痰瘀互結(jié)型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠視網(wǎng)膜和腸系膜微循環(huán)觀察*

張方申 彭 欣 秦 林 張海燕 閆 濱 武 雙

痰瘀互結(jié)型動(dòng)脈粥樣硬化大鼠視網(wǎng)膜和腸系膜微循環(huán)觀察*

張方申1彭 欣2，#秦 林2張海燕2閆 濱2武 雙2

目的：觀察痰瘀互結(jié)型動(dòng)脈粥樣硬化(AS)大鼠視網(wǎng)膜和腸系膜微循環(huán)的變化。方法：雄性6周齡Wistar大鼠40只，其中20只采用維生素D3(VD3)大劑量腹腔注射聯(lián)合高脂乳劑長(zhǎng)期灌胃的方法，建立痰瘀互結(jié)型AS大鼠模型(AS組)，其余20只平行腹腔注射生理水以及純凈水灌胃作為對(duì)照組。對(duì)兩組大鼠進(jìn)行視多膜熒光造影，觀察視網(wǎng)膜微血管形態(tài)及伴行動(dòng)、靜脈管徑比值(DA/DV)。采用微循環(huán)觀測(cè)系統(tǒng)分析兩組大鼠腸系膜微血管形態(tài)、血流速度和DA/DV。結(jié)果：VD3大劑量腹腔注射聯(lián)合高脂乳劑長(zhǎng)期灌胃可成功建立痰瘀互結(jié)型AS大鼠模型，與對(duì)照組比較，AS組大鼠體重增加(t=5.99,P<0.05),總膽固醇水平升高(t=-13.94,P<0.05)，動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)≥4.0。AS組大鼠視網(wǎng)膜及腸系膜微血管數(shù)量減少、形態(tài)異常，血供不足，血液流速較對(duì)照組明顯減慢(P<0.05)、微動(dòng)脈變細(xì)、DA/DV明顯小于對(duì)照組(P均<0.05)；并可見視網(wǎng)膜微血管瘤及血液滲出。結(jié)論：觀察痰瘀互結(jié)型AS大鼠視網(wǎng)膜及腸系膜微循環(huán)變化，可為臨床診療和新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

痰瘀互結(jié)；動(dòng)脈粥樣硬化；微循環(huán)；大鼠

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)患者多表現(xiàn)為體胖多痰、肢體麻木疼痛、苔白膩、脈沉滑或澀、舌暗紫。既有“津液結(jié)聚”的痰濁病征，又有“血行緩滯”的血瘀表現(xiàn)。其中醫(yī)證型為典型的痰瘀互結(jié)證[1]。隨著國(guó)民生活水平的提高，煙酒和肉類飲食的增加，痰瘀互結(jié)型AS比例日見增加[2]。

上世紀(jì)60年代有臨床學(xué)者提出，AS患者眼底微循環(huán)與心腦血管微循環(huán)病變密切相關(guān)[3]。晚近臨床也發(fā)現(xiàn)，AS患者腸系膜磁共振圖像也呈現(xiàn)出相應(yīng)的病理變化[4]。但在基礎(chǔ)研究中，AS動(dòng)物模型的微循環(huán)研究尚顯不足，痰瘀互結(jié)型AS大鼠模型的微循環(huán)相關(guān)報(bào)道更為匱乏。基于AS可能引起全身微循環(huán)改變的認(rèn)識(shí)[5],本文對(duì)正常大鼠及痰瘀互結(jié)型AS大鼠進(jìn)行了多部位微循環(huán)觀察比較，為臨床診療和新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康雄性6周齡Wistar大鼠40只,體重190±10g，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(魯)20130001。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對(duì)照組(對(duì)照組)和痰瘀互結(jié)型AS模型組(AS組)，每組20只。兩組大鼠均籠養(yǎng)，普通飼料，潔凈飲水。實(shí)驗(yàn)室溫度21℃-24℃ ，相對(duì)濕度55%-75%，光照10h。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：手持式視網(wǎng)膜照相機(jī)，日本興和株式會(huì)社生產(chǎn)，型號(hào)Genesia-D；共聚焦激光造影系統(tǒng)，德國(guó)海德堡公司生產(chǎn)，型號(hào)HRA；微循環(huán)顯微鏡和醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，型號(hào)BI-2000；電子分析天平，上海精科天平公司生產(chǎn)，型號(hào)FA 1004；Image-Pro Plus 5.0.2圖像處理分析軟件，美國(guó)Media Cybernetics出品。水浴溫鍋、磁力攪拌器、GB303電子天平均由濟(jì)南長(zhǎng)征醫(yī)療器械公司提供。

1.2.2 試劑：總膽固醇(TC)測(cè)試盒、高密度脂蛋白(HDL)測(cè)試盒，北化康泰臨床試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為006340和006328；鹽酸環(huán)噴托酚滴眼液，s.a.ALCON-COUVREURn.v.生產(chǎn)，批號(hào)H20070213；熒光素鈉注射液，廣州白云山明興制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)140201；維生素D3，阿拉丁試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)A1413005；水合氯醛，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20130325。高脂乳劑自行配制，所需試劑及方法：豬油20g放入200ml燒杯中，磁力攪拌器加熱溶化。當(dāng)溫度升到100℃時(shí)加入5g 膽固醇，溶化后再加入1g丙硫氧嘧啶,充分?jǐn)噭?，然后加?0ml吐溫-80制成油相。同時(shí)，在另一燒杯中加入蒸餾水30ml和丙二醇20ml，電爐上加熱至60℃時(shí)加入1g膽酸鈉、1g谷氨酸鈉,充分?jǐn)嚢柚钡酵耆芙?制成水相。最后將水相加入油相中充分?jǐn)嚢杌靹颍瞥筛咧閯?。配制高脂乳劑所需試劑均?gòu)自山東永恩試劑耗材有限公司。

1.3 痰瘀互結(jié)型AS模型制備[6]和對(duì)照組大鼠處理

(1)AS組大鼠按70萬(wàn)IU/kg體重的總劑量腹腔注射VD3，連續(xù)三天，1次/天，第一、二天20萬(wàn)IU/kg, 第三天30萬(wàn)IU/kg；對(duì)照組大鼠腹腔注射相同體積生理鹽水。

(2)VD3注射完成次日，AS組大鼠采用高脂乳劑灌胃(10ml/kg)，1次/天，連續(xù)60天，每10天稱取一次體重。對(duì)照組給予相同體積的純凈水灌胃。

(3)灌胃第60天，所有大鼠禁食12h，斷尾取血1ml，枸櫞酸鈉抗凝，離心后取血漿。酶法測(cè)定TC、選擇性沉淀法測(cè)定HDL，根據(jù)公式(TC-HDL)/HDL計(jì)算動(dòng)脈硬化指數(shù)(AI)。將AI≥4.0并且爪、唇、舌體暗紫，舌下脈絡(luò)紫脹，苔膩或黃或白滑，流涎者確定為痰瘀互結(jié)型AS成模大鼠[7]。AS組成模16只(4只未成模大鼠從組中剔除)，對(duì)照組無(wú)成模大鼠。

1.4 微循環(huán)觀察

1.4.1 視網(wǎng)膜微循環(huán)觀測(cè)：末次灌胃0.5h后，為方便手持視網(wǎng)膜照相機(jī)起見，一律選擇大鼠右眼觀察。腹腔注射5%水合氯醛(3ml/kg)。3min后將鹽酸環(huán)噴托酚滴眼液1滴滴入大鼠右眼中。2min后用手持式視網(wǎng)膜照相機(jī)于暗室中觀察大鼠視網(wǎng)膜微循環(huán)并拍攝照片，相機(jī)曝光強(qiáng)度設(shè)定為0.8-0.9，亮度設(shè)定為低檔。每只大鼠于拍照后10min腹腔注射 10%熒光素鈉注射液(0.8ml/kg)，同時(shí)用共聚焦

激光造影系統(tǒng)對(duì)大鼠視網(wǎng)膜血管進(jìn)行造影并拍攝照片。對(duì)照片中視網(wǎng)膜血管形態(tài)進(jìn)行分析，并通過Image-Pro Plus 5.0.2圖像處理軟件測(cè)量由視盤輻射出的伴行動(dòng)、靜脈管徑比值(DA/DV)。

1.4.2 腸系膜微循環(huán)觀測(cè)：大鼠眼底微循環(huán)觀測(cè)后禁食12h。之后腹腔注射5%水合氯醛(5ml/kg)后，于右下腹側(cè)壁開約2cm切口,沿盲腸端輕緩牽出一段小腸袢,將腸系膜平鋪于37℃的恒溫觀察槽上。采用微循環(huán)顯微鏡(×16)和BI-2000醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)觀察并攝錄近盲腸端的左結(jié)腸動(dòng)脈到中結(jié)腸動(dòng)脈之間的腸系膜微血管和血管網(wǎng)微循環(huán)血流狀態(tài)[8]。15min內(nèi)完成檢測(cè)。觀察指標(biāo)包括：(1)腸系膜微血管形態(tài)：觀察微血管數(shù)量、血液充盈情況和出血點(diǎn)以及血液流態(tài)(線流、線粒流、粒流、擺流)。(2)微血流速度測(cè)定：取直徑10μm左右的前細(xì)動(dòng)脈及與之伴行的靜脈，通過BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定微動(dòng)脈流速(BFVA)和微靜脈流速(BFVV)，每只大鼠選取兩對(duì)微動(dòng)、靜脈,測(cè)量3次取均值。(3)微血管管徑測(cè)量: 采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)上述微動(dòng)脈、微靜脈管徑(DA、DV)進(jìn)行測(cè)定,每對(duì)微動(dòng)、靜脈測(cè)量3次取平均值,并計(jì)算DA/DV[9，10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 成模大鼠特征

(1)AS組20只大鼠中有16只飲食量、活動(dòng)量減少；毛色無(wú)光，雙目無(wú)神，眼瞼變窄甚至出現(xiàn)閉目現(xiàn)象；爪、唇、舌體顏色暗紫，部分舌體出現(xiàn)紫斑，舌下脈絡(luò)紫脹，舌苔厚膩，并有間歇性大便溏薄，噴嚏、流涎。末次體重(545.18±20.74g)高于對(duì)照組(491.00±21.14g)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.99，P<0.05)，符合痰瘀互結(jié)證的體態(tài)特征。

(2)16只成模大鼠血漿TC含量明顯升高，AI≥4.0，均與對(duì)照組有明顯差異(t=-13.94、-6.54，P均<0.05)，符合痰瘀互結(jié)證血脂指標(biāo)的成模標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

2.2 兩組大鼠視網(wǎng)膜微循環(huán)

2.2.1 微循環(huán)形態(tài)：結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠眼底呈均勻鮮紅色，血供充足，毛細(xì)血管豐富；視盤位于眼球后部中央，沿視盤成輻條狀發(fā)出6-8支細(xì)且直的動(dòng)脈，并伴行6-8支略粗的靜脈；動(dòng)、靜脈血管均無(wú)明顯迂曲，且粗細(xì)均勻(圖1A)。注射造影劑后眼底血管顯影迅速，動(dòng)、靜脈均在10s內(nèi)完全充盈，無(wú)熒光滲漏(圖1B)。

表1 兩組大鼠TC、HDL、AI 比較

注:與對(duì)照組比較,1)P<0.05

AS組大鼠眼底顏色呈淡紅色或粉紅色，血供明顯不足，毛細(xì)血管明顯減少；視盤周圍發(fā)出的動(dòng)、靜脈形態(tài)不規(guī)則、迂曲變形嚴(yán)重，粗細(xì)不均勻，并有部分輻射狀動(dòng)、靜脈難以辨認(rèn)或消失(圖1C)。眼底血管注射造影劑后顯影緩慢(3只大鼠1min時(shí)尚未完全顯影)，部分可見血管瘤或熒光滲漏(圖1D)。

2.2.2 DA/DV：與對(duì)照組相比，AS組微動(dòng)脈變細(xì)，微靜脈血管較平直。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，AS組DA/DV較對(duì)照組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.85，P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠視網(wǎng)膜

注:與對(duì)照組比較,1)P<0.05

2.3 兩組大鼠腸系膜微循環(huán)

2.3.1 微血管形態(tài)：對(duì)照組大鼠腸系膜微血管數(shù)量正常，充盈良好，未見出血點(diǎn)；血管壁平滑完整，粗細(xì)均勻；血色深紅；管袢血流以線粒流為主，部分為粒流，未見擺流(圖2A)。AS組大鼠腸系膜微血管數(shù)量明顯減少，較多微血管充盈不良，甚至管袢消失；血管壁平滑度較差或管壁增厚；可見陳舊性出血斑；血色暗紅；管袢血流以粒線流為主，且有較多擺流或聚集流(圖2B)。

2.3.2 微血流速度：AS組大鼠微血流速度明顯減慢，BFVA和BFVV均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.45、6.76，P均<0.05)，見表3。

2.3.3 微血管管徑：與對(duì)照相比，AS組DA明顯縮窄而DV變化不明顯，致DA/DV減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.42,、2.54，P均<0.05)，見表4。

表3 各組大鼠腸系膜微血管

注:與對(duì)照組比較,1)P<0.05

表4 各組大鼠腸系膜微血管DA、DV及

注:與對(duì)照組比較,1)P<0.05

[本文圖1、圖2見封3]

3 討 論

AS的中醫(yī)證型按發(fā)病頻次依次為痰瘀互結(jié)型、肝腎陰虛型、氣虛血瘀型、脾虛濕盛型，其中痰瘀互結(jié)型占32.63%[11]。研究認(rèn)為該證型由過食肥甘厚膩而致脾虛而生痰、痰阻血脈而生瘀，使津液結(jié)聚、血行緩滯，痰瘀互結(jié)侵及脈道引起。本實(shí)驗(yàn)采用高脂乳劑長(zhǎng)期灌胃大鼠，致其痰濕血瘀；通過注射VD3促進(jìn)血管鈣化，協(xié)同損傷血管內(nèi)皮[12]，成功建立痰瘀互結(jié)型AS模型。

廣義微循環(huán)是指直接參與組織、細(xì)胞的物質(zhì)、信息、能量傳遞的血液、淋巴液、組織液的流動(dòng)[13]；但狹義微循環(huán)專指微動(dòng)脈、微靜脈與組織之間微血管中的血液循環(huán)，其重點(diǎn)在微血管的分布、結(jié)構(gòu)、功能及其中血液的流態(tài)、流速和理化性質(zhì)[14]。本文選擇觀察痰瘀互結(jié)型AS大鼠狹義微循環(huán)的相關(guān)變化。

視網(wǎng)膜微血管分布與腦微血管分布相似，其微循環(huán)變化可在一定程度上反映腦微循環(huán)，成為在體微循環(huán)檢查的重要窗口之一[15]。臨床研究多在眼部病患或與之相關(guān)病變時(shí)進(jìn)行視網(wǎng)膜微循環(huán)檢查。既往已經(jīng)開展了的視網(wǎng)膜微循環(huán)相關(guān)研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多為離體觀察，如黃曉燕等[16,17]利用消化鋪片法分別對(duì)高血壓大鼠、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行了相關(guān)分析。其局限性在于只是觀察視網(wǎng)膜微血管的變化，而無(wú)法觀察其中的血液循環(huán)情況。最近馬棟[18]采用眼底血管熒光造影的方法觀察了糖尿病動(dòng)物視網(wǎng)膜微血管損傷，更能說(shuō)明眼底微循環(huán)病理變化。本實(shí)驗(yàn)采用視網(wǎng)膜血管造影聯(lián)合視網(wǎng)膜攝錄技術(shù)對(duì)痰瘀互結(jié)型AS視網(wǎng)膜微循環(huán)進(jìn)行了研究。

臨床上針對(duì)腸系膜的相關(guān)檢查一般采用CT、磁共振、超聲等設(shè)備[4,19,20]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，由于設(shè)備原因，且可接受有創(chuàng)檢查，故多將腸系膜置于倒置顯微鏡下直接觀察其微循環(huán)[9,10]。本實(shí)驗(yàn)亦是利用該種方法對(duì)痰瘀互結(jié)型AS腸系膜微循環(huán)進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，痰瘀互結(jié)型AS同時(shí)存在著視網(wǎng)膜及腸系膜微循環(huán)的病理變化，包括血液流速減慢、微血管數(shù)量減少、微動(dòng)脈變細(xì)和血液滲出。該病理變化過程大致如下：大劑量VD3腹腔注射加上長(zhǎng)期高脂灌胃導(dǎo)致大鼠微血管鈣化、脂代謝異常，引起血脂升高；高血脂導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化加速，并使血漿黏度增高和血小板聚集，從而使血流阻力增大、血液流速減慢、微血管充盈度下降和痙攣；微血管持續(xù)性痙攣可引起微動(dòng)脈內(nèi)膜深層的脂肪變性和微血管缺血缺氧，導(dǎo)致微動(dòng)脈管徑狹窄或閉塞、血管內(nèi)皮損傷；血管內(nèi)皮損傷使微血管通透性增加，導(dǎo)致血液滲出。

痰瘀互結(jié)型AS大鼠外周微血管存在微循環(huán)障礙，并增加出血風(fēng)險(xiǎn)。微循環(huán)觀察的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可為臨床診療和新藥研發(fā)提供依據(jù)。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

張方申(1989-)，男，漢族，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)與現(xiàn)代中醫(yī)方藥研究

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Microcirculation of the Retina and Mesenteric in Atherosclerosis Rats with Syndrome of Intermin-gled Phlegm and Blood Stasis

ZHANG Fang-shen1,PENG Xin2, #,QIN Lin2,ZHANG Hai-yan2,YAN Bin2,WU Shuang2

1Institute of Technology, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250300,China;2Institute of Basic Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;#

Objective: To observe the retina and mesenteric microcirculation change of atherosclerosis (AS) rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis.Method: There were 40 male Wistar rats,20 of which used the method of VD3 large-dose intraperitoneal injection combined with long-term high-fat emulsion gavage , establishing the model of AS rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis. The rest 20 of them as control group made parallel intraperitoneal injection with physiological water and pure water gavage.Contrasted success model group (AS group,n=16)with control group and analysed retina and mesenteric microcirculation.Compared these two groups in retinal vascular morphology, arteriovenous diameter DO value(DA/DV),mesenteric microvessels,blood flow velocity, and the difference between DA and DV.Results: Intraperitoneal injection of large doses VD3 combined with fat emulsion long-term gavage method successfully builded the model of AS rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis. Compared with control group,AS rats gained weight(t=5.99,P<0.05),total cholesterol levels elevated(t=-13.94,P<0.05),atherosclerosis index(AI) was≥4.0 and retina and mesenteric microcirculation insufficiency appeared, the blood flow velocity slowed down,the number of microvessels reduced,DA/DV significantly reduced (P<0.05) and arterioles became thinner and had blood oozing. Conclusion:The retina and mesenteric microcirculation change of the AS model rats with syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis can provide experimental foundation for clinical diagnosis and drug discovery.

Syndrome of intermin-gled phlegm and blood stasis;Atherosclerosis;Microcirculation;Rats

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013HM053)；山東省教育廳科技計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(J06L19)

1山東中醫(yī)藥大學(xué)理工學(xué)院，濟(jì)南，250300；2山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南，250355；#

，E-mail: qinlin0531@163.com

本文2014-11-25收到，2015-01-04修回

R331.3+5 R255.9

A

1005-1740(2015)01-0010-05