高效液相色譜雙波長法同時測定猴耳環(huán)消炎片中沒食子酸和槲皮苷含量

陳 軍，羅德珍，李鏡友，張志堅，任錦文，沈 藝

（1．廣州市花城制藥廠，廣東 廣州 510555； 2．廣東省從化市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510900）

高效液相色譜雙波長法同時測定猴耳環(huán)消炎片中沒食子酸和槲皮苷含量

陳 軍1，羅德珍2，李鏡友1，張志堅1，任錦文1，沈 藝1

（1．廣州市花城制藥廠，廣東 廣州 510555； 2．廣東省從化市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510900）

目的建立同時測定猴耳環(huán)消炎片中沒食子酸和槲皮苷含量的高效液相色譜(HPLC)法。方法采用HPLC雙波長法，以Hypersil BDS-C18柱（250 mm×4．6 mm，5 m）為色譜柱，以乙腈為流動相A、0．2%磷酸為流動相B進行梯度洗脫，沒食子酸檢測波長為270 nm，槲皮苷檢測波長為350 nm。結(jié)果沒食子酸及槲皮苷進樣量分別在0．60～6．00 g，0．03～0．30 g(r=0．999 4)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；沒食子酸平均回收率為100．24%，RSD為1．02%（n=6）；槲皮苷平均回收率為99．88%，RSD為1．17%（n=6）。結(jié)論HPLC雙波長法簡便可行、重復(fù)性好，適用于猴耳環(huán)消炎片2種有效成分的同時測定，可用于猴耳環(huán)消炎片的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；猴耳環(huán)消炎片；沒食子酸；槲皮苷

猴耳環(huán)消炎片(糖衣片)為猴耳環(huán)藥材單味制劑，具有清熱解毒、涼血消腫等功效[1]。本品主要含沒食子酸、槲皮苷和聯(lián)苯三酚[2-4]等成分。而沒食子酸、槲皮苷是猴耳環(huán)消炎、止咳的主要有效成分[5]。另外，沒食子酸還有抗菌、抗病毒[6]和抗腫瘤[7]作用。猴耳環(huán)消炎片部頒標準和局頒標準中均只有沒食子酸的薄層色譜鑒別，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。本研究中選擇沒食子酸、槲皮苷作為主要檢測指標，并首次建立高效液相色譜（HPLC）雙波長法，用于同時測定猴耳環(huán)消炎片中沒食子酸和槲皮苷的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

LC-10AD型高效液相色譜儀，SPD-M20A型PDA檢測器，LC-Solution工作站（日本島津公司）。對照品沒食子酸（批號為110831-200803）和槲皮苷（批號為 111538-200403）均購自中國食品藥品檢定研究院；猴耳環(huán)消炎片（廣州市花城制藥廠，批號為20110317，20110422，20110435）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Hypersil BDS-C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相:A為乙腈，B為0．2%磷酸水溶液，梯度洗脫(見表1)；流速:1 mL／min；柱溫:室溫；檢測波長:270 nm（沒食子酸）、350 nm (槲皮苷)；進樣量：10 μL。各待測組分分離度均大于1．5，理論板數(shù)均不低于3 000。

表1 梯度洗脫條件表

2．2 溶液制備

精密稱取沒食子酸和槲皮苷對照品適量，用甲醇配成含沒食子酸0．30 g／L、槲皮苷15 μg／mL的混合溶液，即得對照品溶液。取本品除去包衣，研細，取0．4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈-0．2%磷酸（25∶75）50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：根據(jù)處方及生產(chǎn)工藝制備缺猴耳環(huán)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液，取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果，陰性樣品對測定無干擾，見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取對照品溶液2，4，8，10，15，20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，沒食子酸為Y= 5．292×106X-3．007×105(r=0．999 4)，槲皮苷為Y=2．593× 106X-7．514×103(r=0．999 4)。結(jié)果表明，沒食子酸、槲皮苷進樣量分別在0．60～6．00 μg和0．03～0．30 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件，重復(fù)測定6次。結(jié)果，沒食子酸和槲皮苷峰面積的 RSD分別為 1．40%和0．93%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一批樣品（批號為20110317），按擬訂方法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件分別進樣測定含量。結(jié)果，沒食子酸和槲皮苷平均含量分別為45．66 mg／g和1．06 mg／g，RSD分別為0．53%和0．93%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品（批號為20110317）溶液，按擬訂色譜條件分別于0，4，8，12，24，36，48 h時進樣測定。結(jié)果，沒食子酸和槲皮苷峰面積的 RSD分別為0．78%和0．65%（n=7），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批樣品（批號為20110317，分別含沒食子酸和槲皮苷45．66 mg／g和1．06 mg／g）約0．25 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，加入相應(yīng)量的沒食子酸對照品溶液（6．02 g／L）2 mL和槲皮苷對照品溶液（0．28 g／L）1 mL，按供試品溶液制備方法制備待測溶液，按擬訂色譜條件進樣測定含量，計算回收率。結(jié)果見表2。

圖1-2 高效液相色譜圖（350 mm）

圖1-1 高效液相色譜圖（270 mm）

表2 沒食子酸和槲皮苷加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2．4 樣品含量測定

分別取3批樣品各3份，按擬訂方法制備供試品溶液并進樣測定。結(jié)果批號為20110317，20110422，20110435的樣品中沒食子酸的含量分別為 45．60，45．12，45．12 mg／g，RSD分別為0．24%，0．88%，0．64%（n=3）；槲皮苷的含量分別為 1．04，1．05，1．15 mg／g，RSD分別為0．82%，1．21%，0．91%（n=3）。

3 討論

取沒食子酸與槲皮苷甲醇溶液，在200～400 nm波長間進行紫外掃描，結(jié)果沒食子酸在（215±2）nm和（270±2）nm波長處有最大吸收，槲皮苷在（256±2）nm和（350±2）nm波長處有最大吸收，與文獻[5，8]所收載的紫外吸收波長一致。為了排除相互的干擾，選用270 nm作為沒食子酸檢測波長，350 nm作為槲皮苷檢測波長。

用甲醇、乙腈-0．2%磷酸（25∶75）、水-甲醇-乙腈（450∶50∶1）、乙腈-磷酸鹽緩沖液等作溶劑，對溶劑的量、超聲時間進行試驗，結(jié)果用乙腈-0．2%磷酸（25∶75）作為溶劑，超聲處理20 min最理想。

猴耳環(huán)藥材中鞣質(zhì)類成分在煎煮過程中水解為沒食子酸，隨著煎煮時間的延長，沒食子酸含量呈上升趨勢[9]。但實際生產(chǎn)工藝中煎煮時間如何確定，還應(yīng)進行更多的沒食子酸熱分解和動力學(xué)研究[10]。

[1]WS3-B-1248-92．衛(wèi)生部藥品標準·中藥成方制劑(第六冊)·猴耳環(huán)消炎片[S]．

[2]王永剛，淡 墨，李詠華，等．猴耳環(huán)化學(xué)成分的研究[J]．中藥材，2005，28(9)：774-775．

[3]蘇妙賢，唐之岳，黃偉歡，等 ．猴耳環(huán)化學(xué)成分研究[J]．中藥材，2009，32(5)：705-707．

[4]張志堅，李鏡友，李國強．猴耳環(huán)研究進展[J]．中國藥業(yè)，2010，19（18）: 82-84．

[5]柯銘清．中草藥有效成分理化與藥理特性[M]．第2版．長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1982：105-106，233．

[6]江紀武，肖慶祥．植物藥有效成分手冊[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：479．

[7]季宇彬，張廣美．中草藥抗腫瘤有效成分藥理與應(yīng)用[M]．哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1998：239．

[8]陳德昌．中藥化學(xué)對照品工作手冊[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：106．

[9]朱詩塔，李新中，雷 鵬，等．不同煎煮法對大黃沒食子酸含量的影響及與小腸推進作用的相關(guān)性[J]．中南藥學(xué)，2008，6（6）：714-717．

[10]郭滿滿，肖卓炳，彭密軍，等．沒食子酸的熱穩(wěn)定性研究[J]．林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2012，32（4）：58-62．

Content Determination ofGallicAcid and Quercitrosidein Houerhuan Xiaoyan Pills by HPLC Dual Wavelength Method

Chen Jun1,Luo Dezhen2,Li Jingyou1,Zhang Zhijian1,Ren Jinwen1,Shen Yi1
（1．Guangzhou Huacheng Pharmaceutical Factory,Guangzhou,Guangdong,China 510555; 2．Conghua Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou,Guangdong,China 510900）

Objective To establish an HPLC method for simultaneous detection of Gallic acid and Quercitroside in Houerhuan Xiaoyan Pills．Methods The HPLC dual wavelength spectrophotometry was used with Hypersil BDS-C18(250 mm×4．6 mm,5 μm)column;with acetonitrile as mobile phase A,0．2% phosphoric acid as mobile phase B,for gradient elution;the detection wavelength of gallic acid was 270 nm;the detection wavelength of quercitroside was 350 nm．Results The linear relations were good of gallic acid in the range of 0．60-6．00 μg(r=0．999 4)and quercitroside in the range of 0．03-0．30 μg(r=0．999 4);the average recovery of gallic acid was 100．24%,RSD 1．02%（n=6）;the average recovery of quercitroside was 99．88%,RSD 1．17%（n=6）．Conclusion HPLC dual wavelength determination is simple and feasible,with good reproducibility,is suitable for the simultaneous determination of the active ingredients in Houerhuan Xiaoyan Pills,and can be used for quality control of Houerhuan Xiaoyan Pills．

HPLC;Houerhuan Xiaoyan Pills;gallic acid;quercitroside

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2015)21-0129-02

2015-01-27；

2015-06-24)