人血小板裂解液促進(jìn)人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

董 晶 聶李平 周 宇

人血小板裂解液促進(jìn)人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化

董 晶 聶李平 周 宇

目的：研究人血小板裂解液(HPL)對(duì)羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(AMMSCs)成骨分化的作用。方法：分別以含7% HPL(HPL組)和10%胎牛血清(FBS，F(xiàn)BS組)的LG-DMEM培養(yǎng)介質(zhì)擴(kuò)增AMMSCs，比較兩組擴(kuò)增AMMSCs效率及其免疫表型SSEA-3和SSEA-4的表達(dá)差異。使用MSCs成骨分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)AMMSCs成骨，對(duì)比觀察兩組鈣鹽沉積量、鈣化結(jié)節(jié)、堿性磷酸酶(ALP)活性；提取兩組成骨誘導(dǎo)后AMMSCs總RNA，采用RT-PCR檢測成骨分化調(diào)節(jié)因子RUNX-2和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：HPL組擴(kuò)增速度快于FBS組；AMMSCs的 SSEA-3和SSEA-4表達(dá)較FBS組明顯下調(diào)(P<0.05)。HPL組鈣鹽沉積量、鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量、ALP活性以及RUNX-2和ALP mRNA表達(dá)量均明顯高于FBS組(P均<0.05)。結(jié)論：含HPL培養(yǎng)介質(zhì)可促進(jìn)AMMSCs成骨分化。

人血小板裂解液；間充質(zhì)干細(xì)胞；羊膜來源；成骨分化

研究表明，羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Amniotic Membrane-derived Mesenchymal Stem Cells, AMMSCs)的免疫表型與骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMMSCs)相似，具有多向分化能力，并且比BMMSCs有更強(qiáng)的擴(kuò)增能力[1,2]。羊膜來源廣泛，受社會(huì)倫理學(xué)限制少，是MSCs來源的重要研究目標(biāo)。血小板富含的各種生長因子能促進(jìn)MSCs增殖，加速種植體周圍骨再生和修補(bǔ)骨缺損[3]。本實(shí)驗(yàn)觀察含人血小板裂解液(Human Platelet Lysate, HPL)培養(yǎng)液擴(kuò)增AMMSCs并誘導(dǎo)其成骨分化，探討HPL對(duì)AMMSCs成骨分化的影響，分析該方式的優(yōu)勢，為利用AMMSCs進(jìn)行骨缺損治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

流式細(xì)胞儀(XL-4，Beckman，美國)，全自動(dòng)生化儀(AU-5400，Olympus，日本)，基因擴(kuò)增儀(ABI-7500，Gene，美國)，胎牛血清(FBS，Gibco，美國，635742)，LG-DMEM (Hyclone，美國，NXH0681)，0.25% Trypsin (Hyclone，美國，NWD0400)。堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(Beckman，美國，AUZ1780)，Ca2+濃度檢測試劑盒(Beckman，美國，AUX2129)，細(xì)胞裂解液Triton X-100 (Roche，瑞士) ，胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物鼠抗人單克隆抗體SSEA-4-PE、 SSEA-3-Alexa Fluor 488及同型對(duì)照均為美國BioLegend公司產(chǎn)品，MSCs成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)液、茜素紅S均購自美國Cyagen公司。

1.2 AMMSCs的分離、擴(kuò)增和成骨誘導(dǎo)分化

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液的制備及AMMSCs分離與擴(kuò)增： 參照作者前期方法[2]，制備含F(xiàn)BS或HPL的細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)文獻(xiàn)[1]通過兩步酶消化法分離人羊膜組織收獲AMMSCs，將AMMSCs分別加入含F(xiàn)BS(FBS組)或HPL(HPL組)細(xì)胞培養(yǎng)液中并接種于培養(yǎng)皿，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，以0.25% Trypsin消化傳代。

1.2.2 AMMSCs的成骨誘導(dǎo)分化：當(dāng)?shù)?代AMMSCs生長至80%-90%融合時(shí)，以0.25% Trypsin消化，中和胰酶后150g離心10min，按3 × 103/cm2接種于預(yù)先以明膠包被的6孔板，分別加入含F(xiàn)BS或HPL的培養(yǎng)液至2ml。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液。再各加入2ml MSCs成骨分化培養(yǎng)液培養(yǎng)。每3天換液一次，共14天。

1.3 AMMSCs的擴(kuò)增速度和免疫表型鑒定

從原代培養(yǎng)48h開始觀察，比較兩組培養(yǎng)達(dá)到80%-90%融合時(shí)所需的時(shí)間。待第3代AMMSCs達(dá)80%-90%融合時(shí)，制成1.0×109/ L的細(xì)胞懸液，分別加入熒光標(biāo)記抗體SSEA-4-PE、SSEA-3-Alexa Fluor 488及其陰性對(duì)照單抗，室溫反應(yīng)30min，再用PBS洗滌并重懸細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 成骨指標(biāo)的檢測

1.4.1 鈣鹽沉積量測定：成骨誘導(dǎo)7天、14天后PBS洗滌培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞層，加入1mol/L HCl 2ml，充分振蕩后密封置于4℃冰箱保存過夜，使沉積在胞外的鈣基質(zhì)充分溶解，24h后以1 500g離心10min，用Ca2+試劑盒在自動(dòng)生化儀上測定上清液中的Ca2+濃度。

1.4.2 鈣化結(jié)節(jié)染色：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后PBS洗滌培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞層，4%甲醛固定30min，再次使用PBS洗滌細(xì)胞2次后，0.1%茜素紅S染色3-5min，去離子水沖洗，鈣化結(jié)節(jié)被染成紅色。HPL組和FBS組各取3個(gè)培養(yǎng)孔，顯微鏡下每孔隨機(jī)選3個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)鈣結(jié)節(jié)數(shù)量，取9個(gè)視野均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.3 ALP活性測定：成骨誘導(dǎo)7天、14天PBS洗滌培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞層后，每孔加入3ml 細(xì)胞裂解液(1%Triton X-100)置于4℃冰箱內(nèi)保存，12h后吹打使細(xì)胞充分破碎，1 500g離心5min，采用全自動(dòng)生化儀測定上清液中ALP活性。

1.4.4 成骨相關(guān)基因RUNX-2及ALP mRNA檢測：成骨誘導(dǎo)第7天、14天按常規(guī)方法提取AMMSCs總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測無降解后，取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測RUNX-2 mRNA和ALP mRNA表達(dá)，擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件均參照說明書設(shè)定。β-actin為內(nèi)參，所用引物序列如表1。以目的基因與β-actin mRNA比值表示目的基因表達(dá)量。

表1 RT-PCR的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AMMSCs的生長速度和形態(tài)

AMMSCs原代培養(yǎng)48h后，可觀察到貼壁生長的長梭形成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞小克隆形成，HPL組7-10天即可達(dá)到80%-90%融合，F(xiàn)BS組則需10-14天。傳代后細(xì)胞呈渦旋狀或平行生長(圖1)。

2.2 兩組AMMSCs免疫表型陽性率

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，部分AMMSCs表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志SSEA-4和SSEA-3，HPL組AMMSCs的SSEA-4和SSEA-3陽性率顯著低于FBS組(t值分別為3.843和4.608，P均<0.05)，見圖2和表2。

注：A，F(xiàn)BS組；B，HPL組圖2 FBS組和HPL組第3代AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4表達(dá)流式圖

表2 兩組AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4陽性率均=5)

注：與FBS組比較，1)P<0.05

2.3 兩組鈣鹽沉積量

AMMSCs成骨分化后第7天和第14天，HPL組的Ca2+總量均高于FBS組(表3)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.439和17.750，P均<0.05)。

表3 兩組Ca2+總量均=5)

注：與FBS組比較，1)P<0.05

2.4 兩組鈣化結(jié)節(jié)形成及其數(shù)量

HPL組AMMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2天后，細(xì)胞開始變短，外形由長梭形向多邊形轉(zhuǎn)變，培養(yǎng)7 天后細(xì)胞基質(zhì)中即有鈣沉積，培養(yǎng)14天時(shí)形成鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅S染色顯示HPL組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量多于FBS組，且大而密集(圖3)。計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 22.90±6.20 vs 10.80±3.30，t=12.389，P<0.05)。

2.5 兩組ALP活性

AMMSCs成骨分化后第7天和第14天，HPL組ALP活性均明顯高于FBS組(表4)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為13.035和11.231，P均<0.05)。

表4 兩組ALP活性均=5)

注：與FBS組比較，1)P<0.05

2.6 兩組成骨相關(guān)基因表達(dá)

PCR結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)第7天和第14天，HPL組的成骨分化特異性基因RUNX-2 mRNA和ALP mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于FBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

[本文圖1、圖3見封3]

3 討 論

MSCs具有多向分化潛能、低免疫原性和修復(fù)作用，這些特點(diǎn)使其在再生醫(yī)學(xué)中有良好利用價(jià)值[4,5]。胎盤組織富含干細(xì)胞[6]，足月羊膜是MSCs的高通量來源[1]，對(duì)其研究不涉及倫理道德問題。HPL富含促進(jìn)MSCs增殖的血小板衍生生長因子(Platelet-derived Growth Factor，PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast Growth Factor，bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等生長因子[7],成為擴(kuò)增臨床應(yīng)用規(guī)模MSCs最合適的人源化FBS替代品[8], 是目前骨組織工程學(xué)領(lǐng)域有關(guān)種子細(xì)胞的成骨分化能力和體外擴(kuò)增能力研究的有益嘗試。本文研究HPL對(duì)AMMSCs的擴(kuò)增和成骨分化能力，為AMMSCs在臨床骨組織工程學(xué)上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

SSEA-3和SSEA-4為胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志，在分化后的干細(xì)胞中不能被檢測到[9]。本文結(jié)果中，HPL介質(zhì)擴(kuò)增的AMMSCs的SSEA-3和SSEA-4表達(dá)陽性率顯著低于FBS介質(zhì)擴(kuò)增的AMMSCs，說明HPL更能促進(jìn)AMMSCs的分化，而FBS介質(zhì)擴(kuò)增的AMMSCs處于更原始狀態(tài)。與有關(guān)文獻(xiàn)[10]認(rèn)為HPL富含的TGF-β、PDGF能促進(jìn)MSCs生長，同時(shí)也能誘導(dǎo)MSCs分化的結(jié)論一致。而且HPL中所含bFGF這一能支持未分化人胚胎干細(xì)胞生長的物質(zhì)含量相對(duì)很低[11]，故而不會(huì)影響HPL對(duì)MSCs的分化[6-8]。

注：與FBS組第7天比較，*P<0.05;與FBS組第14天比較，#P<0.05圖4 兩組成骨相關(guān)基因RUNX-2 mRNA和ALP mRNA相對(duì)表達(dá)量(n均=6)

ALP能使磷酸根離子濃度增加而啟動(dòng)細(xì)胞鈣化，尤其在鈣鹽沉積中起關(guān)鍵作用,其活性升高是成骨分化的特異性標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)成骨分化第7天和第14天，HPL組ALP活性和Ca2+總量較FBS組均明顯增高，PCR結(jié)果提示HPL組ALP mRNA明顯增多，表明HPL組的AMMSCs成骨分化程度較高。鈣鹽是骨骼的重要組成部分，茜素紅S染色顯示HPL組的鈣化結(jié)節(jié)較FBS組數(shù)量多且大而密集，進(jìn)一步說明HPL能促進(jìn)成骨過程中鈣鹽的沉積。

成骨分化過程經(jīng)多能干細(xì)胞定向分化為前成骨細(xì)胞、幼稚的成骨細(xì)胞直至成熟的成骨細(xì)胞。RUNX-2是成骨分化過程的重要監(jiān)控因子，從成骨分化的啟動(dòng)階段即開始參與成骨分化的調(diào)控，通過上調(diào)I型膠原蛋白、骨橋蛋白、骨分泌蛋白和骨鈣蛋白等多種骨基質(zhì)蛋白基因，引導(dǎo)多能干細(xì)胞向非成熟成骨細(xì)胞分化，對(duì)骨組織的形成起著重要作用[12]。本文結(jié)果表明，HPL組AMMSCs的RUNX-2 mRNA表達(dá)水平明顯高于FBS組，亦即HPL培養(yǎng)介質(zhì)能更好促進(jìn)AMMSCs的成骨分化。與HPL能增強(qiáng)BMMSCs成骨分化基因、ALP表達(dá)、礦物質(zhì)沉積、增強(qiáng)體外成骨分化和體內(nèi)異位骨形成的研究報(bào)道相符合[13,14]，也與醫(yī)學(xué)上應(yīng)用富血小板血漿促進(jìn)骨折愈合的臨床實(shí)踐相符合。

綜上所述，含HPL的培養(yǎng)介質(zhì)能快速擴(kuò)增AMMSCs，并能促進(jìn)AMMSCs成骨分化，為骨組織工程研究及臨床上促進(jìn)骨折愈合提供了一種新的AMMSCs擴(kuò)增體系。

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本文第一作者簡介：

董 晶(1981-)，男，漢族，碩士，主管技師

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Human Platelet Lysate Enhances Human Amnion-derived Mesenchymal Stem Cells (AMMSCs) Osteogenic Differentiation

DONG Jing，NIE Li-ping，ZHOU Yu

Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036,China

Objective: To investigate the effect of human platelet lysate (HPL) on amnion-derived mesenchymal stem cells (AMMSCs) osteogenic differentiation.Method: AMMSCs were amplified by LG-DMEM medium supplemented with 7% HPL(HPL group) or 10% fetal bovine serum (FBS,FBS group). The surface molecular markers potential SSEA-3 and SSEA-4 were compared. When AMMSCs were used for osteogenic differentiation, ALP activity and calcium deposition were comparatively observed. Total RNA was isolated and the gene expression of RUNX-2 and ALP were investigated by RT-PCR.Results: HPL-containing medium significantly accelerated MSCs proliferation as compared with FBS containing medium. Expressions of embryonic stem cell markers SSEA-3 and SSEA-4 on AMMSCs were promoted down-regulation by HPL-containing medium than that of FBS-containing medium. HPL-containing medium significantly improved ALP activity and calcium deposition, which also enhanced the mRNA level of RUNX-2 and ALP (P<0.05).Conclusion: HPL-containing medium promotes osteogenic differentiation of AMMSCs.

Human platelet lysate; Mesenchymal stem cells; Amnion; Osteogenic differentiation

北京大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳 518036

本文2015-01-10收到，2015-03-18修回

Q343.6

A

1005-1740(2015)02-0022-05