基于半導(dǎo)體測序的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測技術(shù)性能評估

萬 敏 李必生 鄒 婧 歐日晶 侯 強(qiáng) 曲守方 黃 杰，＊

1.華北石油管理局總醫(yī)院檢驗(yàn)科（任丘，062550）；2.深圳華大基因研究院；3.中國食品藥品檢定研究院

人乳頭瘤病毒（HPV）屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒，包含約8000個(gè)堿基對［1］。HPV根據(jù)編碼衣殼蛋白L1基因的開放讀碼框（ORF）序列不同進(jìn)行分型［2］。高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素［3－4］，在99.7%的宮頸癌患者病變組織中可發(fā)現(xiàn)高危型的 HPV感染［5］。目前還缺乏針對 HPV公認(rèn)的有效治療手段，因此高危型HPV早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防是阻斷癌變的關(guān)鍵。截止2014年，國內(nèi)已經(jīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的HPV核酸檢測試劑盒共有50多種［6］，涉及的檢測方法包括PCR－熒光探針法，PCR－反向斑點(diǎn)雜交法、基因芯片法、PCR－表面等離子諧振法、雜交捕獲－化學(xué)發(fā)光法等。由于方法學(xué)的限制，分型檢測多個(gè)HPV型別需要數(shù)個(gè)反應(yīng)才能完成，檢測通量大幅下降，成本也將提高。因此大部分HPV核酸檢測試劑盒僅檢測少數(shù)型別，或只定性檢測而不進(jìn)行HPV分型。近年來，新一代高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，涌現(xiàn)了多種先進(jìn)的測序方法［7－9］，這些技術(shù)已經(jīng)在胎兒染色體非整倍體檢測、單基因遺傳病檢測、遺傳性腫瘤基因檢測等臨床檢測中得到了應(yīng)用［10－12］。目前半導(dǎo)體測序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于HPV核酸分型檢測中，通過對HPV的L1區(qū)基因保守序列進(jìn)行測序及序列差異分析，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)反應(yīng)可對16種HPV型別（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68）同時(shí)分型檢測，極大提高了檢測的通量并降低了成本。本研究采用中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑一室研制的HPV L1基因分型國家參考品及HPV全基因組分型國家參考品對半導(dǎo)體測序法HPV核酸分型檢測技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確性、特異性、重復(fù)性及最低檢測限等分析性能評估。同時(shí)采用已上市的HPV核酸檢測試劑盒作為對照試劑盒，評估該技術(shù)檢測臨床樣本的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及一致性系數(shù)（Kappa）值，評價(jià)該技術(shù)與臨床檢測方法的等效性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

HPV L1基因分型國家參考品包括30種HPV型別質(zhì)粒，其中14種高危型 HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73），3種中等危險(xiǎn)型（26、53、66）和13種低危型 HPV（6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、83、CP8304）；HPV 全基因組分型國家參考品包括20種HPV型別質(zhì)粒及5個(gè)陰性參考品，去除與HPV L1區(qū)分型參考品重復(fù)的型別，從中選取 HPV 67、69、71、82型質(zhì)粒以及陰性參考品N1－N5用于性能評估試驗(yàn)，以上國家參考品均由中國食品藥品檢定研究院提供。選取華北石油管理局總醫(yī)院提供的500例檢測剩余的宮頸脫落細(xì)胞DNA樣本用于臨床檢測性能評估，所有樣本均已使用HPV基因分型（23型）檢測試劑盒（PCR－反向點(diǎn)雜交法，亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司，注冊證號：國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第3401228號）進(jìn)行HPV核酸分型檢測，總計(jì)200例陰性樣本、300例陽性樣本，陽性樣本HPV型別均已知。

1.2 主要儀器與試劑

9700PCR儀購置于ABI公司；生物分析儀2100購置于安捷倫公司；Ion One TouchTM制備儀及Ion One TouchTMES純化儀購置于 Life Technologies公司；基因測序儀（BGISEQ－100）購置于武漢華大基因生物醫(yī)學(xué)工程有限公司。PCR及測序文庫構(gòu)建采用華大基因研究院研制的HPV（16種型別）核酸分型檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）；半導(dǎo)體測序采用華大生物科技（武漢）有限公司生產(chǎn)的BGISEQ－100測序反應(yīng)通用試劑盒（注冊證號：鄂漢食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014第1400030號）。

1.3 基于半導(dǎo)體測序法的HPV核酸分型檢測技術(shù)

1.3.1 多重PCR反應(yīng) 使用HPV（16種型別）核酸分型檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）中的PCR試劑擴(kuò)增樣本中的HPV DNA。多重PCR擴(kuò)增引物根據(jù)HPV編碼晚期蛋白的L1區(qū)基因保守序列設(shè)計(jì)，保證16種HPV型別均可有效擴(kuò)增，同時(shí)上下游引物的5’端均加入了10bp的樣本標(biāo)簽序列，用于數(shù)據(jù)分析中的樣本序列識別。

1.3.2 文庫構(gòu)建 將帶有不同樣本標(biāo)簽序列的96個(gè)樣本的PCR產(chǎn)物等比例混合成為一個(gè)文庫樣本。使用HPV（16種型別）核酸分型檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）中的建庫試劑對文庫樣本進(jìn)行磁珠純化、末端修復(fù)反應(yīng)及接頭連接反應(yīng)，使每個(gè)文庫樣本中的DNA序列兩端均加上用于測序及文庫識別的接頭序列。經(jīng)過生物分析儀2100檢測后，將多個(gè)文庫樣本按等物質(zhì)的量比例混合為一個(gè)測序樣本。

1.3.3 DNA測序 將測序樣本稀釋，使用BGISEQ－100測序反應(yīng)通用試劑盒對測序樣本進(jìn)行油包水PCR反應(yīng)，使每個(gè)DNA分子僅與單個(gè)測序微珠相連并在微珠表面擴(kuò)增，以放大測序信號。反應(yīng)完成后將微珠富集并清洗，再加入測序引物退火，使測序引物與微珠表面的DNA中的接頭退火結(jié)合，最后將產(chǎn)物加入測序芯片中，采用基因測序儀（BGISEQ－100）對測序樣本DNA進(jìn)行序列信息讀取。半導(dǎo)體測序法采用邊合成邊測序的技術(shù)，通過成熟的半導(dǎo)體技術(shù)檢測DNA鏈在合成過程中的pH值改變，并將這種變化轉(zhuǎn)化為電子信號，實(shí)時(shí)記錄反應(yīng)過程中的電子信號有無及強(qiáng)度，從而獲得DNA鏈中的堿基序列。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 使用HPV核酸分型分析軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，每一條DNA的測序結(jié)果經(jīng)過文庫接頭序列及樣本標(biāo)簽序列的比對拆分后將被精確定位到每一個(gè)樣本中。將每個(gè)樣本的DNA測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中的各種HPV型別序列進(jìn)行比對分析，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本比對到16種HPV型別的序列數(shù)量，若某樣本的某一HPV型別的序列數(shù)高于該HPV型別的閾值，判斷該樣本為該HPV型別陽性，若低于閾值判斷為該HPV型別陰性。

1.4 性能評估

技術(shù)性能評估試驗(yàn)設(shè)計(jì)參考了YY／T 1226－2014《HPV核酸（分型）檢測試劑（盒）》醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求及試驗(yàn)方法。由于標(biāo)準(zhǔn)中沒有針對于基因測序方法進(jìn)行HPV分型檢測的相關(guān)要求，因此綜合了所有方法的要求設(shè)計(jì)了評估試驗(yàn)。

1.4.1 準(zhǔn)確性 使用2ng／μl人基因組TE溶液將HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型的L1基因分型國家參考品（1000拷貝／μl）稀釋至100拷貝／μl的溶液。檢測以上稀釋液，要求檢測結(jié)果應(yīng)為對應(yīng)HPV型別陽性。

1.4.2 特異性 使用2ng／μl人基因組TE溶液將HPV 26、40、42、43、44、53、54、61、66、70、72、81、83、CP8304型的L1基因分型國家參考品及HPV 67、69、71、82型的全基因組分型國家參考品（1000拷貝／μL）稀釋至100拷貝／μl的溶液。檢測以上稀釋液及陰性參考品N1～N5，要求檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)均為陰性。

1.4.3 重復(fù)性 采用2ng／μl人基因組TE溶液將HPV11、16型的L1基因分型國家參考品（1000拷貝／μl）稀釋至100拷貝／μl的溶液。重復(fù)檢測以上稀釋液各10次，要求10次的檢測結(jié)果均一致且為對應(yīng)HPV型別陽性。

1.4.4 最低檢測限 采用2ng／μl人基因組TE溶液將 HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型的 L1基因分型國家參考品（1000拷貝／μl）梯度稀釋至100拷貝／μl、10拷貝／μl、1拷貝／μl的溶液。重復(fù)檢測以上梯度稀釋液各3次，確定最低檢測限。要求＜104拷貝／反應(yīng)。

1.5 臨床檢測等效性評估方法

使用半導(dǎo)體測序法檢測500例臨床宮頸脫落細(xì)胞DNA樣本，按照本方法檢測范圍內(nèi)的16種HPV型別將試驗(yàn)對象分為16類。以HPV16型分型檢測結(jié)果分析為例，已知結(jié)果為HPV16型的受試者樣本作為陽性樣本組，已知結(jié)果為非HPV16型感染或HPV感染陰性的受試者樣本作為陰性樣本組。按照表1分別將16組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

表1 檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表

按照以下公式計(jì)算檢測結(jié)果與已知結(jié)果的陽性符合率、陰性符合率、總符合率、一致性系數(shù)（Kappa）值及各值的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 分析性能評估

2.1.1 準(zhǔn)確性 采用基于半導(dǎo)體測序法的HPV核酸分型技術(shù)檢測100拷貝／μl的 HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型 L1基因分型國家參考品稀釋液，檢測結(jié)果均為對應(yīng)HPV型別陽性，準(zhǔn)確率為100%。結(jié)果表明該技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測16種HPV型別，具有很好的檢測準(zhǔn)確性。

2.1.2 特異性 檢測100拷貝／μl的 HPV26、40、42、43、44、53、54、61、66、70、72、81、83、CP8304 型L1基因分型國家參考品稀釋液及100拷貝／μl的HPV67、69、71、82型的全基因組分型國家參考品稀釋液，檢測結(jié)果均為HPV陰性。檢測N1～N5共5例陰性參考品，檢測結(jié)果均為HPV陰性。結(jié)果表明該方法與檢測范圍以外的其他HPV型別無交叉反應(yīng)，與人基因組DNA也無交叉反應(yīng)，具有較好的檢測特異性。

2.1.3 重復(fù)性 重復(fù)檢測100拷貝／μl的 HPV11及HPV16型L1基因分型國家參考品稀釋液各10次，10次的檢測結(jié)果均一致且為對應(yīng)HPV型別陽性，重復(fù)率為100%。結(jié)果表明該技術(shù)具有較好的檢測重復(fù)性。

2.1.4 最低檢測限 結(jié)果顯示，濃度為100拷貝／μl及10拷貝／μl的16種HPV型別國家參考品稀釋液的3次結(jié)果均一致且為對應(yīng)HPV型別陽性，檢出率均為100%，而濃度為1拷貝／μl的國家參考品稀釋液僅HPV16型檢出一次陽性。因此確定該技術(shù)的最低檢測限為10拷貝／μl（即50拷貝／反應(yīng)），符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.2 臨床檢測等效性評估

500例樣本的測序檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，半導(dǎo)體測序法與已知結(jié)果的總體陽性符合率為99.33%（298／300），陰性符合率為100%（200／200），總符合率為99.60%（498／500），Kappa值為0.99，兩種檢測方法具有較高的一致性。按照16種HPV型別進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)陽性符合率、陰性符合率、總符合率以及Kappa值。HPV52、56、58型的陽性符合率分別為98.25%（56／57）、94.74%（18／19），97.56%（40／41），其他 HPV型別的陽性符合率均為100%；HPV11、16、52、59、68 型的陰性符合 率 分別 為99.79% （484／485）、99.55% （444／446）、99.55%（441／443）、99.80%（487／488）、99.38%（482／485），其他HPV型別的陰性符合率均為100%；HPV11、16、52、56、58、59、68型的總符合率分別為99.80%（499／500）、99.60%（498／500）、99.40%（497／500）、99.80% （499／500）、99.80% （499／500）、99.80%（499／500）、99.40%（497／500），其他 HPV 型別的總符合率均為100%；16種HPV型別的Kappa值均＞0.95，表明半導(dǎo)體測序法在檢測16種HPV型別方面與臨床檢測技術(shù)具有較高的一致性。12例不一致樣本的檢測結(jié)果與已知結(jié)果的比較見表2。結(jié)果顯示，前10例樣本的兩種檢測方法結(jié)果均為HPV陽性，僅為HPV型別的差異，其中9例半導(dǎo)體測序法檢出了更多的HPV型別，包括了HPV11、HPV16、HPV52、HPV59、HPV68型；其中1例半導(dǎo)體測序法未檢出HPV56型。后2例樣本的半導(dǎo)體測序法檢測結(jié)果為陰性，而已知結(jié)果分別為HPV52、HPV58型。

表2 不一致樣本的檢測結(jié)果與已知結(jié)果比較

3 討論

本研究采用了HPV分型國家參考品進(jìn)行半導(dǎo)體測序法的技術(shù)性能評估，測試的范圍涵蓋了34種臨床常見的高危型及低危型HPV型別。結(jié)果顯示基于半導(dǎo)體測序法的HPV核酸分型檢測技術(shù)可準(zhǔn)確分型檢測16種 HPV型別（HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68），檢測范圍內(nèi)的16種HPV型別之間無交叉反應(yīng)，與其他HPV型別及人類基因組DNA亦無交叉反應(yīng)，最低檢測限為10拷貝／μl（即50拷貝／反應(yīng)），具有很好的檢測準(zhǔn)確性、特異性及重復(fù)性，符合國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的 YY／T 1226－2014《HPV核酸（分型）檢測試劑（盒）》醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

本研究同時(shí)采用了500例臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行臨床檢測性能的研究。結(jié)果顯示半導(dǎo)體測序法在檢測臨床樣本方面與臨床檢測技術(shù)具有較高的一致性。12例結(jié)果不一致的樣本涉及的型別包括HPV11、16、52、56、58、59、68型。分析半導(dǎo)體測序數(shù)據(jù)，樣本1～6中不一致的HPV型別的檢測數(shù)值與檢測閾值的比值大部分為1～2，即檢測值較接近閾值，分析可能導(dǎo)致這6例樣本不符合的原因?yàn)椋涸诙嘀馗腥镜那闆r下，容易出現(xiàn)PCR引物競爭性抑制的情況，而不一致的HPV型別拷貝數(shù)較低，擴(kuò)增效率較低，導(dǎo)致探針反向雜交顯色時(shí)未檢出低拷貝型別。樣本7～9的不一致型別均為HPV68型且比值均為10，說明HPV68型拷貝數(shù)較高，導(dǎo)致已知結(jié)果中未檢測HPV68型的原因可能為：這3例樣本中的HPV68型序列在探針結(jié)合部分存在堿基突變，導(dǎo)致探針無法結(jié)合或結(jié)合不佳，而半導(dǎo)體測序法直接檢測所有序列后通過與標(biāo)準(zhǔn)序列比對判斷具體HPV型別，因此不受個(gè)別堿基突變的影響。樣本10～12的不一致HPV型別的比值均為0，說明半導(dǎo)體測序法未擴(kuò)增出對應(yīng)的HPV型別序列，可能的原因?yàn)闃颖颈４娌划?dāng)導(dǎo)致DNA降解，也可能為引物結(jié)合部分序列突變導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。

HPV核酸分型檢測技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、重復(fù)性高、漏檢率低的特點(diǎn)，而且可根據(jù)感染的HPV類型預(yù)測受檢者的宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)度。美國癌癥協(xié)會等在2012年發(fā)布的關(guān)于宮頸癌預(yù)防及早期診斷的篩查指南中推薦，在＞30歲的女性中使用HPV檢測以及細(xì)胞學(xué)方法聯(lián)合進(jìn)行篩查［12］。由于在高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變中HPV16及HPV18型感染率較高［13］，為了提高篩查效率，有研究建議根據(jù)HPV分型檢測結(jié)果，HPV16和（或）HPV18陽性患者直接分流進(jìn)行陰道鏡檢測，其他高危型HPV陽性患者進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，以降低篩查成本及陽性復(fù)查和干預(yù)人數(shù)［14］。HPV核酸分型檢測技術(shù)還可用于意義不明的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）病例的分流、宮頸病變患者手術(shù)后隨訪，為區(qū)域性HPV流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的依據(jù)［15］。

基于半導(dǎo)體測序法的HPV核酸分型檢測技術(shù)分型準(zhǔn)確，檢測通量高，通過96套樣本標(biāo)簽及50套文庫標(biāo)簽協(xié)同標(biāo)記不同樣本，單次可同時(shí)檢測4800份樣本，極大提高了檢測通量，同時(shí)降低了檢測成本，為區(qū)域性人群宮頸癌篩查及HPV流行病學(xué)調(diào)查提供強(qiáng)有力的檢測手段。該技術(shù)可以直接進(jìn)行HPV分型，對于HPV16、HPV18等致癌性更強(qiáng)亞型感染者的臨床干預(yù)進(jìn)行分流，相當(dāng)于在初篩的同時(shí)完成了二次篩查，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。今后的研究將進(jìn)一步針對該技術(shù)在宮頸癌篩查方面的性能進(jìn)行。

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