中國(guó)煙霧病患者主動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白α2基因編碼區(qū)的研究*

張 謙 劉雅萍 張 東 王 嶸 張 巖 于蘭冰 張 學(xué) 趙繼宗

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100050)

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·論著·

中國(guó)煙霧病患者主動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白α2基因編碼區(qū)的研究*

張 謙 劉雅萍①?gòu)?東 王 嶸 張 巖 于蘭冰 張 學(xué)①趙繼宗**

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100050)

目的 探討主動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白α2(actin alpha 2，ACTA2) 編碼區(qū)基因多態(tài)性/突變與中國(guó)煙霧病患者遺傳易感性的關(guān)系。 方法 我院2012年6月～2013年5月經(jīng)腦血管造影或磁共振血管造影檢查明確診斷132例煙霧病，抽取患者的靜脈血，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Sanger方法對(duì)外顯子2～9進(jìn)行直接測(cè)序分析ACTA2編碼區(qū)多態(tài)性及罕見(jiàn)突變，對(duì)比分析人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的ACTA2基因突變。 結(jié)果 132例中國(guó)煙霧病ACTA2基因編碼區(qū)未檢測(cè)到突變。 結(jié)論ACTA2基因不是中國(guó)煙霧病患者的主要易感基因。

煙霧?。籄CTA2基因； 易感基因

煙霧病是一種病因不明的以雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈末端及大腦前動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈起始部動(dòng)脈內(nèi)膜緩慢增厚，動(dòng)脈管腔逐漸狹窄以至閉塞，腦底穿通動(dòng)脈代償性擴(kuò)張為特征的疾病[1]。煙霧綜合征為腦血管造影表現(xiàn)與煙霧病類似，但該類患者合并基礎(chǔ)病，包括動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、神經(jīng)纖維瘤病、頭部外傷、放射性損傷、甲狀腺功能亢進(jìn)等。煙霧病患者早期臨床癥狀不明顯，就診時(shí)常存在嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，早期診斷和及時(shí)手術(shù)可以降低患者卒中風(fēng)險(xiǎn)，改善預(yù)后。煙霧病致病基因的研究不僅有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，而且為疾病的早期診斷和治療提供依據(jù)。主動(dòng)脈平滑肌肌動(dòng)蛋白α2(actin alpha 2，ACTA2)基因，位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂(10q23.31)，為家族性胸主動(dòng)脈瘤和胸主動(dòng)脈夾層的致病基因。2009年Guo等[2]進(jìn)行的連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究顯示，ACTA2基因突變不僅可引起胸主動(dòng)脈瘤和胸主動(dòng)脈夾層，還可能引起煙霧病。攜帶ACTA2基因突變的家族成員可出現(xiàn)多種血管性疾病，包括煙霧病和腦卒中。本研究檢測(cè)132例中國(guó)煙霧病ACTA2基因編碼區(qū)外顯子，旨在探討ACTA2基因是否有突變，及其與中國(guó)煙霧病患者遺傳易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究選取我院2012年6月～2013年5月經(jīng)腦血管造影或磁共振血管造影檢查明確診斷的132例煙霧病。女78例，男54例。年齡3～59歲，(25.2±13.4)歲，兒童45例(年齡≤15歲)。臨床表現(xiàn)為腦缺血101例，腦出血31例。有家族史18例，散發(fā)病例114例。

納入標(biāo)準(zhǔn): ①腦血管造影或磁共振血管造影檢查符合煙霧病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②患者或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、腦膜炎、腦腫瘤、唐氏綜合征等可能導(dǎo)致繼發(fā)性腦血管病變引起煙霧綜合征的患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組提取 采集患者靜脈血2～4 ml，乙二胺四乙酸抗凝，采用基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN)，根據(jù)說(shuō)明書提取基因組DNA。

1.2.2 基因檢測(cè) 選取ACTA2基因編碼區(qū)外顯子序列(-NM_001141945)，應(yīng)用生物軟件Primer 3.0 online進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST將引物序列與基因組DNA序列進(jìn)行比對(duì)，確定其特異性后由Invitrogen公司合成部合成引物。引物序列見(jiàn)表1。

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系為50 μl，其中含2 μl DNA模板(20 ng/μl)，上游、下游引物(濃度：20 μmol/L)各1 μl，Premix La Taq (TaKaRa)溶液25 μl，補(bǔ)齊ddH2O至50 μl。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入主循環(huán)，94 ℃變性30 s，59～62 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)后置72 ℃再7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京梓熙生物基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR擴(kuò)增使用引物

F代表上游引物，R代表下游引物，ACTA2外顯子1為非編碼外顯子

1.2.3ACTA2突變表型檢索 檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Gener Mutation Database, HGMD)，網(wǎng)址：http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php，獲得已知ACTA2基因突變情況。

2 結(jié)果

截止2014年12 月20日,HGMD收錄45種ACTA2基因突變，包括41種錯(cuò)義突變，1種無(wú)義突變，2種剪切位點(diǎn)突變和1種微缺失。致病突變可以引起胸主動(dòng)脈疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、腦血管病、精神分裂癥等，這些突變包括p.D26Y，p.G38R，p.R39C，p.R39H，p.H42N，p.V45L，p.M49V，p.Q61R，p.P72Q，p.D82E，p.T108M，p.N113T，p.N117T，p.R118Q，p.Y135H，p.A140V，p.Y145C，p.R149C，p.V154A，p.G160D，p.V161A，p.R179C，p.R179H， p.R179L，p.R185Q，p.V203I，p.R212Q，p.E243K，p.P245H，p.I250L，p.R258C，p.R258H，p.G270E，p.G275A，p.R292G，p.S302A，p.G304R，p.R314*，p.T326N，p.K328N，p.T353N，p.G368R, c.369+1G>A, c.616+1G>T, c.1019_1020delCT。在這些突變中, 9種錯(cuò)義突變，包括p.R39H、p.R179C、p.R179H、p.R179L、p.R212Q、p.P245H、p.I250L、p.R258H、p.T326N與腦血管病有關(guān)，見(jiàn)表2。

132例煙霧病ACTA2基因編碼區(qū)外顯子直接測(cè)序未發(fā)現(xiàn)突變，包括先前報(bào)道的可能引起腦卒中的突變[2，4～7]，即本研究132例煙霧病中，ACTA2基因編碼蛋白p.R39、 p.R179、p.R212、p.P245、p.I250、p.R258、p.T326均未改變，見(jiàn)圖1～7。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)132例中國(guó)煙霧病患者進(jìn)行ACTA2基因編碼區(qū)外顯子的檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)中國(guó)煙霧病患者ACTA2基因編碼外顯子任何突變。1969年Suzuki和Takaku正式命名煙霧病[9]。煙霧病的病因至今仍不明確，遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)煙霧病相關(guān)基因位點(diǎn)，包括3p24．2-26、6q25、8q23、12p12和17q25等[10]，RNF213、ACTA2、BRCC3、GUCY1A3等基因與煙霧病和煙霧綜合征發(fā)病相關(guān)[2，11～13]。

表2 ACTA2基因9種與腦血管病相關(guān)的突變

圖1～7 ACTA2基因直接測(cè)序結(jié)果顯示，p.R39、 p.R179、p.R212、p.P245、p.I250、p.R258、p.T326均未發(fā)現(xiàn)突變，方框內(nèi)3個(gè)核苷酸編碼對(duì)應(yīng)的氨基酸

煙霧病起病隱匿，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，輕者可無(wú)明顯臨床癥狀或僅以頭痛為主要表現(xiàn)，隨著疾病進(jìn)展，可出現(xiàn)短暫性腦缺血發(fā)作、腦梗死、癲癇和腦出血等表現(xiàn)。缺血型煙霧病多見(jiàn)于兒童，發(fā)病高峰為10歲以前；出血型煙霧病多見(jiàn)于成年人，發(fā)病高峰在40歲左右，是我國(guó)兒童和青壯年腦卒中常見(jiàn)的病因之一。目前，尚無(wú)有效藥物。治療以腦血運(yùn)重建手術(shù)為主，包括直接搭橋術(shù)、多種間接搭橋術(shù)及聯(lián)合搭橋術(shù)等。對(duì)有腦缺血表現(xiàn)的煙霧病患者行血管重建術(shù)可以降低短暫性腦缺血發(fā)作頻率以及腦梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，提高生活質(zhì)量和改善腦功能的長(zhǎng)期預(yù)后[1]。

Liu等[11]發(fā)現(xiàn)RNF213基因是日本煙霧病患者的主要致病基因。p.R4810K突變(rs112735431)明顯增加了日本煙霧病患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)約23%的中國(guó)煙霧病患者存在p.R4810K突變，明顯低于日本煙霧病患者(23% vs. 90%)。Wu等[14]在170例中國(guó)煙霧病患者的驗(yàn)證研究中發(fā)現(xiàn)13%的中國(guó)煙霧病患者存在RNF213基因p.R4810K突變。以上2項(xiàng)研究均提示RNF213基因之外的其他遺傳因素或環(huán)境因素可能與中國(guó)煙霧病的發(fā)病有關(guān)。

ACTA2基因位于10號(hào)染色體長(zhǎng)臂-10q23.31，為家族性胸主動(dòng)脈瘤和胸主動(dòng)脈夾層的致病基因，ACTA2基因(NM_001141945)由9個(gè)外顯子組成，編碼肌動(dòng)蛋白α2, 是哺乳動(dòng)物中存在的 6 種肌動(dòng)蛋白亞類之一，主要分布于肌細(xì)胞，是收縮器的主要成分。2009年Guo等[2]進(jìn)行的連鎖分析和關(guān)聯(lián)研究顯示，ACTA2基因突變不僅可引起胸主動(dòng)脈瘤和胸主動(dòng)脈夾層，還可能引起腦卒中和煙霧病?？赡艿倪z傳學(xué)機(jī)制是ACTA2基因突變，引起血管平滑肌細(xì)胞異常遷移，從而導(dǎo)致煙霧病的發(fā)生。Milewicz等[5]報(bào)道5例有p.R179H突變的患者存在心血管系統(tǒng)疾病，同時(shí)合并頸內(nèi)動(dòng)脈海綿竇段至床突段擴(kuò)張、頸內(nèi)動(dòng)脈末端狹窄、腦梗死等類似煙霧病的腦血管改變。Roder等[15]對(duì)歐洲中部68例散發(fā)性煙霧病ACTA2基因9個(gè)外顯子的測(cè)序研究顯示，1例煙霧病患者存在6號(hào)外顯子p.R179H突變(雜合子)。

Shimojima等[16]對(duì)53例日本煙霧病的驗(yàn)證研究顯示未發(fā)現(xiàn)ACTA2基因是煙霧病的主要易感基因。Hu等[17]對(duì)56例中國(guó)散發(fā)煙霧病的ACTA2基因進(jìn)行檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)ACTA2基因外顯子突變。Hu等的研究不包括家族性煙霧病患者，而Guo等報(bào)道的ACTA2基因突變引起胸主動(dòng)脈瘤、煙霧病和腦卒中主要見(jiàn)于家族性患者。為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)中國(guó)煙霧病患者ACTA2基因編碼區(qū)外顯子突變，我們選取132例煙霧病，其中包括18例家族性和114例散發(fā)性煙霧病，包括兒童和成人患者，以及缺血型和出血型煙霧病患者。全部患者ACTA2基因編碼區(qū)外顯子均未發(fā)現(xiàn)任何突變，提示ACTA2基因不是中國(guó)煙霧病患者的主要致病基因，表明亞洲和歐美煙霧病患者存在遺傳異質(zhì)性。中國(guó)和歐美煙霧病患者的流行病學(xué)和臨床特點(diǎn)存在明顯差異[1]，這種臨床表型的差異可能與遺傳異質(zhì)性有關(guān)。隨著煙霧病和煙霧綜合征致病基因和易感基因的深入研究，未來(lái)可能依據(jù)分子遺傳學(xué)標(biāo)記將此類疾病進(jìn)行新的分類，為不同基因突變導(dǎo)致的煙霧病和煙霧綜合征手術(shù)方式選擇和預(yù)后評(píng)估提供新的依據(jù)。

本研究存在的不足之處：第一，本研究?jī)H對(duì)ACTA2基因編碼區(qū)外顯子進(jìn)行了測(cè)序，非翻譯區(qū)外顯子、啟動(dòng)子區(qū)域及內(nèi)含子的改變并沒(méi)有檢測(cè)；第二，本研究樣本量較小，檢驗(yàn)效能不高。

總之，對(duì)ACTA2基因編碼區(qū)直接測(cè)序研究結(jié)果提示ACTA2基因不是中國(guó)煙霧病患者的主要易感基因，這與高加索人群有所不同，我們的結(jié)果需要進(jìn)一步在各種族、多中心、大樣本人群中進(jìn)行驗(yàn)證。

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(修回日期：2015-06-14)

(責(zé)任編輯：李賀瓊)

Analysis of Coding Exon ofACTA2 in Chinese Patients with Moyamoya Disease

ZhangQian*,LiuYaping,ZhangDong*,etal.

*DepartmentofNeurosurgery,BeijingTiantanHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China

ZhaoJizong,E-mail:zhaojz205@163.com

Objective To study variations of the coding exons ofACTA2 (actin alpha 2) and to investigate the genetic susceptibility in Chinese patients with moyamoya disease. Methods A total of 132 blood samples from Chinese patients with moyamoya disease were collected. The eight coding exons and flanking intronic regions ofACTA2 were amplified and sequenced. Pathogenic mutation ofACTA2 reported in the Human Gene Mutation Database was summarized. Results We were not able to detect any previously described mutations inACTA2 in 132 Chinese patients with moyamoya disease. ConclusionACTA2 is not a major genetic susceptible gene for Chinese patients with moyamoya disease.

Moyamoya disease; Actin alpha 2(ACTA2); Susceptible gene

首都臨床特色應(yīng)用研究(項(xiàng)目編號(hào)：Z13110200680000)

R743

A

1009-6604(2015)11-1041-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.11.024

2015-02-13)

**通訊作者，E-mail:zhaojz205@163.com

①(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，北京 100005)