半乳糖血癥全自動篩查試劑盒的性能分析

孫亦彩 馮健明 徐 倩 沈 健

1.山東省濱州市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心（256618）；2.廣東省廣州市豐華生物工程有限公司

半乳糖血癥是一種常染色體隱性遺傳病，其發(fā)病率為1／50 000［1］。半乳糖血癥對新生兒有巨大的危害，此類患病新生兒在不加任何干預(yù)的情況下，常在新生兒時期夭折。20世紀(jì)60年代，新生兒半乳糖血癥篩查逐漸進(jìn)入人們的視線并被列入新生兒篩查項目，這對于半乳糖血癥的早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了幫助，有效地阻止了疾病的發(fā)展，降低了半乳糖血癥引起的新生兒死亡率［2－4］。目前對于半乳糖血癥的篩查主要針對于Leloir途徑酶活性以及代謝產(chǎn)物的檢測，最常見的是檢測全血中總半乳糖的含量。本文將對一種利用熒光分析法檢測新生兒濾紙干血片樣品中總半乳糖含量的全自動檢測試劑盒進(jìn)行性能分析，并與國外同類試劑盒性能進(jìn)行比對。

1 材料與方法

1.1 材料來源及處理

592個新生兒濾紙干血斑樣本來自于山東省濱州市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，新生兒足跟血根據(jù)《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定采集，并經(jīng)過家屬知情同意。樣品收集后，濾紙平放室內(nèi)自然風(fēng)干，干燥后于2～8℃貯存。

1.2 試劑與設(shè)備

對照品半自動新生兒半乳糖測定試劑盒購于PerkinElmer公司。D－半乳糖純品、葡萄糖、甘露糖、果糖、血紅蛋白、半乳糖－1－磷酸購自Sigma公司；903＃濾紙購于 Whatman公司；96孔微孔白色反應(yīng)板（8×12孔）為丹麥NUNC產(chǎn)品；氧化型輔酶Ⅱ購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司；堿性磷酸酶來自上海寶曼生物科技有限公司；半乳糖脫氫酶為上海斯百全化學(xué)有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純購于廣州化學(xué)試劑廠；半乳糖校準(zhǔn)品和質(zhì)控品、實驗緩沖液、銅試劑、Esay DBS600全自動打孔器、Auto TRFIA－4自動熒光免疫分析儀均來自廣州市豐華生物有限公司。

1.3 半乳糖校準(zhǔn)品、質(zhì)控品及樣本制備

使用無菌生理鹽水洗滌脫纖維綿羊全血，調(diào)整血細(xì)胞比容至55%，向其中加入D－半乳糖原料以配制不同濃度梯度的校準(zhǔn)品；向其中加入不同量的D－半乳糖和半乳糖－1－磷酸原料（兩種原料質(zhì)量比為1∶3）配制成低濃度和高濃度質(zhì)控品。將配制好的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品以50μl／滴分別滴加在903＃濾紙的A、B、C、D、E、F 6個校準(zhǔn)位點（標(biāo)示濃度分別為0.00、2.50、10.00、15.00、35.00 和 70.00mg／dl）和C1、C2兩個質(zhì)控位點（標(biāo)示濃度分別為5和20mg／dl）上，經(jīng)室溫自然干燥后用鋁箔袋真空密封。

1.4 實驗緩沖液的制備

用 ddH2O 配 制 pH 8.0、50mmol／L Tirs－HCL，并加入80mmol／L KCL，混勻后置于室溫保存使用。

1.5 實驗酶類凍干粉制備

分別用 ddH2O、50mmol／L pH 8.0的 Tirs－HCL溶液溶解氧化型輔酶Ⅱ和堿性磷酸酶。取450μl氧化型輔酶Ⅱ（50mg／ml）和50μl堿性磷酸酶（1000U／ml）混合凍干，－20℃保存。使用前用500μl實驗緩沖液復(fù)溶，并按照1∶48配制工作緩沖液。用2.2mmol／L硫酸銨懸浮液（0.5%BSA，1 mmol／L EDTA，2.2mmol／L NH4SO4）稀釋半乳糖脫氫酶至50U／ml，按照80μl分裝、凍干，－20℃保存。實驗前用80μl實驗緩沖液復(fù)溶，并按照1∶300配制工作緩沖液。

1.6 實驗方法

使用Esay DBS600全自動打孔器，從半乳糖濾紙干血片校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和采集的濾紙干血片樣本中打下直徑為3.0mm的圓形血斑于緊扣針板的塑料排釘上。將扣有血斑的針板和96孔微孔白色反應(yīng)板至于Auto TRFIA－4自動熒光免疫分析儀的指定位置，啟動儀器軟件設(shè)定的新生兒半乳糖測定程序。系統(tǒng)自動按如下步驟進(jìn)行測定：用80%的乙醇固定1min后，于37℃，烘干20min。將血斑置于200μl的反應(yīng)緩沖液37℃緩慢振蕩30min。最后加入100μl冷的銅試劑終止反應(yīng)。檢測最終反應(yīng)物在波長為355nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)射出的波長為460nm的熒光的熒光強(qiáng)度。分析軟件根據(jù)已知的半乳糖濾紙干血片校準(zhǔn)品濃度值與相應(yīng)反應(yīng)孔測定的熒光值用LIN－MEAS數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，繪制熒光強(qiáng)度－濃度劑量反應(yīng)曲線，進(jìn)而分析獲得樣品的濃度值。

1.7 分析靈敏度測定

將試劑盒校準(zhǔn)品A點重復(fù)檢測20次，計算其熒光值均值（ˉx）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），計算ˉx±2s濃度值。

1.8 特異性檢測

檢測葡萄糖1200mg／dl、甘露糖10mg／dl、果糖25mg／dl、血紅蛋白25g／dl對4.5mg／dl半乳糖檢測的影響。

1.9 準(zhǔn)確性

1.9.1 校準(zhǔn)品準(zhǔn)確性 以PerkinElmer公司新生兒半乳糖試劑盒中的校準(zhǔn)品和廣州市豐華生物工程有限公司校準(zhǔn)品為對比，測定試劑盒半乳糖濾紙干血片校準(zhǔn)品的實際效價。

1.9.2 測量準(zhǔn)確度 將15mg／dl的總半乳糖按體積比1∶9加入到中值濃度的人全血（由PerkinElmer公司對照試劑盒進(jìn)行檢測確定）樣本中制備濾紙干血片，對加入前和加入后的樣本重復(fù)測定3次，按下列公式計算回收率。

式中：R－回收率；V－加入標(biāo)準(zhǔn)液體積；V0－人全血樣本的體積；C－人全血樣本加入標(biāo)準(zhǔn)液后制備的濾紙干血片測定濃度；C0－人全血樣本制備的濾紙干血片測定濃度；Cs－標(biāo)準(zhǔn)液的濃度。

1.1 0不精密性

一次實驗中分別測定在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)高、低2種不同濃度的質(zhì)控品及校準(zhǔn)品中B、C、D、E、F，各測定20個平行孔，計算平均值（ˉx）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）。分析批內(nèi)不精密度（CV%＝s×100%／ˉx）和校準(zhǔn)品不精密度。用3批試劑盒分別測定低值質(zhì)控品，每批試劑盒各測20孔，計算60次測定結(jié)果的，分析批間不精密度。

1.11 質(zhì)量控制

10孔平行測定2種不同濃度的質(zhì)控品，計算測定結(jié)果的平均值（ˉx），結(jié)果應(yīng)在允許范圍內(nèi)。

其次，在施肥管理中，要重視基肥與追肥。在玉米的生長過程中，土壤的基肥對于玉米的生長有著重要的作用。土壤肥力較差時，要依據(jù)前重后輕的施肥原則對玉米進(jìn)行施肥。根據(jù)玉米葉子的生長情況進(jìn)行施肥，當(dāng)玉米葉長到6片時，追施拔節(jié)肥，這時所追的肥料要占總肥料的60%；如果玉米到了大喇叭口時期，以攻穗為目的追肥，施肥量占總施肥量40%。

1.12 穩(wěn)定性

將整套試劑盒放置于37℃烘箱中烘烤，分別測定3d、7d后校準(zhǔn)品各個點的熒光值。

1.13 與國外試劑盒對比

將市場上PerkinElmer公司的新生兒總半乳糖檢測試劑盒與此方法測定新生兒濾紙干血片樣品值比較，利用IBM SPSS Statistics19軟件進(jìn)行配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 劑量－反應(yīng)曲線

利用Auto TRFIA－4自動熒光免疫分析儀對校準(zhǔn)品各點的熒光值進(jìn)行檢測并進(jìn)行劑量－反應(yīng)曲線擬合，如圖1所示，其相關(guān)系數(shù)為0.999，說明該試劑盒有良好的劑量－反應(yīng)關(guān)系。檢測線性范圍為0.75～71mg／dl。

圖1 劑量－反應(yīng)曲線

2.2 分析靈敏度

通過對A點進(jìn)行20次重復(fù)檢測，其熒光值ˉx±2s為601，即該試劑盒的分析靈敏度為0.1mg／dl。

2.3 特異性檢測

特異性實驗顯示：各干擾物的干擾率均≤（±15）%（表1），因此本試劑盒的特異性好。

2.4 準(zhǔn)確性

2.4.1 校準(zhǔn)品準(zhǔn)確性 PerkinElmer公司試劑對本試劑盒校準(zhǔn)品的測定值介于標(biāo)示值的0.9～1.1倍，符合試劑盒設(shè)計要求。見表2。

表1 特異性檢測

表2 校準(zhǔn)品準(zhǔn)確性檢測結(jié)果（mg／dl）

2.4.2 測量準(zhǔn)確度 中值樣本中標(biāo)準(zhǔn)液的回收率介于85%～115%，符合試劑盒的設(shè)計要求。

2.5 不精密度

通過對校準(zhǔn)品和質(zhì)控品各點進(jìn)行20次重復(fù)試驗，測得該試劑盒的校準(zhǔn)品中B、C點不精密度≤20%，D、E、F各點的不精密度≤15%（表3）。批內(nèi)不精密度≤10%，批間不精密度≤15%（表4和表5）。

表3 校準(zhǔn)品不精密度檢測結(jié)果

表4 批內(nèi)不精密度檢測結(jié)果

表5 批間不精密度檢測結(jié)果

2.6 質(zhì)量控制

如表6所示，質(zhì)控點檢測值均在標(biāo)示值的0.7～1.3倍范圍內(nèi)。

表6 質(zhì)控檢測結(jié)果（mg／dl）

2.7 穩(wěn)定性

試劑盒在37℃放置7d后，校準(zhǔn)品各點的熒光值變化≤15%（圖2），說明該試劑盒的穩(wěn)定性較好。

2.8 與國外試劑盒對比

利用本試劑盒和PerkinElmer公司的新生兒總半乳糖檢測試劑盒同時測定592個樣本，進(jìn)行線性回歸分析，如圖3所示，y＝0.9919x＋0.0437，r2＝0.9891。并利用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行t檢驗統(tǒng)計，t＝－1.55，P＞0.05，兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性顯著，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 本試劑盒穩(wěn)定性試驗

圖3 與國外試劑盒測定樣本數(shù)據(jù)相關(guān)性分析

3 討論

半乳糖血癥是一種代謝缺陷病，是由于體內(nèi)半乳糖代謝異常所致。目前對于半乳糖血癥的診斷主要集中在酶學(xué)檢測、血和尿中半乳糖和半乳糖代謝物的檢測及基因診斷［5－6］。由于酶活性的不穩(wěn)定性，且基因診斷尚未普及，因此檢測半乳糖及半乳糖代謝物是常用的方法。本文研究采用熒光分析法檢測新生兒濾紙干血片樣品中總半乳糖含量，相對于常見的檢測紅細(xì)胞中的GALT，該方法的結(jié)果受樣本自身的影響較小。該試劑盒中所有的酶均以凍干粉的狀態(tài)保存，穩(wěn)定試驗證明其穩(wěn)定性較高，在2～8℃可以放置1年以上。試劑盒在37℃放置7d穩(wěn)定性好，說明試劑盒的保守存放時間為2～8℃1.5年?？紤]到測定樣本的穩(wěn)定性，建議在低溫、低濕度的情況下保存，提高樣本測定的準(zhǔn)確性。另外，靈敏度高，線性范圍廣，準(zhǔn)確度高，同時結(jié)構(gòu)相似物的干擾實驗顯示該試劑盒有較強(qiáng)的特異性，很好地控制了假陽性和假陰性率。 不精密度實驗顯示該試劑盒的批內(nèi)及批間重復(fù)性好，因此將提供穩(wěn)定可靠的樣本測定結(jié)果。在對臨床樣本進(jìn)行測定的試驗中與國外PerkinElmer公司的檢測試劑盒相關(guān)性顯著，具有很好的臨床使用價值。同時該試劑盒操作簡單，適用于全自動操作，整個實驗過程不超過1h，對比國外產(chǎn)品，其具有操作簡單，快速等特點，適合應(yīng)用于新生兒半乳糖血癥大批量樣本的篩查。

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