高功率多普勒血流探測儀結合血流成像儀觀察氯吡格雷對高血壓大鼠微循環(huán)的影響*

劉曉慶 仉紅剛 張秋菊 李乾豪 修瑞娟

高功率多普勒血流探測儀結合血流成像儀觀察氯吡格雷對高血壓大鼠微循環(huán)的影響*

劉曉慶 仉紅剛#張秋菊 李乾豪 修瑞娟

目的：觀察抗血小板藥物氯吡格雷對高血壓大鼠微循環(huán)的影響。方法：SPF級雄性13周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，隨機分為溶劑對照組和氯吡格雷組，每組5只,分別灌胃1ml 0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)和氯吡格雷溶液(10mg/kg)，每日一次。連續(xù)四周后，用高功率激光多普勒血流探測儀(LDF)檢測大鼠腦皮質、耳廓及趾血流量、血細胞聚集度和血流速度，用血流成像儀(LDPI)觀察腦血流分布狀態(tài)。統(tǒng)計學分析檢測指標的組間差異。結果：除血細胞聚集度和腦皮質血流速度外，氯吡格雷組大鼠上述LDF檢測指標值均高于溶劑對照組(P<0.05或P<0.01)，LDPI檢測腦皮質血流分布曲線整體右移，腦皮質高血流量(800-1500PU)面積百分比較溶劑對照組明顯增加(P<0.01)。結論：氯吡格雷可明顯改善SHR微循環(huán)障礙。

氯吡格雷；微循環(huán)；激光多普勒；自發(fā)性高血壓大鼠

有研究[1]表明我國高血壓發(fā)病率已達29.6%，約每3個成人中就有1人是高血壓患者。不同個體高血壓的病因和機制不盡相同，目前研究主要集中在交感神經系統(tǒng)活性亢進、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活及胰島素抵抗等環(huán)節(jié)，微循環(huán)障礙也備受關注。臨床治療高血壓除降壓藥物外，抗血小板治療已成為改善高血壓預后的重要內容[2]。本文采用高功率激光多普勒血流探測儀(LDF)和成像儀(LDPI)觀察分析抗血小板藥物氯吡格雷(Clopidogrel)對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)微循環(huán)障礙的影響，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

SPF級13周齡雄性SHR 10只，購自北京維通利華公司[生產許可號:SCXK(京)2012-0001]，體重270±10g。適應性飼養(yǎng)3天后，按隨機數字表法分為溶劑對照組和氯吡格雷組(n均=5)。兩組大鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食、進水，保持環(huán)境安靜，12h周期光照，室溫24±2℃。實驗及實驗后處理均符合中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院倫理委員會要求。

1.2 試劑和藥物

0.5% 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，美國Sigma公司)；氯吡格雷片(法國賽諾菲制藥有限公司，批號：4A686)，實驗時碾壓成粉末溶于0.5%CMC-Na中，避光保存。

1.3 儀器及分析軟件

LDF和LDPI均來自英國Moor公司，型號分別為moor VMS-LDF1-HP和moor LDI-HIR；數據分析軟件分別為moor VMS-PC Version 3.1 for Vascular Monitor System和moor LDI Image Review Version 5.3。

1.4 實驗動物給藥

溶劑對照組大鼠給予0.5% CMC-Na 1ml灌胃，氯吡格雷組給予氯吡格雷溶液(劑量為10mg/kg，參考相關文獻[3]中人和大鼠藥物劑量換算關系確定)。1次/天，持續(xù)4周。

1.5 微循環(huán)觀察方法和指標

治療結束后，3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。在室溫(23℃)中將大鼠左側臥位，分別于大鼠右耳耳廓邊緣近心端5mm處、右后肢中趾背側向心端5mm處放置LDF探頭，連續(xù)測量其血流量、血細胞聚集度和血流速度2min。再將大鼠俯臥位，頭部備皮，矢狀位剪開額頂部皮膚2cm，暴露顱骨前囟及左側顱骨，標定前囟左5mm、后3mm處放置LDF探頭，連續(xù)測量其血流量、血細胞聚集度和血流速度2min。最后將此暴露部位置于LDPI下，進行腦血流成像監(jiān)測。數據分析軟件可直接輸出監(jiān)測2min內的各項指標數值，在其平穩(wěn)時段內選取5個時點的數值進行統(tǒng)計學分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組大鼠血流量比較及腦皮質血流分布

LDF監(jiān)測結果顯示，氯吡格雷組大鼠腦皮質、耳廓及趾血流量值(PU)均明顯高于溶劑對照組(t值分別為2.426、4.851和2.589)，見表1。LDPI監(jiān)測顯示氯吡格雷組大鼠腦血流分布曲線較溶劑對照組整體右移，高血流量(800-1500PU)面積百分比明顯大于溶劑對照組(48.40±13.12 vs 17.70±8.64，t=4.358，P<0.01)，見圖1。

表1 兩組大鼠血流量均=5)

注：與溶劑對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 兩組大鼠血細胞聚集度比較

LDF監(jiān)測結果顯示，兩組大鼠腦皮質、耳廓及趾血細胞聚集度差異無統(tǒng)計學意義(t值分別為1.105、1.130和0.778，P>0.05)，見表2。

表2 兩組大鼠血細胞聚集度均=5)

2.3 兩組大鼠血流速度比較

LDF監(jiān)測結果顯示，氯吡格雷組大鼠耳廓及趾的血流速度比溶劑對照組明顯加快(t值分別為5.388和3.298，P<0.05或P<0.01)，兩組間腦皮質血流速度差異無統(tǒng)計學意義(t=1.105，P>0.05),見表3。

表3 兩組大鼠血流速度均=5)

注：與溶劑對照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

微循環(huán)功能障礙是高血壓等心血管系統(tǒng)疾病的重要病理生理過程，并且對高血壓引起的多種終末器官損傷起至關重要的作用[4]。較多研究顯示，高血壓患者或高血壓動物模型均存在微循環(huán)血流量降低、血流速度減慢等障礙性表現[5-7]。降壓治療和抗血小板藥物對改善高血壓患者癥狀、體征以及預防腦卒中等并發(fā)癥有非常積極的意義[2]。氯吡格雷是常用的抗血小板藥物之一，主要經過肝臟細胞色素P450(CYP450)同工酶CYP3A4、CYP2C19以及CYP3A5氧化成具有活性的硫氫基代謝產物，通過阻斷二磷酸腺苷(ADP)與其受體(P2Y12受體)結合而抑制血小板活化[8]。此外，氯吡格雷還具有抑制炎癥反應、改善血管功能、提高一氧化氮(NO)生物利用率以及抑制內皮微粒產生等作用[9-12]，故在臨床治療心血管疾病應用較廣泛。

圖1 兩組大鼠腦皮質血流分布曲線(n均=5)

LDF是一種先進激光多普勒技術，通過實時連續(xù)監(jiān)測組織微循環(huán)血流灌注、血細胞聚集度以及血液流速，可真實反映體表和組織器官的微循環(huán)狀態(tài)[13]。隨著其多種激光探頭的出現、靈敏度的提高以及LDPI的運用，使LDF檢測更加形象、廣泛和靈活。高功率LDF掃描深度可達3mm，不需要打開顱骨即可準確測定顱骨下腦皮質微循環(huán)狀態(tài)，結合LDPI可清晰顯示血流分布情況。本文采用該技術觀察氯吡格雷對原發(fā)性高血壓大鼠腦皮質、耳廓及趾的血流量、血流速度、血細胞聚集度和腦皮質血流分布變化的影響，取得的相應結果說明這一技術可為研究藥物對微循環(huán)的影響提供新的方式和方法。

研究發(fā)現，應用氯吡格雷干預可改善微循環(huán)，如提高血管舒張程度，從而改善皮膚微血管功能[14]，降低2型糖尿病患者循環(huán)內皮細胞水平[15]等。本實驗結果表明SHR腦皮質、耳廓及趾血流量和血流速度均明顯降低，腦皮質高血流量面積減小，經氯吡格雷干預四周后，SHR上述微循環(huán)指標均顯著高于溶劑對照組，證實氯吡格雷可以通過提高組織器官血流量和血流速度，改變血流分布，達到改善微循環(huán)的目標。這與有關氯吡格雷通過調控微血管舒縮能力，減少異常微血管結構，增加微血管數目從而改善高血壓預后并降低心、腦并發(fā)癥發(fā)生[3,4]的報告結果相符合。所以，應用氯吡格雷干預可能有利于防治高血壓患者并發(fā)心、腦血管疾病。

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本文第一作者簡介：

劉曉慶(1988—)，女，漢族，碩士研究生，主要研究方向：內皮細胞損傷與高血壓微循環(huán)障礙

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2 Lip YH, Felmeden DC, Dwivedi G. Antiplatelet agents and anticoagulants for hypertension[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2011, 7(12): CD003186.

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14 Dahmus JD, Bruning RS, Kenney WL, et al. Oral clopidogrel improves cutaneous microvascular function through EDHF-dependent mechanisms in middle-aged humans[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2013, 305(4): 26.

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口服頭孢克洛發(fā)生血清病樣反應患兒的腸道通透性變化

本刊編委，武漢市兒童醫(yī)院向贇教授和張振(共同第一作者)等在《European journal of pediatrics》(2013, 172: 537-543，4區(qū)，IF=1.983)發(fā)表了題為“Intestinal mucosal permeability of children with cefaclor-associated serum sickness-like reactions”的研究論文，主要內容如下：

1 研究背景和目的：頭孢克洛為第5代抗生素，病原微生物感染者在服用過程中會產生藥物副作用，如皮疹、血管神經性水腫、蕁麻疹、多形性紅斑、關節(jié)炎、關節(jié)痛、發(fā)熱等血清病樣反應(SSLR)，且在兒科患者中較頻發(fā)。本文通過檢測口服頭孢克洛患兒尿乳果糖、尿甘露醇及血漿二胺氧化酶(DAO)水平及尿乳果糖/甘露醇(L/M)比值，研究頭孢克洛SSLR對患兒腸道通透性的影響及其機制，為合理有效利用頭孢克洛、降低副作用提供實驗依據。

2 主要方法：82例上呼吸道感染患兒，口服頭孢克洛后發(fā)生SSLR者為SSLR陽性組(n=42)，未發(fā)生SSLR者為SSLR陰性組(n=40)，同時選擇30例健康兒童作為對照組。在患兒口服頭孢克洛后的第7、9、11、13、15天，利用高效液相色譜法檢測尿乳果糖、尿甘露醇含量后計算尿L/M比值，利用酶分光光度法檢測血漿DAO水平；對照組兒童不口服頭孢克洛，平行檢測相同指標。

3 結果：SSLR陽性組患兒尿L/M比值從口服頭孢克洛后的第7天至13天逐漸增加，第13天達到峰值，隨后開始下降，但均高于同時點的SSLR陰性組和對照組(P<0.05)；SSLR陰性組和對照組兒童尿L/M比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SSLR陽性組患兒第9、11、13、15天的血漿DAO水平高于同時點的SSLR陰性組和對照組(P<0.05)；SSLR陰性組和對照組血漿DAO差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SSLR陽性組患兒尿L/M比值的變化早于血漿DAO。

4 結論：尿L/M比值和血漿DAO水平升高可反映頭孢克洛SSLR患兒的腸道通透性變化。

Effects of Clopidogrel on Microcirculation of Spontaneous Hypertensive Rats by High Power Laser Doppler Flowmetry Combined with Laser Doppler Perfusion Imaging

LIU Xiao-qing，ZHANG Hong-gang#，ZHANG Qiu-ju，LI Qian-hao，XIU Rui-juan

Institute of Microcirculation，Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences，Key Laboratory of Microcirculation，Ministry of Health，Beijing 100005，China；#

Objective: To observe the effect of antiplatelet drug(Clopidogrel) on the microcirculation of Spontaneous Hypertensive Rat(SHR). Method: Two groups of 13-week-old male SHRs were studied with 5 rats in each group: placebo control and clopidogrel (10mg/kg). Drugs therapy was administered by oral perfusion for 4 weeks continuously. The blood flow, blood flow velocity, blood cell aggregation and whole distribution curve of blood flow of SHR's cerebral cortices, auricles and toes were detected by the high power Laser Doppler flowmetry and the Laser Doppler Perfusion Imaging.Results: In SHR treated with clopidogrel, the above indexes were significantly increased comparing with placebo control group(P<0.05 orP<0.01)except blood cell aggregation and blood flow of cerebral cortices. The whole distribution curve of blood flow moved to the right and the high blood flow of cerebral cortices (800-1500PU) was obviously increased comparing with placebo control group(P<0.01).Conclusion: Clopidogrel can improve the SHR’s microcirculation.

Clopidogrel; Microcirculation; Laser doppler; Spontaneous Hypertension Rat

國家自然科學基金(11274046)

北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院微循環(huán)研究所，衛(wèi)生部微循環(huán)重點實驗室，北京 100005；#

，zhanghg1966126@imc.pumc.edu.cn

本文2014-12-15收到，2015-02-28修回

R331.3+5 R544.1

A

1005-1740(2015)02-0030-04