HPLC法測(cè)定血漿中伊立替康及其代謝產(chǎn)物SN-38、SN-38G濃度及方法學(xué)研究*

汪皖青，黃晨蓉

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院1藥學(xué)部，2臨床藥理研究室，蘇州 215006

HPLC法測(cè)定血漿中伊立替康及其代謝產(chǎn)物SN-38、SN-38G濃度及方法學(xué)研究*

汪皖青1，黃晨蓉2**

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院1藥學(xué)部，2臨床藥理研究室，蘇州 215006

目的：建立同時(shí)測(cè)定晚期結(jié)直腸癌患者血漿中伊立替康（CPT-11）及其活性代謝產(chǎn)物7-乙基-10-羥基喜樹(shù)堿（SN-38）和非活性代謝產(chǎn)物的SN-38葡萄糖醛酸化（SN-38G）的濃度測(cè)定方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法：以Kromacil C18為色譜柱，甲醇-水 （含5 mmol·L-1KH2PO3，pH=3.0）=55∶45為流動(dòng)相，激發(fā)波長(zhǎng)λex=385 nm、發(fā)射波長(zhǎng)λem=535 nm。結(jié)果：CPT-11在20～5000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好，SN-38在2～500 ng·mL-1范圍內(nèi)線性良好，r值均為0.999。CPT-11和SN-38的提取回收率分別為53.26%～59.86%和66.83%～71.30%。CPT-11低、中、高三種濃度的日間和日內(nèi)精密度均小于6.32%；SN-38低、中、高三種濃度的日間和日內(nèi)精密度均小于7.02%。血漿樣品反復(fù)凍融3次、室溫放置8 h、進(jìn)樣器中放置24 h及長(zhǎng)期凍融，穩(wěn)定性均良好，樣品濃度均未見(jiàn)顯著改變。結(jié)論：使用高效液相色譜-熒光定量檢測(cè)法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，適用于晚期結(jié)直腸癌患者血漿中伊立替康及其代謝產(chǎn)物SN-38、SN-38G的血藥濃度測(cè)定。

伊立替康；SN-38；高效液相色譜法

伊立替康（irinotecan/CPT-11，商品名：艾力、開(kāi)普拓）是S期特異性的抗腫瘤新藥，屬于半合成水溶性喜樹(shù)堿類(lèi)衍生物[1]。CPT-11為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑[2]，能夠在細(xì)胞復(fù)制期與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ及單鏈DNA形成三元復(fù)合物，阻止拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ對(duì)細(xì)胞復(fù)制期斷裂的DNA鏈的修復(fù)，使細(xì)胞中復(fù)制階段單鏈斷裂引起DNA損傷，其作用過(guò)程不可逆，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。目前，伊立替康和氟尿嘧啶類(lèi)（氟尿嘧啶、卡培他濱）藥物聯(lián)用是治療晚期結(jié)直腸癌患者的主要化療方案[2-4]，多中心臨床試驗(yàn)表明，伊立替康能延長(zhǎng)晚期結(jié)直腸癌患者的生存期，提高生活質(zhì)量[5]。CPT-11是無(wú)活性的前體藥物，在體內(nèi)被血漿、小腸黏膜和肝臟內(nèi)的羧酸酯酶（CES）轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物SN-38，其抗腫瘤活性是CPT-11的100～1000倍。SN-38可在肝臟通過(guò)尿苷二磷酸葡糖苷酸轉(zhuǎn) 移 酶 （uridine diphosphate glucuronoxyltransferase1A1，UGT1A1）轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸產(chǎn)物SN-38G解毒 （見(jiàn)圖1）[6]。CPT-11不良反應(yīng)的發(fā)生與SN-38及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的血藥濃度密切相關(guān)。因此，在測(cè)定CPT-11血藥濃度的同時(shí)，有必要同時(shí)測(cè)定其代謝產(chǎn)物SN-38和SN-38G的血藥濃度。目前，CPT-11[7-9]臨床使用監(jiān)測(cè)一般不檢測(cè)SN-38和SN-38G的濃度，抑或二者監(jiān)測(cè)成本較高，臨床無(wú)法大規(guī)模推廣。因此，建立一種簡(jiǎn)便快捷且滿足測(cè)定需求的方法很有必要。本研究參考文獻(xiàn)采用HPLC-FLD法，建立同時(shí)測(cè)定晚期結(jié)直腸癌患者血中CPT-11及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器和試藥、試劑

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀，包括：?jiǎn)卧?、FLD檢測(cè)器、色譜工作站；精密pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 5804R）；AB-204-N精密電子天平 （梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

鹽酸伊立替康對(duì)照品 （批號(hào)：100767-201102，純度93.4%、喜樹(shù)堿 （CPT內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：100532-200401）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；SN-38對(duì)照品（批號(hào)：AAM286671，純度98%，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；β-葡萄糖醛酸酶（HP-2型，來(lái)源于羅曼蝸牛，Sigma公司）。

磷酸二氫鉀（KH2PO3）；磷酸（H3PO3）；高氯酸（HClO4）為分析純；甲醇為色譜純；超純水。

圖1 伊立替康及其主要代謝途徑

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromacil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水 （含5 mmol·L-1KH2PO3，pH=3.0）（55∶45）；檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)λex=385 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=535 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

CPT-11與SN-38以濃度比10∶1配置成一份溶液，用流動(dòng)相按體積比作為稀釋劑，精密配制二者濃度為 200/20、500/50、1000/100、2000/200、5000/ 500、10000/1000、20000/2000、50000/5000 ng·mL-1的CPT-11/SN-38工作液。精密吸取200 μL血漿樣本置于1.5mL EP管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)，10%高氯酸-甲醇（1∶1）200 μL沉淀劑，渦旋混合1 min后，14000 r·min-1離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，同時(shí)測(cè)定CPT-11和SN-38的濃度。分別以CPT-11和SN-38的濃度為橫坐標(biāo)，CPT-11、CPT兩者的峰面積之比，作為縱坐標(biāo)，繪制CPT-11和SN-38的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 SN-38G的濃度測(cè)定

分別精密吸取200 μL同一份血漿樣本，置于兩個(gè)1.5 mL EP管中，即為EP（1）和EP（2）。

在EP（1）中，先后加入20 μL內(nèi)標(biāo)，10%高氯酸-甲醇 （1∶1）200 μL沉淀劑，渦旋混合1 min后，14000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL置進(jìn)樣器，進(jìn)樣量為20 μL。記錄SN-38質(zhì)量濃度為CSN-38。

在EP（2）中，加入5 μL 1000 IU的β-葡萄糖醛酸酶，于水浴鍋中37℃條件下恒溫保持，2 h后取出，先后加入20 μL內(nèi)標(biāo)、10%高氯酸-甲醇 （1∶1）200 μL沉淀劑，其余同EP（1）管對(duì)應(yīng)操作。記錄SN-38的質(zhì)量濃度為CSN-38總，計(jì)算SN-38G的血藥濃度。根據(jù)NSN-38G=NSN-38總-NSN-38，用SN-38和SN-38G的分子量校正，求算出SN-38G的血藥濃度（N=n×M，n：物質(zhì)的量，M：相對(duì)分子質(zhì)量，MSN-38= 392，MSN-38G=568）。

3 結(jié) 果

3.1 專(zhuān)屬性

在本實(shí)驗(yàn)條件下，CPT-11、SN-38和內(nèi)標(biāo)CPT靈敏度和分離度均較好。不同來(lái)源的空白血漿（n= 6）中雜質(zhì)對(duì)CPT-11、SN-38和CPT沒(méi)有干擾，CPT-11、SN-38和CPT的保留時(shí)間分別為4.53、11.23和

9.49 min（見(jiàn)圖2），說(shuō)明該方法專(zhuān)屬性較高。

圖2 人血漿中伊立替康、SN-38及CPT的HPLC色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

所建立的HPLC-FLD法測(cè)定晚期結(jié)直腸癌患者血漿中CPT-11，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為20～5000 ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.43+0.37X，r=0.9993；SN-38的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為2～500 ng·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.56+4.36X，r=0.9993；線性關(guān)系良好。CPT-11及SN-38定量下限分別為20 ng·mL-1和2 ng·mL-1。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度

CPT-11低、中、高三種濃度的質(zhì)控（QC）樣品，每一濃度測(cè)定5個(gè)樣本，依法與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3天。求算方法的精密度RSD與準(zhǔn)確度。同法測(cè)定SN-38的準(zhǔn)確度與精密度。日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于6.32%；SN-38低、中、高三種濃度的日間和日內(nèi)變異系數(shù)均小于7.02%。其準(zhǔn)確度均在真實(shí)濃度的80%～120%范圍內(nèi)，RSD均小于20%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 CPT-11、SN-38日內(nèi)、日間精密度（n=5）

3.4 提取回收率

本方法 CPT-11的提取回收率在 53.26%～

59.86%；SN-38的提取回收率在66.83%～71.30%，CPT-11及SN-38的低、中、高三種濃度之間的提取回收率接近。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血漿中CPT-11、SN-38提取回收率（n=5）

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取CPT-11與SN-38的低、中、高3個(gè)濃度點(diǎn)的血漿樣品考察其穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)血漿樣品在室溫條件放置8 h穩(wěn)定性無(wú)顯著變化，CPT-11和SN-38在低、中、高3個(gè)濃度的RSD分別為6.23%、4.51%、4.30%和8.84%、2.50%、4.11%。

血漿樣品在-80℃溫度下反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性無(wú)顯著變化，CPT-11和SN-38在低、中、高3個(gè)濃度的RSD分別為5.25%、3.19%、1.84%和6.27%、3.99%、2.63%。

血漿樣品在液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h穩(wěn)定性無(wú)顯著變化，CPT-11和SN-38在低、中、高3個(gè)濃度的RSD分別為5.64%、2.62%、3.60%和8.19%、4.60%、2.23%。

血漿樣品長(zhǎng)期（3個(gè)月）低溫放置（-80℃條件凍存）穩(wěn)定性無(wú)顯著變化，CPT-11和SN-38在低、中、高3個(gè)濃度的RSD分別為7.10%、1.18%、0.60%和5.84%、1.67%、0.82%。

運(yùn)用建立的方法測(cè)得某晚期結(jié)直腸癌患者給予CPT-11 1h后CPT-11及其代謝產(chǎn)物SN-38、SN-38G的血藥濃度值分別為2101.51、36.24、60.59 ng· mL-1（SN-38G的濃度計(jì)算是通過(guò)酶將其水解成SN-38后進(jìn)行考察的）。

4 討 論

實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)甲醇 （含5 mmol·L-1KH2PO3，pH=3.0）和水的不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行了考察，在其他條件不變時(shí)，CPT-11的保留時(shí)間隨著水相含量增加而縮短，但是內(nèi)標(biāo)和SN-38的保留時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng)，增加了分析時(shí)間，考慮分析時(shí)間與雜質(zhì)的分離，選擇甲醇-水（含5 mmol·L-1KH2PO3，pH=3.0）=55∶45做流動(dòng)相。曾在緩沖鹽中加入三乙胺，但對(duì)峰形改變不明顯。

高氯酸、乙腈、甲醇是常用的蛋白沉淀劑，本實(shí)驗(yàn)采用的是蛋白沉淀法處理血漿樣品，故分別考察了三種沉淀劑的效果，采用5%高氯酸和乙腈作沉淀劑時(shí)，雜質(zhì)較多，采用甲醇作沉淀劑時(shí)，有一雜質(zhì)峰難以與樣品峰分離；而采用10%高氯酸∶甲醇=1∶1作沉淀劑時(shí)雜質(zhì)少且沒(méi)有雜質(zhì)峰。文獻(xiàn)采用液液萃取后揮發(fā)再重組[10-11]或者固相萃取[12]等處理方法，其操作過(guò)程較繁瑣；本實(shí)驗(yàn)采用蛋白沉淀法直接取上清液進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法定量，操作方便快捷。

本研究建立了HPLC-FLD法同時(shí)測(cè)定晚期結(jié)直腸癌患者血漿中CPT-11及其代謝產(chǎn)物SN-38和SN-38G的血藥濃度。該方法靈敏度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，適用于伊立替康及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度檢測(cè)及相關(guān)的藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)及基因多態(tài)性的研究。

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AnHPLC-FLD Method fortheDetermination ofIrinotecan and Its Metabolites SN-38 and SN-38G in Plasma*

WANG Wan-qing1,HUANG Chen-rong2**
1Department of Pharmacy,2Department of Clinical Pharmacology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China

Objective:To establish and validate a method for simultaneous determination of irinotecan (CPT-11)and its active metabolite SN-38 and inactive metabolite SN-38G in plasma of metastatic colorectal cancer patients by HPLC-FLD.Methods:Chromatographic separation was performed on a Kromacil C18column,using methanol (5 mmol·L-1KH2PO3,pH=3.0):water=55∶45 as mobile phase.The detection wavelengths were:λex=385 nm,λem=535 nm.Results:The assay was linear at the range 20-5000 ng·mL-1for CPT-11(r=0.999)and 2-500ng·mL-1for SN-38(r=0.999).The extraction recoveries were between 53.26%-59.86%for CPT-11,and between 66.83%-71.30%for SN-38,respectively.Both intra-and inter-day precisions for CPT-11 were within 6.32%.Both intra-and inter-day precisions for SN-38 were with 7.02%. The spiked samples were stable after three freeze-thaw cycles,at room temperature for 8h or in auto sample bottles for 24 h.The changes in levels of CPT-11 and SN-38 after long-term stability test were not obvious.Conclusion:The HPLC-FLD method for detection of CPT-11 and its metabolites SN-38 and SN-38G in plasma of metastatic colorectal cancer patients is simple,accurate and sensitive.

Irinotecan;SN-38;SN-38G;HPLC

R969.1

A

1673-7806（2015）06-565-04

江蘇省藥學(xué)會(huì)-奧賽康醫(yī)院藥學(xué)基金 “伊立替康對(duì)晚期結(jié)直腸癌患者合理用藥研究”（項(xiàng)目編號(hào)：201312）

汪皖青，女，藥師 E-mail:wangwanqing_fly@126.com

**通訊作者黃晨蓉，女，主管藥師 E-mail:chrishuangcr@163.com

2015-03-17

2015-08-17