魯北地區(qū)60例大腸癌組織中IDO的表達(dá)及臨床意義

趙　碩,王榮華，李保松,傅廷亮，崔運(yùn)福

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.肛腸外科, b.小兒外科，山東 濱州 256600)

魯北地區(qū)60例大腸癌組織中IDO的表達(dá)及臨床意義

趙碩a△,王榮華a※，李保松a,傅廷亮b，崔運(yùn)福a

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.肛腸外科, b.小兒外科，山東 濱州 256600)

由于人口老齡化加快、不良的生活方式、環(huán)境污染以及遺傳等多種因素的影響，我國(guó)大腸癌的發(fā)病率和病死率在逐年上升，對(duì)現(xiàn)有的治療策略提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。近年來(lái)，在現(xiàn)有的綜合治療中，腫瘤的生物免疫治療的地位愈來(lái)愈受到重視，它因具有全身性治療特點(diǎn)，可與手術(shù)、放療或區(qū)域化療等局部治療相結(jié)合，已經(jīng)成為腫瘤的第四類治療模式[1]，并已在臨床應(yīng)用中取得了一定的療效。吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)作為近年來(lái)研究較熱的因子之一，已有較多研究表明與腫瘤免疫耐受的關(guān)系密切[2-3]。同時(shí),p53作為一種公認(rèn)的抑癌基因，亦有大量研究證明p53在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[4-5]。因此，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)魯北地區(qū)IDO在大腸癌中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)的臨床意義，并進(jìn)一步比較與p53間的相關(guān)性，初步探討IDO在大腸癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中的作用，為大腸癌在今后的免疫治療以及臨床評(píng)估方面提供一定的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2009年6月至2010年5月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理科診斷為大腸癌的成套石蠟組織標(biāo)本60例，包括腫瘤原發(fā)灶、癌旁大腸上皮組織(距腫瘤原發(fā)灶≤3 cm且鏡下觀察正常)和引流區(qū)域淋巴結(jié)。術(shù)前均未接受放、化療等抗腫瘤治療，其中男33例、女27例，年齡36～77歲，平均(59±7)歲，≥60歲28例，<60歲32例。

1.2免疫組織化學(xué)法采用鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP法)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，該技術(shù)通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合以及呈色反應(yīng)，可在組織或細(xì)胞中對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行準(zhǔn)確定位，具有高敏感性、操作簡(jiǎn)便、非特異背景低的特點(diǎn)。主要過(guò)程：將石蠟包埋的組織片切片置于60 ℃恒溫箱60 min，行防脫片處理→常規(guī)脫蠟至水化→濕盒中滴加3% H2O2去離子水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→將切片浸入枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中，微波爐加熱，沸騰后斷電自然冷卻10 min后再次加熱至沸騰，如此反復(fù)2次，行抗原修復(fù)→滴加5%牛血清白蛋白封閉液，室溫20 min→滴加一抗：比例為1∶80稀釋MAB5412-小鼠抗人IDO單克隆抗體(Clone10.1)(Millipore公司，美國(guó))，4 ℃孵育過(guò)夜→滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德生物)→二氨基聯(lián)苯胺顯色(二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒由北京中杉金橋公司提供)，鏡下觀察以控制反應(yīng)時(shí)間→依次蘇木精復(fù)染、鹽酸酒精分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后中性樹(shù)膠封片保存。用磷酸鹽緩沖液)代替一抗設(shè)為陰性對(duì)照，用已知高表達(dá)組織作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3結(jié)果判定IDO陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞為相應(yīng)部位染成黃色或棕黃色。每張切片均由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片。先采用半定量積分法[6]，計(jì)算每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率，先在低倍(×100)光學(xué)顯微鏡下，每張切片選取10個(gè)IDO陽(yáng)性細(xì)胞代表視野，在高倍鏡(×400)下每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共1000個(gè)細(xì)胞，采用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%得出每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞率。其中0分(≤5%)，1分(6%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(≥76%)；

再分別對(duì)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度記分:0～3分依次為無(wú)著色、淡黃色、黃色、棕黃色。然后上述兩者積分的乘積：0～2為陰性(-)，3～5為弱陽(yáng)性(+)，6～8為中陽(yáng)性(++)，9～12為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[7]。最后取(-～+)為IDO低表達(dá)，(++～+++)為IDO高表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，IDO與p53間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1IDO在60例大腸癌組織中的表達(dá)情況IDO在腫瘤原發(fā)灶、癌旁組織以及區(qū)域淋巴結(jié)中可呈現(xiàn)強(qiáng)弱不等的表達(dá)(圖1～4，見(jiàn)封三)，在大腸癌原發(fā)灶、癌旁正常上皮組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的IDO高表達(dá)率分別為75.0%(45/60)、18.3%(11/60)、35.3%(12/34)、50.0%(13/26)，IDO在大腸癌原發(fā)灶中高表達(dá)率顯著高于癌旁正常上皮組織(χ2=38.705,P<0.05)；在34例伴有區(qū)域引流淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，與相應(yīng)的原發(fā)灶高表達(dá)率52.3%(28/34)相比，IDO的表達(dá)率明顯下調(diào)(χ2=15.543,P<0.05)，與相應(yīng)34例癌旁正常組織高表達(dá)率17.6(6/34)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.270,P>0.05)；而在26例無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中高表達(dá)率為5.0%(13/26)，與相應(yīng)的原發(fā)灶高表達(dá)率65.3%(17/26)相比，IDO的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.261,P>0.05)，與相應(yīng)26例癌旁正常組織高表達(dá)率19.2%(5/26)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.438，P<0.05)。

2.2IDO在大腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系在60例大腸癌原發(fā)灶中，有45例呈現(xiàn)高表達(dá)，通過(guò)結(jié)合患者臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，C/D期較A/B期高表達(dá)，N1-2較N0期高表達(dá)，p53陽(yáng)性較陰性高且達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　IDO在大腸癌原發(fā)灶中的表達(dá)強(qiáng)度與

IDO：吲哚胺2，3-雙加氧酶

2.3大腸癌原發(fā)灶中IDO和p53表達(dá)的相關(guān)性分析Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，IDO和p53表達(dá)呈顯著正相關(guān)(rs=0.352,P=0.006)。見(jiàn)表2。

表2　大腸癌原發(fā)灶中IDO與p53表達(dá)的相關(guān)性分析　(例)

IDO：吲哚胺2，3-雙加氧酶

3討論

IDO作為肝外唯一催化色氨酸(Trp)沿犬尿酸途徑代謝的限速酶，最早由Osamu Hayaishis研究組在兔的腸道中發(fā)現(xiàn)[8]，此后還被證實(shí)分布于人和動(dòng)物(如大鼠等)除肝臟以外的組織中。在人類，此途徑能降解約90%的色氨酸，其主要代謝產(chǎn)物有犬尿氨酸、喹啉酸等。IDO在干擾素γ等的誘導(dǎo)下可表達(dá)上調(diào)，通過(guò)降解色氨酸使其水平降低，從而抑制病毒等病原體的增殖，參與免疫調(diào)節(jié)。IDO除了預(yù)防病原體外，還參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而參與免疫耐受，與自身免疫性疾病、移植免疫及生殖免疫密切相關(guān)[2]。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究證明IDO與腫瘤免疫耐受的關(guān)系密切，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞系檢測(cè)，證實(shí)了IDO在腫瘤組織中的高表達(dá)現(xiàn)象[9-10]。并且大量研究進(jìn)一步表明IDO參與腫瘤的免疫耐受，目前較為達(dá)成一致的觀點(diǎn)是IDO在腫瘤微環(huán)境中可能主要通過(guò)色氨酸耗竭機(jī)制、Trp產(chǎn)物的毒性機(jī)制、誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖3種機(jī)制來(lái)抑制局部T細(xì)胞活化、增殖等免疫反應(yīng)，其中Trp的代謝產(chǎn)物(如喹啉酸等)的毒性作用可直接使T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞凋亡[10]，從而使腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)對(duì)60例大腸癌原發(fā)灶中的IDO檢測(cè)，其高表達(dá)率為75.0%，與相應(yīng)癌旁正常大腸組織(18.3%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腫瘤組織中IDO高表達(dá)現(xiàn)象的觀點(diǎn)相符合，而亦有學(xué)者認(rèn)為IDO在結(jié)腸癌原發(fā)灶與癌旁正常腸組織中的表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯差異的觀點(diǎn)[11]，因此仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。在60例大腸癌患者中，無(wú)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中IDO高表達(dá)率為50.0%(13/26)，經(jīng)分析與相應(yīng)腫瘤原發(fā)灶(17/26)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在大腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至區(qū)域淋巴結(jié)前，區(qū)域淋巴結(jié)中IDO的高表達(dá)使局部色氨酸的分解增加、水平降低，而色氨酸作為T細(xì)胞活化增殖過(guò)程中的必須氨基酸導(dǎo)致T細(xì)胞的缺乏，從而使局部微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，為腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移奠定了基礎(chǔ)；而在另一組34例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，IDO的表達(dá)強(qiáng)度明顯下降，其高表達(dá)率為35.3%,與相應(yīng)原發(fā)灶(28/34)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可推測(cè)，腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)雖然通過(guò)高表達(dá)IDO來(lái)降解局部色氨酸，使之水平降低，但同時(shí)色氨酸作為一種必須氨基酸亦是腫瘤生長(zhǎng)所必須的，因此腫瘤轉(zhuǎn)移至引流淋巴結(jié)后，IDO表達(dá)下調(diào)，降低了對(duì)色氨酸的分解，可能為轉(zhuǎn)移灶腫瘤的生長(zhǎng)提供原料，從而參與腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究通過(guò)對(duì)原發(fā)灶中IDO的高表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，IDO的高表達(dá)N分期、Dukes分期、p53表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大腸癌轉(zhuǎn)移的主要方式，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期較晚的患者中，腫瘤IDO呈現(xiàn)高表達(dá)，提示IDO可能參與腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移，可作為判斷大腸癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在對(duì)于其他類型腫瘤的研究中也表明IDO的高表達(dá)與腫瘤患者預(yù)后差顯著相關(guān)[2]，并且多變量Cox回歸分析顯示IDO高表達(dá)為獨(dú)立的不良預(yù)后指標(biāo)[12]。對(duì)于腫瘤患者IDO高表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，本題將繼續(xù)跟蹤調(diào)查研究。

p53抑癌基因位于人類第17號(hào)染色體的短臂，編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為53 000的蛋白質(zhì)(TP53)，是目前發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤關(guān)系最密切的基因，其突變是癌變發(fā)生、發(fā)展的重要原因[4-5]。p53分為野生型和突變型兩種，前者為抑癌基因，對(duì)細(xì)胞的分裂和增殖起負(fù)調(diào)控作用，但因半衰期較短不易被檢測(cè)到；而后者由于對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用減弱轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳┗?，同時(shí)由于其編碼的p53蛋白半衰期較長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性增加，能被免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，并且p53蛋白與突變型p53基因在組織中表達(dá)一致[4]。本研究分析大腸癌組織中IDO與p53表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈顯著的正相關(guān)，由此推測(cè)兩者可能共同參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。此外，腫瘤局部微環(huán)境中免疫耐受形成過(guò)程較復(fù)雜，除IDO外，近年來(lái)研究表明，p53、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、EZH2、Ki67等多種因子或多種途徑參與大腸腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-15]，但是它們之間的具體分子機(jī)制并不明確。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不佳的主要原因，而腫瘤微血管的形成在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。2011年，劉俊田等[6]提出IDO可能通過(guò)促進(jìn)腫瘤新生血管的形成來(lái)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

總之，IDO在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用，加強(qiáng)IDO的檢測(cè)對(duì)大腸癌的臨床診療有一定的參考意義。繼續(xù)對(duì)IDO在腫瘤局部微環(huán)境中具體分子機(jī)制的探討以及與血管形成、免疫等關(guān)系的進(jìn)一步研究，可能對(duì)今后腫瘤新型治療策略的制訂具有更好的指導(dǎo)意義。

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摘要：目的分析大腸癌組織中吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)的表達(dá)及臨床意義。方法選擇2009年6月至2010年5月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理科診斷為大腸癌的成套石蠟組織標(biāo)本60例，通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IDO的表達(dá)情況，分析IDO的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果IDO在大腸癌原發(fā)灶、癌旁正常組織、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的IDO高表達(dá)率分別為75.0%、18.3%、35.3%、50.0%。原發(fā)灶中IDO的表達(dá)強(qiáng)度與N分期、Dukes分期、p53表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，大腸癌原發(fā)灶中IDO和p53表達(dá)具有顯著的正相關(guān)性(rspan=0.352,P=0.006)。結(jié)論IDO在大腸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，與腫瘤分期密切相關(guān)，可作為判斷大腸癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。IDO和p53的表達(dá)關(guān)系密切，兩者可能共同參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

關(guān)鍵詞：大腸癌；吲哚胺2,3-雙加氧酶；p53

Study on IDO Expression in 60 Patients with Colorectal Cancer in Northern Shandong Region and Its Clinical SignificanceZHAOShuoa,WANGRong-huaa,LIBao-songa,FUTing-liangb,CUIYun-fua.(a.DepartmentofColorectalSurgery,b.DepartmentofPediatricSurgery,AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256600,China)

Abstract：ObjectiveTo analyze IDO expression in colorectal cancer and its clinical significance.MethodsThe complete sets of paraffin tissue samples of 60 patients diagnosed as colorectal cancer in Affiliated Hospital of Binzhou Medical College from Jun.2009 to May 2010 were collected,the IDO expressions of the cases were detected by immunohistochemical methods to analyze the relationship between IDO expression and clinical pathological features.ResultsThe high expression rates of IDO in primary lesion of colorectal tumor,normal tissue adjacent to tumor,lesion with lymph node metastasis and lesion without lymph node metastasis were 75.0%,18.3%,35.3% and 50.0%.IDO expression intensity in primary lesion of colorectal cancer is associated with N staging,Dukes staging,and p53 expression(P<0.05).Results of Spearman correlation analysis showed that the expression of IDO and p53 in primary lesion of colorectal cancer has a significant positive correlation(rspan=0.352,P=0.006).ConclusionIDO expression is significantly up-regulated in colorectal cancer,and closely related with tumor node metastasis,therefore,it can be used as an indicator to determine the prognosis of colorectal cancer.IDO expression and p53 expression are closely related,they may both be involved in the incidence and development of colorectal cancer.

Key words：Colorectal cancer; Indoleamine 2,3-dioxygenase; p53

收稿日期：2014-02-17修回日期：2014-06-24編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.078

中圖分類號(hào):R735.34

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)06-1148-03