸浮制備的洗滌紅細胞可保存24 h，采用紅細胞保養(yǎng)液懸浮制備的洗滌紅細胞的保存期與普通紅細胞相同。洗滌紅細胞適用于輸全血或血漿蛋白過敏而又需要繼續(xù)輸血，自身免疫溶血性貧血、高鉀血癥及肝、腎功能障礙需要輸血、新生兒溶血病等患者。

血液保存在保養(yǎng)液中會發(fā)生紅細胞保存損傷，保存15 d以后的全血制備的洗滌紅細胞形態(tài)發(fā)生異常變化，出現(xiàn)棘形紅細胞，囊泡化后的紅細胞溶血，細胞壽命縮短影響洗滌紅細胞的質量［7］。為避免留取的血樣儲存時間不同引起檢測結果的差異，我們將檢測時間均定為洗滌后1 h。表1顯示隨懸浮紅細胞儲存時間的延長，其制備的洗滌紅細胞的溶血率呈上升趨勢，其中第7天與第14天溶血率均值相近(P＞0.05)，該2組血液分別與其他各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其制備原料懸浮紅細胞第7天與第14天比較溶血率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第7天、第14天與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。第35天組溶血率較第28天組上升明顯，且有1例洗滌紅細胞的溶血率為0.85%，超出新國標規(guī)定洗滌紅細胞溶血率＜RBC總量的0.8%的要求。有研究顯示，儲存期末溶血率指標不符合率為1.1%［8］。FHb增加是血管內溶血的指標，F(xiàn)Hb含量是紅細胞制品質量控制的重要指標［9］，血液制品中過高的FHb可引起受血者急性腎功能衰竭等重副作用［10］。馮博等［11］的研究結果表明懸紅儲存時間對所制備的洗滌紅細胞FHb影響較大，但對其制備的洗滌紅細胞的K+影響較小，原因可能是制備洗滌紅細胞的過程改變了紅細胞的滲透壓，導致紅細胞的溶血增加。有報道［12］稱手工制備洗滌紅細胞的RBC回收率可達到89.29%，Hb在RBC內占有很大的比重，它的變化會直接影響紅細胞的形態(tài)［1］，并影響溶血率。表1中除第28天與第35天、第7天與第35天的血紅蛋白含量比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)外，其余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。由此可見，應用0.9%氯化鈉溶液對懸浮紅細胞進行洗滌并未對Hb含量產(chǎn)生較明顯的影響。洗滌紅細胞的制備過程中因為獻血者個體差異、洗滌的方法和步驟不同、制備人員的操作差異等均可能對洗滌紅細胞的溶血率產(chǎn)生影響。本實驗測定上清蛋白質濃度使用的終點法即鄰苯三酚紅鉬絡合顯色法，數(shù)據(jù)顯示洗滌紅細胞的上清蛋白質含量隨其原料懸浮紅細胞的儲存時間延長而逐漸遞增，但均在新國標要求范圍內(＜1.0 g)。除第21天與第28天比較差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。如果采用雙縮脲法測定上清液蛋白，只有非常靈敏的儀器方可達到要求［6］，因此應用鄰苯三酚紅鉬絡合顯色法可檢測到上清液中的微量蛋白，結果更加準確可靠。

洗滌紅細胞制備過程中會丟失部分紅細胞［13］，王愛梅等［7］經(jīng)過對不同保存期血液制備成洗滌紅細胞的超微結構變化，采用掃描電子顯微鏡觀察研究認為，4℃保存10 d內的全血最佳。因為10 d內的紅細胞形態(tài)具有完整的結構和正常的生理功能，細胞膜能承受一定的離心壓力，輸注后能提高紅細胞的活力［7］。另有研究表明紅細胞隨儲存時間的延長其攜氧能力不斷下降，庫存前2周其攜氧能力下降的尤為明顯，貯存35 d的紅細胞攜氧能力僅為0 d的50%［14］。本研究顯示洗滌紅細胞的上清蛋白質含量和溶血率隨其制備原料懸浮紅細胞儲存時間的延長而增加，與上述研究的結果一致。因此，使用儲存期較長的懸浮紅細胞制成的洗滌紅細胞溶血率可能會超出國家標準。

洗滌紅細胞制品成為臨床常用的血液用品，在非溶血性發(fā)熱反應和血漿蛋白所致的過敏反應應用中起著不可替代的作用。目前廣泛應用的CPDA保養(yǎng)液對ATP的保存效果明顯優(yōu)于ACD和CPD保養(yǎng)液。紅細胞輸入患者體內24 h后，其存活率一般要求大于75%。紅細胞保存過程中重要的變化就是紅細胞中ATP水平降低。在CPDA保養(yǎng)液中，腺嘌呤可先合成AMP，進一步磷酸化生成ATP，可有效促進紅細胞代謝［15］。我們在對CPDA-1方全血制備的懸浮紅細胞和去白細胞懸浮紅細胞儲存期內溶血率的調查中發(fā)現(xiàn)，2組紅細胞均采用CPDA-1保養(yǎng)液，懸浮紅細胞組溶血率優(yōu)于ACD-B保養(yǎng)液采集的懸浮紅細胞［5］，這與一些研究的結果［16］是一致的?！堆炯夹g操作規(guī)程》(2012版)中提出通過導管接駁技術制備的洗滌紅細胞，并且以紅細胞保存液混懸，可以延長洗滌紅細胞保存期。添加MAP紅細胞保存液延長了洗滌紅細胞的保存期，使其更加廣泛的應用于臨床。

綜上所述，懸浮紅細胞儲存時間對制備的洗滌紅細胞質量有較大影響，洗滌紅細胞的上清蛋白質含量和溶血率隨其制備原料懸浮紅細胞儲存時間的延長而增加。14 d內的懸浮紅細胞制備的洗滌紅細胞的上清蛋白質含量和溶血率均較低，使用保存期較長的懸浮紅細胞制備的洗滌紅細胞產(chǎn)品溶血率可能會超出國家標準。因此，建議血站盡量選擇儲存期在14 d內的懸浮紅細胞用于制備洗滌紅細胞，以避免使用儲存期末懸浮紅細胞制備洗滌紅細胞而導致臨床輸注效果下降。另外，在添加MAP紅細胞保存液的洗滌紅細胞也盡量縮短保存期，以減少一些特殊患者如高鉀血癥患者的副作用［17］。

1 楊成民，李家增，季陽主編.基礎輸血學.第1版.北京:中國科學技術出版社，2001.668.

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3 張艷華，李廣慶，陳蘭蘭，等.制備洗滌紅細胞方法關鍵控制點改進體會.河北醫(yī)藥，2011，33:622-623.

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5 李美霖，車進，張燕華，等.CPDA-1方全血制備的懸浮紅細胞和去白細胞懸浮紅細胞儲存期內溶血率的調查.實用醫(yī)學雜志，2014，30: 3034-3035.

6 中華人民共和國衛(wèi)生部主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程.第1版.南京:東南大學出版社，2006.342-344.

7 王愛梅，梁文華，王群，等.不同保存期全血制備洗滌紅細胞的超微結構變化.臨床輸血與檢驗，2004，6:173-176.

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9 羅圓圓，桂萍，潘繼春，等.濾除白細胞對懸浮紅細胞不同貯存期溶血率的影響.中國輸血雜志，2013，26:728-729.

10 Natanson C，Kern SJ，Lurie P，et al.Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial infarctionand death:a meta-analysis. JAMA，2008，299:2304-2312.

11 馮博，段瀾，王景文，等.懸浮紅細胞儲存時間對制備的洗滌紅細胞鉀離子和游離血紅蛋白含量的影響.中國輸血雜志，2012，25:834-836.

12 周俊，吳濤，姜瑞民，等.懸浮紅細胞制備洗滌紅細胞不同方式的比較分析.中國輸血雜志，2013，26:887-888.

13 沈莉，李建民，梁曉虎，等.提高洗滌紅細胞制品質量的探討.河北醫(yī)藥，2006，28:710-711.

14 張婷，潘紀春，莊遠，等.不同保存時間的庫存紅細胞攜氧能力變化研究.中國輸血雜志，2013，26:434-438.

15 唐會珍，陳海珊，張獻清.紅細胞保存損傷及其對策.臨床輸血與檢驗，2013，15:187-190.

16 龔裕春，邱穎婕，金魏名，等.去白細胞懸浮紅細胞與懸浮紅細胞儲存期內溶血率的比較.中國輸血雜志，2013，26:151-152.

17 馮博，段瀾，任芙蓉，等.用于高鉀血癥貧血患者的洗滌紅細胞可保存時間的研究.中國輸血雜志，2014，28:123-125.