UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中氯沙坦、氨氯地平和辛伐他汀的濃度*

李三妮，張古英，韓 華河北省兒童醫(yī)院藥劑科，石家莊 05003；河北省人民醫(yī)院婦一科，石家莊 05005

UPLC-MS/MS法同時測定人血漿中氯沙坦、氨氯地平和辛伐他汀的濃度*

李三妮1，張古英1，韓 華2
1河北省兒童醫(yī)院藥劑科，石家莊 050031；2河北省人民醫(yī)院婦一科，石家莊 050051

目的：建立了UPLC-MS/MS同時測定人血漿中氯沙坦、氨氯地平和辛伐他汀濃度的方法。方法：取血漿0.2 mL，經甲醇沉淀蛋白后，用Acquity UPLC BEH C18柱，以乙腈-0.1%氨水溶液（v/v）為流動相，梯度洗脫，經電噴霧離子化后進入質譜儀，以多反應監(jiān)測（MRM）方式進行檢測。結果：用于定量分析的離子反應分別為m/z 423.2→207.1（氯沙坦）、384.3→231.2（氨氯地平）、419.3→199.1（辛伐他汀）和409.2→238.1（哌唑嗪）。氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的最低定量下限分別為0.08、0.35、0.40 ng·mL-1。結論：本法專屬性高、分析速度快、操作簡便，適用于上述藥物的血藥濃度監(jiān)測和藥代動力學研究。

液相色譜-串聯(lián)質譜法；辛伐他?。话甭鹊仄?；氯沙坦；人血漿

高血壓與血脂異常是目前公認的兩大心腦血管疾病的重要危險因素，大量流行病學研究證實，這兩種危險因素往往合并存在且相互影響[1-3]，在我國約有4800～8000萬高血壓患者同時患有高血脂[4-5]?？垢哐獕核幒徒抵帲貏e是氨氯地平、ARB類抗高血壓藥和他汀類聯(lián)合用藥，與其它聯(lián)合用藥相比，能降低患者致死性冠心病和非致死性心肌梗死發(fā)作的相對風險[6-8]。氨氯地平、氯沙坦和辛伐他汀是目前臨床上較為常用的聯(lián)合給藥方案。

目前，未見同時測定人血漿中辛伐他汀、氨氯地平和氯沙坦?jié)舛鹊腍PLC-MS方法，僅有單獨檢測上述藥物濃度的方法[9-18]，且這些方法的前處理復雜、分析時間長。本文采用甲醇直接沉淀蛋白，建立了UPLC-MS/MS同時測定人血漿中辛伐他汀、氨氯地平和氯沙坦?jié)舛鹊姆椒?，分離時間小于3 min，可以用本法同時監(jiān)測這3種藥物的血藥濃度。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥、試劑

Waters Acquity H-class超高效液相色譜儀；Waters Xevo TQ-S三重四極桿串聯(lián)質譜儀，配備電噴霧離子源（ESI）以及Masslynx 4.1數(shù)據(jù)采集軟件。

辛伐他汀 （批號：100601-201003）、氨氯地平（批號：100374-201204）、氯沙坦 （批號：100597-201102）和哌唑嗪（IS）標準對照品均購于中國食品藥品鑒定研究院。乙腈為色譜純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Acquity BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；流動相：乙腈-0.1%氨水溶液，梯度洗脫，0～1.6 min，乙腈20%～90%，1.6～2.5 min，乙腈保持90%不變，2.6～4 min，乙腈比例為20%；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：40℃；進樣量：2 μL。

1.2.2 質譜條件 離子源：ESI；檢測方式：正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測（MRM）；掃描時間為：0.04s；去溶劑氣：N2；去溶劑氣溫度：450℃；去溶劑氣流速：1000 L·h-1；源溫度：150℃；其他參數(shù)見表1。

1.2.3 血漿樣品預處理 精密吸取血漿樣品200μL，精密加入哌唑嗪內標溶液10 μL（19.8 ng·mL-1），渦旋混合30 s后，加入甲醇600 μL，渦旋4min，14000 g離心10 min，取上清液2 μL進樣分析。

1.2.4 標準曲線與質量控制（QC）樣品的制備 精密量取空白人血漿180 μL，置于1.5 mL離心管中，精密加入各待測物系列標準溶液20 μL（溶劑為水），配制相當于氯沙坦?jié)舛葹?0.0804、0.402、0.804、4.02、20.1、100.5 ng·mL-1的血漿樣品，相當于氨氯地平濃度為0.3452、0.6904、3.452、17.26、43.15、86.3 ng·mL-1的血漿樣品，相當于辛伐他汀濃度為0.4056、0.8112、2.028、4.056、20.28、50.7 ng·mL-1的血漿樣品，均按“1.2.3”項下的方法處理，制備標準曲線。以血漿中待測物的質量濃度為橫坐標，以待測物與內標的峰面積比為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸計算（權重1/X2），求得直線回歸方程，即為標準曲線。制備低、中、高3個濃度的質量控制樣品（QC），氯沙坦為0.1608、2.01、10.05 ng·mL-1，氨氯地平為0.3452、1.726、8.63 ng·mL-1，辛伐他汀為0.4056、2.028、10.14 ng·mL-1。

2 結 果

2.1 質譜分析

采用正離子檢測方式，在一級全掃描質譜圖中獲得氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀和哌唑嗪準分子離子峰 [M+H]+的m/z分別為423.2、409.2、419.3、384.3，選擇性對[M+H]+峰進行二級質譜分析，準分子離子裂解生成的主要碎片離子見圖1。選取響應最高的主要碎片離子用于定量分析；選取響應次高的主要碎片離子計算離子比，用于定性分析，見表1。

2.2 方法的專屬性

取空白人血漿200 μL，除不加內標外，均按“1.2.3”項下的方法操作，進樣，得提取離子色譜圖2A；將一定濃度的待測物標準溶液和內標溶液加入空白血漿中，依同法操作，得色譜圖2B和圖2C，各物質的保留時間見表1，結果表明，無內源性物質干擾測定。氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的離子比（定量離子對與定性離子對峰面積之比）分別為1.10～1.23、1.68～1.86、1.54～1.72。

2.3 線性范圍

氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的線性范圍見表2。所測物質線性關系良好，標準曲線上各點的相對誤差（RE）均小于15%，符合測定要求。

2.4 方法回收率和精密度

按“1.2.3”項下操作，制備各待測物3個濃度的QC樣品，每個濃度進行6份樣本分析，連續(xù)測定3 d，并與標準曲線同時進行測定，以當日的標準曲線計算QC樣品的濃度，算得各藥物的方法回收率為92.2%～103.7%，日內日間精密度 （RSD）均小于13.8%。實驗數(shù)據(jù)表明建立的UPLC-MS/MS分析方法符合生物樣品的分析要求。

圖1 氯沙坦（A）、氨氯地平（B）、辛伐他?。–）和哌唑嗪（D）[M+H]+的二級全掃描質譜圖

2.5 提取回收率與基質效應

取人空白血漿200 μL，加入相應濃度的質控和內標溶液，均按“1.2.3”項下的方法操作，取上清液進樣分析得峰面積A；取人空白血漿，除不加系列標準溶液和內標外，均按“1.2.3”項下的方法操作，取上清液780 μL中加入內標溶液和相應濃度的質控溶液，渦旋混合，取2 μL進樣分析，獲得相應的峰面積B；取流動相780 μL，加入內標溶液和相應濃度的質控溶液，渦旋混合，取2 μL進樣分析，獲得相應的峰面積C。以A/B考察方法的回收率，以B/C考察方法的基質效應，氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀、哌唑嗪的回收率均值（n=5）分別為110.3%、106.1%、102.9%、98.4%；基質效應 （n=5）分別為94.6%、92.7%、76.3%、95.0%。結果表明，各藥物的回收率良好，除辛伐他汀外的其它物質均不存在基質效應。

圖2 氯沙坦（A）、氨氯地平（B）、辛伐他?。–）和哌唑嗪（D）的典型色譜圖

表2 氯沙坦、氨氯地平、辛伐他汀的線性范圍及回歸方程

2.6 穩(wěn)定性試驗

按“1.2.3”項下操作，制備低、中、高3個濃度的QC樣品，按“1.2.3”項下的方法操作，考察血漿樣品經預處理后于4℃條件下放置的穩(wěn)定性、血漿樣品于室溫下放置的穩(wěn)定性以及血漿樣品經過3次重復凍融及長期放置的穩(wěn)定性。結果表明，血漿樣品經預處理后在4℃條件下放置12 h、血漿樣品于室溫下放置2 h的穩(wěn)定性良好；經過3次重復凍融保持穩(wěn)定；在-40℃條件下存放30 d內穩(wěn)定。

3 討 論

在選擇流動相時，曾考察了0.1%甲酸、10 mmol· L-1甲酸銨（pH 3.8）及0.1%氨水溶液，結果發(fā)現(xiàn)待測物質在0.1%氨水溶液中響應最高，且信噪比（S/N）最大，這表面上與一般認為酸性條件下正離子模式響應較高的經驗不相符合。這說明液相分離過程對待測物的檢測產生了影響，因為這些藥物都具有一定的堿性，在堿性條件下分離，色譜峰峰寬窄，且有機相比例相對較大，有利于提高物質的離子化效率。在測定氯沙坦時發(fā)現(xiàn)，其在負離子模式下也響應（定量離子對421.2→179.0），雖然噪音很低，但仍不及在正離子模式下靈敏度高，故最終測定時選擇在正離子模式下測定。在研究藥物的基質效應時，發(fā)現(xiàn)沉淀蛋白后的血漿基質對辛伐他汀存在負效應，但由于方法回收率和精密度均在可以接受的范圍之內，且前處理簡單，因此本法也適合辛伐他汀的測定。

文獻報道，成人服用氯沙坦后的最大血藥濃度為50～226 ng·mL-1[11-12]，服用氨氯地平后的最大血藥濃度為2.3～6.2 ng·mL-1[13-16]，服用辛伐他汀的血藥濃度為4.6～11.2 ng·mL-1[17-18]，故按照至少測定其最大血藥濃度的1/10～1/20的原則，本法可以用于藥代動力學的研究。加之本法專屬性高，操作簡單，特別適合于臨床上高血壓合并高血脂病人聯(lián)合用藥的藥物監(jiān)測。

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本期繼續(xù)教育試題答案：CDBAD DAAAC

學習測試

將問題頁剪下后答題，復印無效（累計5期答題頁一并寄回編輯部，可授予Ⅱ類學分證書5分）

1、皮膚涂藥不考慮下列哪項差異（因素）？ （ ）

A.皮層厚薄差異

B.年齡不同

C.血型差異

D.膚質不同

2、一般濕疹病程主要分期不包含下列哪項？ （ ）

A.急性期

B.亞急性期

C.慢性期

D.潛伏期

3、下列選項中哪項為皮膚厚度最薄處？ （）

A.掌砳足后皮膚

B.腋下、陰囊等皺褶處皮膚

C.面部皮膚

D.腹部皮膚

4、下列關于外用劑型不正確的表述？ （）

A.僅起一個藥物載體作用

B.對炎癥皮膚起到散熱，消炎，收斂，保護，軟化等多種功能

C.適當劑型可協(xié)助藥物控制皮損，縮短病程

D.有些劑型乳膏可以緩解皮膚干癢等癥狀

5、皮膚炎癥急性期一般不選用什么劑型？ （ ）

A.溶液劑 B.水溶液混懸劑

C.乳劑 D.混懸型油劑

6、皮膚炎癥亞急性期一般不選用什么劑型？ （ ）

A.混懸型油劑

B.乳劑膏

C.凝膠，糊劑

D.溶液劑

7、皮膚炎癥慢性期一般選用什么劑型？ （）

A.糊劑，軟膏

B.溶液劑

C.乳劑

D.混懸型油劑

8、關于不同濃度的外用藥作用的錯誤表述有哪些項？ （ ）

A.不同濃度藥物對皮膚的藥理作用類型都相同

B.適用于不同疾病的治療

C.滿足不同部位皮膚耐受藥物程度的選擇需要

D.不同濃度維A酸對皮膚可能產生雙向調節(jié)作用

9、外用藥調配治療使用錯誤的項目？ （）

A.液體與膏藥合用，應先涂藥膏，待皮膚吸收后再涂液體

B.尋常性痤瘡可白天使用過氧苯甲酰凝膠，晚上使用易光敏化的維A酸

C.酒精制劑與乳膏聯(lián)合使用，提高藥物促透性

D.聯(lián)合使用萘替芬與酮康唑可抗真菌

10、激素類外用藥使用一般原則？ （）

A.嚴重皮損最長不能超過3周

B.外用超強激素一日2次，最長不能超過2周

C.外用激素能降低毛細血管通透性，減輕炎癥水腫滲出，促進炎癥消退，但不只有抗過敏作用

D.激素藥膏包封治療可用于神經性皮炎、疥瘡結節(jié)等皮膚病

An UPLC/MS/MS Method for Simultaneous Determination of Losartan,Amlodipine and Simvastatin in Human Plasma*

LI San-ni1,ZHANG Gu-ying1,HAN Hua2
1Children's Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050031;2Hebei General Hospital,Shijiazhuang 050051

Objective:To develop an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of losartan, amlodipine and simvastatin in human plasma.Methods:After adding methanol to 0.2 mL plasma,the mixture was deproteinized by methanol,and aliquots of the supernatant were injected into an LC-MS/MS system.The separation was achieved using a C18based column(Acquity UPLC BEH C18)with a mobile phase of acetonitrile and 0.1%aqueous ammonia.Detection was carried out by mass spectrometry equipped with ESI source in a multiple reaction monitoring (MRM)mode.Results:The MRM transitions of m/z 423.2→207.1,384.3→231.2,419.3→199.1 and 409.2→238.1 were used to quantify losartan,amlodipine,simvastatin and prizosin,respectively.The lower limits of quantitation for losartan,amlodipine and simvastatin were 0.08 ng·mL-1,0.35 ng·mL-1and 0.40 ng·mL-1,respectively.Conclusion:The LC-MS/MS method is selective,rapid and simple for therapeutic drug monitoring and clinical pharmacokinetic study of these drugs.

LC-MS/MS;Losartan;Amlodipine;Simvastatin;Human plasma

R969.1

A

1673-7806（2015）06-539-04

河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃（No.20150568）

李三妮，女，藥理學碩士，主管藥師，研究方向：臨床藥學及藥動學方向 E-mail:sannidezhi@163.com

2015-06-05

2015-11-11